CC BY
27
Ассоциация полиморфизмов генов N0-^^^ и аргиназы, клинико-лабораторных и функциональных показателей с уровнем оксида азота в выдыхаемом воздухе у детей, больных бронхиальной астмой
Б.Ц. Батожаргалова1, С.Э. Дьякова2, Н.В. Петрова3, Ю.Л. Мизерницкий2, Р.А. Зинченко3'4
1ГБУЗ «Морозовская детская городская клиническая больница Департамента здравоохранения города Москвы», Москва, Россия;
2ОСП «Научно-исследовательский клинический институт педиатрии им. академика Ю.Е. Вельтищева» ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Россия; 3ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова», Москва, Россия; 4ФГБНУ «Национальный НИИ общественного здоровья им. Н.А. Семашко», Москва, Россия
Association of polymorphisms of NO synthases and arginase genes, clinical, laboratory and functional indicators with the level of nitrogen oxide in exhaled air in children with bronchial asthma
B.T. Batozhargalova1, S.E. Diakova2, N.V. Petrova3, Yu.L. Mizernitsky2, R.A. Zinchenko3,4
1The Morozov children's city hospital, Moscow, Russia;
2Veltischev Research and Clinical Institute for Pediatrics of the Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia;
3Bochkov Research Center for Medical Genetics, Moscow, Russia;
4N.A. Semashko National Research Institute of Public Health, Moscow, Russia
Представлены результаты исследования ассоциаций генов NO-синтаз и аргиназы у детей с бронхиальной астмой с клини-ко-лабораторными и функциональными показателями в зависимости от уровня оксида азота в выдыхаемом воздухе (FeNO). Обследованы 107 детей с бронхиальной астмой, которых разделили на 2 группы в зависимости от уровня FeNO. В группе больных с повышенным уровнем FeNO (>20 ppb) установлен ряд ассоциаций: носительство аллелей и генотипов, содержащих короткие тандемные повторы S (9—11) гена NOSI(AAT)n, с ранним дебютом и тяжелым течением болезни, повышенным уровнем общего IgE в сыворотке крови; носительство аллелей и генотипов, содержащих длинные тандемные повторы L (12—16) гена NOS2A(CCTTT)n, со среднетяжелым течением болезни, с повышенным уровнем IgE; носительство аллеля *А гена ARGII(rs3742879) со среднетяжелым течением болезни; носительство аллеля *G и гетерозиготного генотипа *AG гена ARGII (rs3742879) с пониженным уровнем ОФВ1/ФЖЕЛ; носительства аллелей L и сочетания генотипов SL и LL гена NOSI(AAT)n с повышенным уровнем эозинофилов в крови (эозинофилией); сочетание генотипов S/L+L/L гена NOSI(AAT)n с грибковой сенсибилизацией. Установлены корреляции между тяжестью заболевания и NOSI(AAT)n; возрастом манифестации заболевания и NOSI(AAT)n; ОФВ1/ФЖЕЛ и ARGII(rs3742879); обратная связь между эозинофилией в крови и NOSI(AAT)n.
В группе больных с низким уровнем FeNO (<20 ppb) также определен ряд ассоциаций: носительство аллелей и генотипов, содержащих короткие тандемные повторы S (9—11) гена NOSI(AAT)n, с грибковой сенсибилизацией; носительство аллелей и генотипов, содержащих длинные тандемные повторы L (12—16) гена NOS2A(CCTTT)n, с пониженным ОФВ1 и ОФВ1/ФЖЕЛ; носительство гомозиготного генотипа *GG гена ARGII(rs3742879) с эпидермальной сенсибилизацией. При пониженном уровне FeNO определена связь между степенью тяжести бронхиальной астмы и NOSI(AAT)n; степенью эффективности противовоспалительной базисной терапии и NOSI(AAT)n; грибковой сенсибилизацией и NOSI(AAT)n; обратная связь между ОФВ1 и NOS2(CCTTT)n; ОФВ1/ФЖЕЛ и NOS2(CCTTT)n.
Ключевые слова: дети, бронхиальная астма, FeNO, полиморфизмы генов NOS1, NOS2, NOS3, ARG1, ARG2.
Для цитирования: Батожаргалова Б.Ц., Дьякова С.Э., Петрова Н.В., Мизерницкий Ю.Л., Зинченко Р.А. Ассоциация полиморфизмов генов NO-синтаз и аргиназы, клинико-лабораторных и функциональных показателей с уровнем оксида азота в выдыхаемом воздухе у детей, больных бронхиальной астмой. Рос вестн перинатол и педиатр 2019; 64:(5): 55-68. DOI: 10.21508/1027-4065-2019-64-5-55-68
The article presents the results of a study of the associations of NO synthase and arginase genes in children with bronchial asthma with clinical, laboratory and functional parameters depending on the level of nitrogen oxide in exhaled air (FeNO). We examined 107 children with bronchial asthma, they were divided into 2 groups depending on the level of FeNO.
We found a number of associations in the group of patients with an elevated level of FeNO (>20 ppb): carriage of alleles and genotypes containing short tandem repeats of S (9—11) NOSI(AAT)n gene, with an early debut and severe course of the disease, an increased level of total IgE in blood serum; carriage of alleles and genotypes containing long tandem repeats L (12—16) of the NOS2A(CCTTT) n gene, with a moderate course of the disease, with an increased level of IgE; carriage of the allele *A of the ARGII gene (rs3742879) with a moderate course of the disease; carriage of the *G allele and heterozygous *Ag genotype of the ARGII gene (rs3742879) with a decreased level of FEV1/FVC; carriage of L alleles and a combination of the SL and LL genotypes of the NOSI(AAT)n gene with elevated blood eosinophils (eosinophilia); a combination of S/L + L/L genotypes of the NOSI(AAT)n gene with fungal sensitization. The authors established the correlations between disease severity and N0SI(AAT)n; the age of the manifestation of the disease and NOSI(AAT)n; FEV1/FVC and ARGII (rs3742879); feedback between blood eosinophilia and NOSI(AAT)n. The authors also determined a number of associations in the group of patients with low level of FeNO (<20 ppb): carriage of alleles and genotypes containing short tandem repeats of S (9—11) gene NOSI(AAT)n, with fungal sensitization; carriage of alleles and genotypes containing long tandem repeats of L (12—16) gene NOS2A(CCTTT)n, with reduced FEV1 and FEV1/FVC; carriage of the homozygous genotype of *GG gene ARGII(rs3742879) with epidermal sensitization. With a reduced level of FeNO, the study
determined a relationship between the severity of bronchial asthma and NOS1(AAT)n; degree of effectiveness of anti-inflammatory basic therapy and NOS1(AAT)n; fungal sensitization and NOS1(AAT)n; feedback between FEV1 and NOS2(CCTTT)n; FEV1/FVC and NOS2(CCTTT)n.
Key words: children, bronchial asthma, FeNO, polymorphisms of genes NOS1, NOS2, NOS3, ARG1, ARG2.
For citation: Batozhargalova B.T., Diakova S.E., Petrova N.V., Mizernitsky Yu.L., Zinchenko R.A. Association of polymorphisms of NO synthases and arginase genes, clinical, laboratory and functional indicators with the level of nitrogen oxide in exhaled air in children with bronchial asthma. Ros Vestn Perinatol i Pediatr 2019; 64:(5): 55-68 (in Russ). DOI: 10.21508/1027-4065-2019-64-5-55-68
Определение уровня оксида азота в выдыхаемом воздухе (FeNO) общепризнано в качестве неинвазивного теста для выявления аллергического воспаления дыхательных путей [1]. Уровень FeNO значительно повышается у детей и взрослых с эозинофильным воспалением дыхательных путей, текущей бронхиальной астмой [1—5]. В то же время у ряда пациентов с бронхиальной астмой повышенный уровень FeNO не определяется [1, 6].
В литературе нам встретилось лишь несколько работ, выявивших ту или иную ассоциацию уровня FeNO с генами оксида азота и аргиназы [6—10]. Однако есть все основания полагать, что исследование у детей с бронхиальной астмой полиморфизма генов ферментов, синтезирующих из L-аргинина оксид азота II (NO), позволит верифицировать аллели и генотипы, определяющие различные особенности течения этого заболевания в зависимости от уровня FeNO.
Цель исследования: сравнительный анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов NOS1, NOS2, NOS3, ARG1, ARG2, клинико-лабораторных и функциональных показателей у детей, больных бронхиальной астмой, с различным уровнем оксида азота в выдыхаемом воздухе (FeNO).
Характеристика детей и методы исследования
Обследовали 107 детей с бронхиальной астмой, проживающих в Москве, госпитализированных в отделение пульмонологии НИКИ педиатрии им. акад.
© Коллектив авторов, 2019
Адрес для корреспонденции: Батожаргалова Баирма Цыдендамбаевна —д.м.н., врач-пульмонолог Морозовской детской городской клинической больницы, ORCID: 0000-0001-8804-2122 119049 Москва, 4-й Добрынинский переулок д. 1/9
Мизерницкий Юрий Леонидович — д.м.н., проф., зав. отделом хронических воспалительных и аллергических болезней легких Научно-исследовательского клинического института педиатрии им. академика Ю.Е. Вель-тищева, рук. Детского научно-практического пульмонологического центра Минздрава РФ, ORCID: 0000-0002-0740-1718 e-mail: [email protected]
Дьякова Светлана Эвальдовна — к.м.н., вед. науч. сотр. отделения хронических воспалительных и аллергических болезней легких Научно-исследовательского клинического института педиатрии им. академика Ю.Е. Вельтищева, ORCID: 0000-0002-3445-4903 125412 Москва, ул. Талдомская, д. 2
Петрова Ника Валентиновна — д.м.н., вед. науч. сотр. лаборатории генетической эпидемиологии Медико-генетического научного центра, ORCID: 0000-0001-5933-6594
Зинченко Рена Абульфазовна — д.м.н., проф., зам. директора по научно-клинической работе, зав. лабораторией генетической эпидемиологии Медико-генетического научного центра, гл. науч. сотр. Национального НИИ общественного здоровья им. Н.А. Семашко, ORCID: 0000-0003-3586-3458 115522 Москва, ул. Москворечье, д. 1
Ю.Е. Вельтищева. Исследование одобрено этическим комитетом и выполнено при информированном согласии детей, подростков и их родителей. Диагноз верифицировали в соответствии с критериями Национальной программы «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика» (2017). Средний возраст обследованных детей составил 12,1±3,1 года.
Больных бронхиальной астмой разделили на 2 группы, исходя из уровня FeNO в выдыхаемом воздухе: 1-я группа — 62 (57,9%) ребенка с FeNO >20 ррЬ (20,5^187 ррЬ), из них у 48 больных уровень FeNO более 35 ррЬ; 2-я группа — 45 (42,1%) больных с FeNO <20 ррЬ (0,7-19,5 ррЬ). В среднем уровень FeNO в выдыхаемом воздухе в 1-й группе составил 66,1±34,8 ррЬ, во 2-й - 8,3±5,1 ррЬ; />=0,0000001 (табл. 1). Уровень FeNO определяли с помощью хеми-люминесцентного анализатора NOBreath. Распределение детей по уровню FeNO проводили до начала терапии ингаляционными глюкокортикостерои-дами (в группе с пониженным FeNO) в соответствии с рекомендациями Американского торакального общества [3].
Проведен сравнительный анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов у больных бронхиальной астмой в зависимости от следующих факторов (см. табл. 1):
- клинических особенностей: степень тяжести бронхиальной астмы, возраст дебюта заболевания, объем необходимой базисной терапии;
- функциональных параметров: данные спирометрии (ОФВ1* ОФВ/ФЖЕЛ**);
- лабораторных параметров: уровень эозинофилов в крови, общего ^Е и специфических ^Е к респираторным аллергенам (клещи Dermаtophаgoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae; эпидермис таракана; пыльца ольхи, березы, лещины, дуба; смесь луговых трав, ржи, полыни, подорожника; эпителий и шерсть кошки, собаки, лошади, морской свинки, хомячка, кролика; грибы РетсШшт поШит, Cladosporium herbarum, AspergiШus fumigatus, АНетапа altemata).
Молекулярно-генетические исследования выполнены в лаборатории генетической эпидемиологии ФГБНУ «МГНЦ». Материалом исследования являлась ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови, стандартным методом фенольно-хло-роформной экстракции. Полимеразную цепную
ОФВ1 — объем форсированного выдоха за 1-ю секунду. ФЖЕЛ — форсированная жизненная емкость легких.
Таблица 1. Характеристика обследованных больных бронхиальной астмой в зависимости от уровня FeNO Table 1. Characteristics of the examined patients with bronchial asthma depending on the level of FeNO
Параметр Уровень FeNO, ppb
>20 <20 р
Число больных 62 (57,9%) 45 (42,1%) 0,029
FeNO, ppb (M±m) min—max 66,1±34,8 20,5-187 8,3±5,1 0,7-19,5 0,0000001
По степени тяжести
легкая 14 (22,6%) 4 (8,9%) >0,05
среднетяжелая 16 (25,8%) 14 (31,1%) >0,05
тяжелая 32 (51,6%) 27 (60,0%) >0,05
Манифестация заболевания
ранняя, до 5 лет 45 (72,6%) 32 (71,1%) >0,05
поздняя, после 5 лет 17 (27,4%) 13 (28,9%)
в среднем, годы 3,69±2,99 3,33±2,32 0,08
Проводимая базисная противовоспалительная терапия
без лечения 19 (30,6%) 4 (8,9%) 0,014
ИГКС 43 (69,4%) 41 (91,1%)
из них
монотерапия 6 7
комбинированная 26 25
таргетная терапия (омализумаб + комбинированные ИГКС с р.-агонистами ДД) 11 9
Показатели функции внешнего дыхания
ЖЕЛ, % 89,58±13,23 89,06±10,94 >0,05
ФЖЕЛ, % 86,47±12,32 87,64±9,73 >0,05
ОФВ1, % 86,89±17,67 86,49±16,67 >0,05
ОФВ/ФЖЕЛ, % 81,11±11,01 80,22±10,99 >0,05
ПСВ, % 87,76±18,83 82,18±18,29 >0,05
МОС25, % 80,32±23,75 74,58±23,59 >0,05
МОС.0, % 72,47±27,43 69,36±27,02 >0,05
МОС75, % 68,63±32,07 61,71±30,67 >0,05
МОС25/75, % 72,02±26,52 67,51±26,28 >0,05
ОФВ1 менее 80% 17 (27,4%) 12 (26,7%) >0,05
ОФВ1 более 80% 45 (72,6%) 33 (73,3%)
Эозинофилия
более 5% 46 (74,2%) 15 (33,3%) 0,006
менее 5% 16 (25,8%) 30 (66,7%)
в среднем, % 6,8±3,4 4,4±4,0 0,001
Общий IgE в крови
более 100 МЕ 59 (95,2%) 28 (62,2%) 0,00006
менее 100 МЕ 3 (4,8%) 17 (37,8%)
в среднем 637,7±426,7 344,2±372,6 0,0003
Сенсибилизация
выявлена/нет 59/1 28/13
Примечание. FeNO — уровень выдыхаемого оксида азота; ИГКС — ингаляционные глюкокортикостероиды; ДД — (препараты) длительного действия; ЖЕЛ — жизненная емкость легких; ФЖЕЛ — форсированная жизненная емкость легких; ОФВ1 — объем форсированного выдоха за 1-ю секунду; ПСВ — пиковая скорость выдоха; МОС — максимальная объемная скорость (выдоха); МОС50 — МОС выдоха на уровне 50% ФЖЕЛ; МОС^ - МОС выдоха на уровне 25% ФЖЕЛ, МОС25-75 - средняя МОС выдоха на уровне 25-75% ФЖЕЛ.
Note. FeNO — level of exhaled nitric oxide; ИГКС — inhaled glucocorticosteroids; ДД — (drugs) long-acting; ФЖЕЛ — vital capacity of the lungs; FZHEL — forced vital capacity of the lungs; ОФВ1 — forced expiratory volume in 1 second; ПСВ — peak expiratory flow rate; МОС — maximum space velocity (expiration); МОС50 — МОС of exhalation at the level of 50% ФЖЕЛ; МОС25 — МОС of exhalation at the level of 25% ФЖЕЛ,
МОС25—75 — average МОС of exhalation at the level of 25—75% ФЖЕЛ.
реакцию (ПЦР) ДНК проводили на амплификаторе фирмы «ДНК-технология» (Россия). Для определения нуклеотидных замен осуществляли гидролиз амплифицированных фрагментов соответствующими рестриктазами. Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции выполняли при помощи электрофореза в 8% полиакриламидном геле («Helicon»). Идентификацию фрагментов ДНК проводили с помощью окрашивания геля раствором бромистого этидия (5 мкг/л) с последующей визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете и использованием системы фотодокументации Vilber Lourmat (Франция). Изучение полиморфизма генов осуществляли методом ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием праймеров для генотипи-рования:
NOS1 (ATT)n F5'-CTGGGGGCAATGGTGTGT-3' и R5'-GAGTAAAATTAAGGGTCAGC-3';
NOS2 (CCTTT)n F5'-ACCCCTGGAAGCCTACAACTGCAT-3' и R5'-GCCACTGCACCCTAGCCTGTCTCA-3';
NOS3 (VNTR) F5'-AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT-3' и R5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3';
ARG1 (rs2781667) F5'-AAGGATTTTAATGGATTTATGAAGC-3' и R5'-CAAATGCAGTTTGGGCCTCT-3';
ARG2(rs3742879) F5'-GCCACTTTCTCTGCCTGACA-3' и R5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3'.
Для каждого из изучаемых ДНК-маркеров проводили оценку соответствия распределения генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайн-берга. В целях сравнения распределений частот аллелей и генотипов в выборках больных использовали критерий х2. Силу ассоциаций оценивали по отношению шансов (odds ratio — OR) с указанием 95% доверительного интервала (ДИ). Для расчетов использовали программу «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях случай—контроль» (http://test.tapotili.ru/calculator_or.php), Statistica 7. Оценку взаимосвязи между исследуемыми показателями выполняли методом ранговой корреляции по Спирмену. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
Результаты
На первом этапе мы определили наличие ассоциаций исследуемых генов NOS1(AAT)n, NOS2(CCTTT)n, NOS3(VNTR), ARG1(rs2781667), ARG2 (rs3742879) с уровнем FeNO в выдыхаемом воздухе у больных бронхиальной астмой. Повышенный уровень FeNO >20 ppb у больных был ассоциирован с аллелями (0,758 и 0,578; р=0,005; OR 2,29, 95% ДИ 1,3—4,1) и генотипами (0,613 и 0,311; р=0,008; OR 3,51, 95% ДИ 1,6—7,9), содержащими короткие тандемные
повторы S и SS соответственно гена N081 (AAT)n (и=9-11). При рассмотрении каждого аллеля и генотипа гена NOS1(AAT)n в отдельности у больных была выявлена статистически значимая ассоциация с повышенным уровнем FeNO (>20 ррЬ) аллеля *10 (0,710 и 0,511; р=0,003; OR 2,34, 95% ДИ 1,3-4,1) и генотипа *10/*10 (0,548 и 0,244; />=0,002; OR 3,75, 95% ДИ 1,6-8,7). Напротив, у больных бронхиальной астмой аллель *12 гена NOS1(AAT)n был ассоциирован с пониженным уровнем FeNO <20 ррЬ (0,222 против 0,081; р=0,003; OR =3,26, 95% ДИ 1,4-7,4) (табл. 2).
Нами установлена ассоциация аллелей и генотипов, содержащих «длинные» тандемные повторы L гена Ш82А (ССТТТ)п (и=12-16) у больных бронхиальной астмой с повышенным уровнем FeNO в выдыхаемом воздухе >20 ррЬ (частота аллелей L гена NOS2А 0,750 в сравнении с короткими аллелями S 0,589; р=0,01; OR 2,09, 95% ДИ 1,2-3,8). Отношение шансов для носителей генотипа LL гена NOS2А (ССТТТ)п составило 2,35 (95% ДИ 1,1-5,2; р=0,03; см. табл. 2). В то же время у больных мы не выявили ассоциацию уровня FeNO с генами N083(VNTR), ШОП ге3742879, АКО1 ге2781667 (р>0,05).
Затем мы рассмотрели ассоциацию клинических особенностей бронхиальной астмы (степень тяжести, объем проводимой противовоспалительной базисной терапии, возраст дебюта заболевания) с исследуемыми генами N081, N082, N083, АКО1, ШОП в зависимости от уровня FeNO. По степени тяжести заболевания в зависимости от уровня FeNO больные не различались (р>0,05). У 84 (78,5%) подростков бронхиальная астма сочеталась с аллергическим ринитом, у 16 (15,0%) - с аллергическим ринитом в сочетании с атопическим дерматитом. Наследственный анамнез был отягощен по бронхиальной астме у 48 (44,9%) пациентов, по другим атопическим заболеваниям - у 18 (16,8%).
У больных тяжелой бронхиальной астмой нами определена ассоциация с повышенным уровнем FeNO (> 20 ррЬ) аллелей, содержащих короткие тандемные повторы S (9-11) гена N081^^ (0,844 и 0,648; р=0,01; OR 2,93, 95% ДИ 1,2-7,0) и генотипов SS (0,750 и 0,407; р=0,03; OR 4,36, 95% ДИ 1,4-13,2). Установлена более высокая частота аллеля *10 и гомозиготного генотипа *10/*10 гена N0S1(AAT)n у больных тяжелой бронхиальной астмой с повышенным уровнем FeNO (р=0,009 и р=0,014 соответственно; табл. 3).
У больных бронхиальной астмой средней степени тяжести выявлена ассоциация повышенного уровня FeNO (>20 ррЬ) с аллелями и генотипами, содержащими длинные тандемные повторы L (12-16) гена Ж>82А(ССТТТ)п (0,844 и 0,607; р=0,04; OR 3,49, 95% ДИ 1,03-11,8) и аллелем *А полиморфизма ге3742879 гена АКОИ (0,688 и 0,429; р=0,04; OR 2,93, 95% ДИ 1,02-8,5; см. табл. 3).
Таблица 2. Ассоциация частот аллелей и генотипов генов NOS/(AAT)n), NOS2A(CCTTT)n с уровнем FeNO и ОФВ1 у детей, больных бронхиальной астмой
Table 2. Association of frequencies of alleles and genotypes of NOS1 (AAT)n, NOS2A(CCTTT)n genes with the level of FeNO and FEV1 in children with bronchial asthma
Аллели, генотипы n (%) NO >20 ppb (n=62) NO <20 ppb (n=45) X2 P OR (95% ДИ)
Ассоциация генов NOSI(AAT)n, NOS2A(CCTTT)n с уровнем FeNO
NOSI(AAT)n
Аллели n=124 n=90
S 9—11 повторов 94 (0,758) 52 (0,578) 7,82 2,29 (1,3-4,1)
L 12—15 повторов 30 (0,242) 38 (0,422) p=0,005 0,44 (0,2-0,8)
*10 88 (0,710) 46 (0,511) 8,78 р=0,003 2,34 (1,3-4,1)
*12 10 (0,081) 20 (0,222) 8,67 р=0,003 3,26 (1,4-7,4)
Генотипы n=62 n=45
SS 38 (0,613) 14 (0,311) 9,55 p=0,008 3,51 (1,6-7,9)
SL 18 (0,290) 24 (0,533) 0,36 (0,2-0,8)
LL 6 (0,097) 7 (0,156) 0,58 (0,2-1,9)
*10/*10 34 (0,548) 11 (0,244) 9,89 p=0,002 3,75 (1,6-8,7)
HWE (х2; р) 2,7; p>0,05 0,39; p>0,05
NOS2A(CCTTT)n
Аллели n=124 n=90
S 9—11 повторов 31 (0,250) 37 (0,411) 6,24 0,48 (0,3-0,9)
L 12—16 повторов 93 (0,750) 53 (0,589) p=0,01 2,09 (1,2-3,8)
Генотипы n=62 n=45
SS+ SL 27 (0,435) 29 (0,644) 4,56 0,43 (0,2-0,9)
LL 35 (0,565) 16 (0,356) p=0,03 2,35 (1,1-5,2)
HWE (х2; р) 0,01; p>0,05 0,06; p>0,05
Ассоциация гена ARGII (rs3742879)n с ОФВ1/ФЖЕЛ при повышенным уровне FeNO (<20 ppb)
ARGII (rs3742879)
Аллели n=46 n=78
A 23 (0,500) 56 (0,718) 5,94 0,39 (0,18-0,8)
G 23 (0,500) 22 (0,282) р=0,01 2,55 (1,2-5,4)
Генотипы n=23 n=39
AA 4(0,174) 22 (0,564) 0,16 (0,05-0,6)
AG 15 (0,652) 12 (0,308) 9,40 p=0,009 4,22 (1,4-12,6)
GG 4(0,174) 5(0,128) 1,43 (0,34-6,0)
HWE (x2; р) 2,13; p>0,05 2,25; p>0,05
Ассоциация гена NOS2A(CCTTT)n с ОФВ1, ОФВ1/ФЖЕЛ при пониженном уровне FeNO (<20 ppb)
NOS2A(CCTTT)n
ОФВ1 <81% ОФВ1 >81%
Аллели n=30 n=60
S 9—11 повторов 5 (0,167) 32 (0,533) 11,11 0,18 (0,06-0,5)
L 12—16 повторов 25 (0,833) 28 (0,467) p=0,0009 5,71 (1,9-16,9)
Окончание таблицы 2.
*11 2 (0,067) 19 (0,317) p=0,006 0,16 (0,02-0,6)
*13 9 (0,300) 7 (0,117) p=0,034 3,20 (1,04-10,2)
Генотипы n=15 n=30
SS 1 (0,067) 7 (0,233) 0,23 (0,03-2,1)
SL 3 (0,200) 18 (0,600) 14,02 р=0,0009 0,17 (0,04-0,7)
LL 11 (0,733) 5 (0,167) 13,75 (3,1-61,2)
HWE (х2, р) 1,18; p>0,05 1,27; p>0,05
NOS2A(CCTTT)n
ОФВ1/ФЖЕЛ <80% ОФВ1/ФЖЕЛ <80%
Аллели n=48 n=42
S 9—11 повторов 14 (0,292) 23 (0,548) 6,06 0,34 (0,14-0,8)
L 12—16 повторов 34 (0,708) 19 (0,452) p=0,01 2,94 (1,2-7,0)
*11 7 (0,146) 14 (0,333) p=0,032 0,35 (0,12-0,96)
*13 13 (0,271) 3 (0,071) p=0,012 4,75 (1,32-22,3)
Генотипы n=24 n=21
SS+ SL 12 (0,500) 17 (0,810) 4,68 0,24 (0,06-0,9)
LL 12 (0,500) 4 (0,190) р=0,03 4,25 (1,1-16,4)
HWE (х2; р) 0,00; p>0,05 0,07; p>0,05
Примечание. FeNO — уровень выдыхаемого оксида азота; ФЖЕЛ — форсированная жизненная емкость легких; ОФВ1 — объем форсированного выдоха за 1-ю секунду; HWE — равновесие Харди—Вайнберга; OR — отношение шансов; ДИ — доверительный интервал. Note. FeNO — level of exhaled nitric oxide; ФЖЕЛ — forced vital capacity of the lungs; ОФВ1 — forced expiratory volume in 1st second; HWE — Hardy—Weinberg equilibrium; OR — odds ratio; ДИ — confidence interval
На момент включения в исследование базисную противовоспалительную терапию ингаляционными глюкокортикостероидами (ИГКС) получали 84 больных, из них комбинированные ИГКС с Р2-а-гонистами длительного действия — 51, монотерапию ИГКС — 13; 20 больным с тяжелой неконтролируемой бронхиальной астмой назначена V ступень лечения — сочетание комбинированных ИГКС и Р2-агонистов длительного действия с омализу-мабом (таргетная терапия); не получали базисную терапию ИГКС до госпитализации 23 больных. В зависимости от уровня FeNO в выдыхаемом воздухе и базисной терапии пациентов разделили следующим образом: с пониженным FeNO — 41 (91,1%) больной и с повышенным уровнем FeNO — 43 (69,4%) больных (р=0,014).
Статистически значимых ассоциаций исследуемых генов NOS2, NOS3, ЛБО1, ЛБОП с проводимой базисной противовоспалительной терапией ИГКС у больных с разным уровнем FeNO не установлено. У больных с пониженным уровнем FeNO определена тенденция к ассоциации проводимой базисной терапии с аллелями, содержащими короткие тандемные повторы S гена Ж№1(ААТ)п (0,610 и 0,250; р=0,05).
Бронхиальная астма манифестировала в возрасте младше 5 лет у 77 (72%) больных (до 1 года — у 2 больных; с 1 года до 2 лет — у 27), что чаще, чем в возрасте старше 5 лет, — у 30 (28%) больных; р<0,0000001.
В среднем возраст появления первых симптомов составил 3,5±2,7 года. По возрасту манифестации заболевания больные с различным уровнем FeNO статистически значимо не различались.
Раннее начало бронхиальной астмы до 5 лет у детей с повышенным уровнем FeNO (<20 ррЬ) было ассоциировано с «короткими» аллелями и генотипами гена NOS1(AAT)n (частота аллелей S 0,833 и 0,559; р=0,001; OR 3,95; 95% ДИ 1,7-9,5). Отношение шансов для носителей генотипа SS гена Ж№1(ЛАТ)п составило 6,6 (95% ДИ 1,9-22,7; р=0,007). У больных с повышенным уровнем FeNO выявлена более высокая частота ассоциации аллеля *10 и генотипа *10/*10 гена NOS1 с ранним дебютом бронхиальной астмы по сравнению с поздним (0,789 против 0,500; р=0,003; OR 3,74, 95% ДИ 1,6-8,7) и (0,667 против 0,235; р=0,006; OR 6,5, 95% ДИ 1,8-23,4) соответственно. Гетерозиготный генотип *10/*12 гена NOS1(ЛAT)n чаще определялся у больных с поздним дебютом бронхиальной астмы (0,294 против 0,022; р=0,006; см. табл. 3).
Следующим этапом мы определили ассоциацию частот исследуемых генов с ОФВ1 и ОФВ1/ФЖЕЛ по данным спирометрии. При исследовании функции внешнего дыхания не выявлено достоверных различий в двух исследуемых группах в зависимости от уровня FeNO (р>0,05). Проба с бронхолитиком выполнена у 76 больных, из них положительная опре-
Таблица 3. Ассоциация частот аллелей и генотипов гена NOS1 (AAT)n, NOS2A(CCTTT)n и ARGII (rs3742879) со степенью тяжести бронхиальной астмы, возрастом ее манифестации и уровнем FeNO
Table 3. Association of allele frequencies and genotypes of the NOS1 (AAT) n, NOS2A (CCTTT) n and ARGII (rs3742879) gene with the severity of bronchial asthma, the age of its manifestation and the level of FeNO
Аллели, генотипы n (%) NO >20 ppb NO <20 ppb X2 P OR (95% ДИ)
Тяжелая бронхиальная астма
NOS1(AAT)n
Аллели n=64 n=54
S 9—11 повторов 54 (0,844) 35 (0,648) 6,05 2,93 (1,2-7,0)
L 12—15 повторов 10 (0,156) 19 (0,352) p=0,01 0,34 (0,1-0,8)
*10 51 (0,797) 30 (0,556) 6,84 p=0,009 3,13 (1,4-7,1)
Генотипы n=32 n=27
SS 24 (0,750) 11 (0,407) 4,36 (1,4-13,2)
SL 6 (0,188) 13 (0,481) 7,24 p=0,03 0,25 (0,08-0,8)
LL 2 (0,063) 3 (0,111) 0,53 (0,08-3,5)
*10/*10 22 (0,688) 9 (0,333) 6,02 p=0,014 4,4 (1,5-13,2)
HWE (х2; р) 2,67; p>0,05 0,08; p>0,05
Среднетяжелая бронхиальная астма
NOS2A(CCTTT)n
Аллели n=32 n=28
S 9—11 повторов 5 (0,156) 11 (0,393) 4,28 0,29 (0,08-0,97)
L 12—16 повторов 27 (0,844) 17 (0,607) p=0,04 3,49 (1,03-11,8)
Генотипы n=16 (n=14
SS+ SL 4 (0,250) 9 (0,643) 4,69 0,19 (0,04-0,9)
LL 12 (0,750) 5 (0,357) р=0,03 5,40 (1,1-26,1)
HWE (х2; р) 1,34; p>0,05 0,03; p>0,05
ARGII (rs3742879)
Аллели n=32 n=28
A 22 (0,688) 12 (0,429) 4,08 2,93 (1,02-8,5)
G 10 (0,313) 16 (0,571) р=0,04 0,34 (0,1-0,98)
Генотипы n=16 n=14
AA 7 (0,438) 3(0,214) 4,44 p>0,05
AG 8 (0,500) 6 (0,429)
GG 1 (0,063) 5 (0,357)
HWE (х2; р) 0,43; p>0,05 0,22; p>0,05
Ассоциация гена ЖОЛ/(ААТп с повышенным уровнем FeNO (N0 >20 ррЬ) и возрастом манифестации бронхиальной астмы
ЖО£/(ААТ)п
Аллели, генотипы n (%) Возраст манифестации, годы X2 p
младше 5 n=45 старше 5 n=17 OR (95% ДИ)
Аллели n=90 n=34
S 9—11 повторов 75 (0,833) 19 (0,559) 10,14 3,95 (1,7-9,5)
L 12—15 повторов 15 (0,167) 15 (0,441) p=0,001 0,25 (0,1-0,6)
Окончание таблицы 3.
*10 71 (0,789) 17 (0,500) 8,64 p=0,003 3,74 (1,6-8,7)
Генотипы n=45 n=17
SS 33 (0,733) 5 (0,294) 10,03 р=0,007 6,60 (1,9-22,7)
SL 9 (0,167) 9 (0,529) 0,22 (0,07-0,7)
LL 3 (0,750) 3 (0,176) 0,33 (0,06-1,8)
*10/*10 30 (0,667) 4 (0,235) 7,61 p=0,006 6,50 (1,8-23,4)
*10/*12 1 (0,022) 5 (0,294) 7,56 p=0,006 18,33 (1,95-172,2)
HWE (х2; р) 3,53; p>0,05 0,09; p>0,05
Примечание. FeNO — уровень выдыхаемого оксида азота; HWE — равновесие Харди—Вайнберга; OR — отношение шансов; ДИ — доверительный интервал.
Note. FeNO — level of exhaled nitric oxide; HWE — Hardy—Weinberg equilibrium; OR — odds ratio; ДИ — confidence interval.
делена у 44, сомнительная — у 28, отрицательная -у 4. Проба с физической нагрузкой (бег на тредмилле) выполнена у 17 пациентов, из них положительная — у 8, сомнительная — у 1, отрицательная — у 8.
У детей с повышенным уровнем FeNO определена ассоциация показателя ОФВ1/ФЖЕЛ <80% с аллелем *G гена А^!Дге3742879) (0,500 против 0,282; р=0,01; OR 2,55, 95% ДИ 1,2—5,4) и гетерозиготным генотипом *AG гена ARGII(rs3742879) (0,652 против 0,308; р=0,009; OR 4,2, 95% ДИ 1,4—12,6) соответственно (см. табл. 2).
У больных бронхиальной астмой с низким уровнем FeNO нами установлена ассоциация ОФВ1 <81% с частотой аллелей L с «длинными» тандем-ными повторами гена Ж№2Л(ССТТТ)п (0,833 и 0,467; ^=0,0009; OR 5,0, 95% ДИ 1,9—16,9) и генотипов, содержащих длинные тандемные повторы L гена Ж«2Л(ССТТТ)п (0,733 и 0,167; ^=0,0009; OR 13,75, 95% ДИ 3,1—61,2), и аллелем *13 (р=0,034); а также ОФВ1/ФЖЕЛ <80% с аллелями L и генотипами, содержащими «длинные» тандемные повторы гена Ж«2Л(ССПТ)п (0,708 против 0,452; р=0,01; OR 2,94, 95% ДИ 1,2—7,0) и (0,500 против 0,190; р=0,03; OR 4,25, 95% ДИ 1,1—16,4), и аллелем *13 (р=0,012) соответственно (см. табл. 2).
После этого мы определили ассоциации исследуемых генов с лабораторными показателями (уровнем эозинофилов и общего ^Е в крови, наличием сенсибилизации). В общем анализе крови наблюдалась эози-нофилия 5% и более у 61 (57%) больного бронхиальной астмой. Уровень ^Е в крови более 100 МЕ/мл отмечен у 97 (90,7%) пациентов, из них более 1000 МЕ/мл — у 16. По результатам определения специфических ^Е, выполненного у 101 больного бронхиальной астмой, изолированная бытовая сенсибилизация выявлена у 4, эпидермальная — у 11, пыльцевая — у 5, поливалентная сенсибилизация — у 66 (71,0%).
У больных с повышенным уровнем FeNO нами установлена ассоциация эозинофилии более 5% с аллелями, содержащими длинные тандемные
повторы LL (12—16) гена Ж№1(ААТ)п (0,304 и 0,063; р=0,006; OR 6,6, 95% ДИ 1,5—29,4); с сочетанием генотипов SL+LL, содержащих длинные тандемные повторы гена Ж«7(ААТ)п (0,478 и 0,125; р=0,01; OR 6,4, 95% ДИ 1,3—31,5). Аллель *10 гена ЖШ(ААТ)п (0,641 и 0,906; р=0,009; OR 0,19, 95% ДИ 0,05—0,7) и генотип *10/*10 гена Ж№1(ААТ)п (0,457 и 0,813; р=0,01, OR 0,19, 95% ДИ 0,05—0,8) ассоциировались с протективным эффектом и встречались чаще при нормальном уровне эозинофилов в крови (табл. 4).
У больных с повышенным содержанием ^Е в крови нами определена ассоциация повышенного уровня FeNO более 20 ррЬ с генами ЖШ(ААТ)п и NOS2Л(CCTTT)n. Так, частота аллелей, содержащих короткие тандемные повторы S гена NOS1(AAT)n у этих пациентов составила 0,746, что статистически значимо выше, чем у больных с уровнем FeNO менее 20 ррЬ (0,589; р=0,04; ОR 2,04, 95% ДИ 1,04—4,0); частота генотипов SS гена NOS1(AAT)n также оказалась выше у больных с уровнем FeNO более 20 ррЬ (0,593 против 0,357; р=0,04; OR 2,63, 95% ДИ 1,03—6,7). Соответственно аллель *10 и генотип *10/*10 гена NOS1(AAT)n встречались чаще у пациентов с повышенным уровнем FeNO (р=0,022 и р=0,042; см. табл. 4).
У больных с повышенным содержанием ^Е в крови нами определена ассоциация повышенного уровня FeNO с аллелями, содержащими длинные тандемные повторы L гена ЖЙ2Л(ССТТТ)п (0,746 против 0,554; р=0,01; OR 2,37, 95% ДИ 1,2—4,6), и генотипами, содержащими длинные тандемные повторы LL гена Ж№2Л(ССТТТ)п (0,559 против 0,321; р=0,04; OR 2,68, 95% ДИ 1,04—6,9), а также с частотой аллеля *12 (р=0,036). Аллель *11 встречался чаще у больных с пониженным FeNO (р=0,038; см. табл. 4).
Далее мы определили наличие достоверных ассоциаций грибковой и эпидермальной сенсибилизации у больных бронхиальной астмой. У пациентов с повышенным уровнем FeNO нами установлена
Таблица 4. Ассоциация частот аллелей и генотипов гена NOS1 (AAT)n, NOS2A(CCTTT)n, ARGII (rs3742879) с уровнем эозинофилов и общего IgE в крови, с наличием грибковой и эпидермальной сенсибилизации и уровнем FeNO у больных бронхиальной астмой
Table 4. Association of allele frequencies and genotypes of the NOS1(AAT) n, NOS2A(CCTTT) n, ARGII(rs3742879) gene with the level of eosinophils in the blood, the level of total IgE in the blood, the presence of fungal and epidermal sensitization and the level of FeNO in patients with bronchial asthma
NO >20 ppb
Аллели, генотипы n (%) Содержание эозинофилов Х2 P OR (95% ДИ)
> 5% (n=46) < 5% (n=16)
Ассоциация частот аллелей и генотипов с уровнем эозинофилии при повышенном уровне FeNO
NOS1{kAT)n
Аллели n=92 n=32
S 9—11 повторов 64 (0,696) 30 (0,938) 7,57 0,15 (0,03-0,7)
L 12—15 повторов 28 (0,304) 2 (0,063) p=0,006 6,56 (1,5-29,4)
*10 59 (0,641) 29 (0,906) p=0,009 0,19 (0,05-0,7)
Генотипы n=46 n=16
SS 24 (0,522) 14 (0,875) 6,24 0,16 (0,03-0,8)
SL + LL 22 (0,478) 2(0,125) p=0,01 6,42 (1,3-31,5)
*10/*10 21 (0,457) 13 (0,813) p=0,03 0,19 (0,05-0,8)
HWE (х2; р) 1,47; p>0,05 0,07; p>0,05
Ассоциация частот аллелей и генотипов с уровнем FeNO при повышенном уровне общего IgE в крови
Аллели, генотипы Общий IgE более 100 МЕ/мл X, OR (95% ДИ)
n (%) FeNO >20 ppb FeNO >20 ppb p
NOS1(AAT)n
Аллели n=118 n=56
S 9—11 повторов 88 (0,746) 33 (0,589) 4,39 2,04 (1,04-4,0)
L 12—15 повторов 30 (0,254) 23 (0,411) p=0,04 0,49 (0,25-0,96)
*10 84 (0,712) 30 (0,536) р=0,022 2,13 (1,1-4,1)
Генотипы n=59 n=28
SS 35 (0,593) 10 (0,357) 4,24 2,63 (1,03-6,7)
SL + LL 24 (0,407) 18 (0,643) p=0,04 0,38 (0,15-0,97)
*10/*10 32 (0,542) 8 (0,286) p=0,042 2,93(1,1-8,1)
HWE (х2; р) 2,25; p>0,05 0,05; p>0,05
NOS2A(CCTTT)n
Аллели n=118 n=56
S 9—11 повторов 30 (0,254) 25 (0,446) 6,49 0,42 (0,22-0,8)
L 12—16 повторов 88 (0,746) 31 (0,554) p=0,01 2,37 (1,2-4,6)
*11 18 (0,152) 15 (0,268) р=0,038 0,38(0,15-0,98)
*12 43 (0,364) 14 (0,250) р=0,036 2,66 (1,03-6,93)
Генотипы n=59 n=28
SS + SL 26 (0,441) 19 (0,679) 4,30 0,37 (0,15-0,96)
LL 33 (0,559) 9(0,321) p=0,04 2,68 (1,04-6,9)
HWE (x2; р) 0,02; p>0,05 0,10; p>0,05
Продолжение таблицы 4.
Ассоциации аллелей и генотипов с наличием грибковой и эпидермальной сенсибилизации у больных с повышенным уровнем FeNO
Грибковая сенсибилизация
АШ7(АА1>
грибковая (+) (п=28) грибковая (—) (п=32) х2 Р OR (95% ДИ)
Аллели п=56 п=64
S 9—11 повторов 38 (0,679) 52 (0,813) 2,86
L 12—15 повторов 18 (0,321) 12 (0,188) р=0,09
Генотипы п=28 п=32
SS 13 (0,464) 23 (0,719) 4,03 0,12 (0,1-0,99)
SL+LL 15 (0,536) 9 (0,281) р=0,04 2,95 (1,01-8,6)
HWE (х2, р) 0,01; р>0,05 4,73; р=0,03
Эпидермальная сенсибилизация
NOS2A(CCTTT)n
эпидермальная (+) (п=40) эпидермальная (—) (п=20)
Аллели п=80 п=40
S 9—11 повторов 17 (0,213) 12 (0,300) 1,11
L 12—16 повторов 63 (0,788) 28 (0,700) р>0,05
Генотипы (п=40) (п=20)
SS+ SL 13 (0,325) 12 (0,600) 4,15 0,32 (0,11-0,98)
LL 27 (0,675) 8 (0,400) р=0,04 3,12 (1,02-9,5)
HWE (х2, р) 4,30; р=0,04 3,67; р>0,05
Ассоциации аллелей и генов с наличием грибковой и эпидермальной сенсибилизации у больных с пониженным уровнем FeNO
Грибковая
грибковая (+) (п=15) грибковая (—) (п=26) х2 Р OR (95% ДИ)
Аллели п=30 п=52
S 9—11 повторов 22 (0,733) 24 (0,462) 5,71 3,21 (1,2-8,5)
L 12—15 повторов 8 (0,267) 28 (0,538) р=0,02 0,31 (0,12-0,8)
*10 20 (0,667) 20 (0,385) р=0,026 3,15(1,2-8,4)
Генотипы п=15 п=26
SS 9 (0,600) 3 (0,115) 10,79 11,50 (2,4-56,2)
SL+ LL 6 (0,400) 15 (0,885) р=0,001 0,09 (0,02-0,42)
HWE (х2; р) 1,52; р>0,05 4,01; р=0,05
Эпидермальная
АМСН (rs3742879)
эпидермальная (+) (п=14) эпидермальная (—) (п=27)
Аллели п=28 п=54
Окончание таблицы 4.
A 13 (0,464) 27 (0,667) 3,14
G 15 (0,536) 11 (0,333) p=0,08
Генотипы n=14 n=27
AA+AG 9 (0,643) 25 (0,926) 5,22 0,14 (0,02-0,88)
GG 5 (0,357) 2(0,074) p=0,02 6,94 (1,1-42,4)
HWE (х2; р) 1,11; p>0,05 0,75; p>0,05
Примечание. Примечание. FeNO — уровень выдыхаемого оксида азота; HWE — равновесие Харди—Вайнберга; OR — отношение шансов; ДИ — доверительный интервал.
Note. FeNO — level of exhaled nitric oxide; HWE — Hardy—Weinberg equilibrium; OR — odds ratio; ДИ — confidence interval.
ассоциация генотипов S/L и L/L гена NOS1 (AAT)n с наличием грибковой сенсибилизации (0,536 и 0,281; /=0,04; OR 2,95, 95% ДИ 1,01-8,6), а также аллелей, содержащих длинные тандемные повторы LL гена NOS2A(CCTTT)n, с наличием эпидер-мальной сенсибилизации (0,675 и 0,281; р=0,04; OR 3,12, 95% ДИ 1,02-9,5).
У больных бронхиальной астмой с пониженным FeNO нами определена ассоциация аллелей и генотипов, содержащих короткие тандемные повторы SS гена NOS1(AAT)n с наличием грибковой сенсибилизации (0,733 против 0,462; р=0,02; OR 3,21, 95% ДИ 1,21-8,51 и 0,600 против 0,115; р=0,001; OR 11,50, 95% ДИ 2,4-56,2 соответственно); при этом также отмечена более высокая частота аллеля *10 гена NOS1(AAT)n (р=0,026). У них же выявлена ассоциация эпидермальной сенсибилизации и гомозиготного генотипа *GG полиморфизма rs3742879 гена ARGII (0,357 против 0,074; р=0,02; OR 6,94, 95% ДИ 1,1-42,4) соответственно.
Следующим этапом исследования мы определили статистически значимые корреляции в зависимости от уровня FeNO. При повышенном уровне FeNO выявлены следующие взаимосвязи: между тяжестью заболевания и NOS1(AAT)n (r=0,28; р=0,02), возрастом его манифестации и NOS1(AAT)n (r=0,30; р=0,02); ОФВ1/ФЖЕЛ и ARGII(rs3742879) (r=0,33; р=0,009); обратная связь между эозинофилией в крови и NOS1(AAT)n (r=-0,32; р=0,01). При пониженном уровне FeNO: между степенью тяжести заболевания и NOS1(AAT)n (r=0,30; р=0,04), эффективностью противовоспалительной базисной терапии и NOS1(AAT)n (r=0,33; р=0,03), грибковой сенсибилизацией и NOS1(AAT)n (r=0,41; р=0,0008); обратная связь между ОФВ1 и NOS2(CCTTT)n (r=-0,51; р=0,0004); ОФВ1/ФЖ1 ЕЛ и NOS2(CCTTT)n (r=-0,36; р=0,015). 1
Обсуждение
В результате исследования выявлена ассоциация трех полиморфизмов генов NOS1, NOS2 и ARGII у больных бронхиальной астмой с уровнем FeNO и клинико-лабораторными и инструментальными показателями.
Известно, что нейрональная синтаза оксида азота (NOS1) локализуется в холинергических нервах дыхательных путей и опосредует ингибиру-ющее воздействие неадренергической нехолинер-гической нейронной бронходилатации (iNANC), действуя как функциональный антагонист котранс-миттера ацетилхолина [3]. NOS1 также экспрес-сируется в эпителиальных клетках и пневмоцитах I типа. Известно, что NOS1 может способствовать увеличению выработки периферического оксида азота при тяжелой астме [11]. Индуцибельная NOS (NOS2) индуцируется провоспалительными цитоки-нами при воспалении дыхательных путей и экспрес-сируется в основном в макрофагах и эпителиальных клетках [12]. Известно также, что уровень FeNO снижается при применении у больных бронхиальной астмой ИГКС [1-5].
Обе изоформы аргиназы (кодируемые генами ARG1 и ARG2) экспрессируются в эпителии дыхательных путей, гладких мышцах, перибронхиальной и периваскулярной соединительной ткани [13, 14]. Аргиназа ослабляет ингибирующую неадренергиче-скую нехолинергическую нервно-опосредованную релаксацию гладких мышц дыхательных путей (iNANC) за счет снижения (ингибирования) выработки оксида азота, что обусловлено конкуренцией с нейрональной NO-синтазой (nNOS) за общий субстрат — L-аргинин. Повышенная активность аргиназы после ранней астматической реакции ухудшает воздействие iNANC и опосредованное ею расслабление гладких мышц дыхательных путей, вызывая дефицит оксида азота, производимого с участием nNOS [13]. Повышенная активность аргиназы в дыхательных путях способствует развитию аллергениндуцированной гиперреактивности дыхательных путей за счет ограничения биодоступности L-аргинина в отношении изоферментов cNOS и iNOS, что приводит к дефициту бронхолитического оксида азота и увеличению образования проконтрак-тивного и провоспалительного пероксинитрита.
Полученные нами результаты согласуются с данными M.E. Wechsler и соавт. (2000), выявивших у американских взрослых пациентов с легкой бронхиальной астмой ассоциацию аллелей с корот-
кими повторами S <12 в интроне ААТп гена N081 с высоким уровнем FeNO (16,6±10,1 ррЬ), тогда как аллели с длинными повторами Ь >12 этого полиморфизма были связаны с более низким уровнем FeNO (10,8±3,6 ррЬ; р=0,00008). Не установлено достоверных различий в зависимости от уровня ОФВ1 (р=0,23). Около 25% больных бронхиальной астмой с низким уровнем FeNO имели два аллеля длинных тандемных повтора N081. Исследователи предположили, что у больных этой когорты отсутствует часть неврогенного механизма, отвечающего за фенотип астмы у других пациентов [6].
У китайских детей в возрасте от 5 до 18 лет с бронхиальной астмой (п=295) обнаружена ассоциация полиморфизма гена М981(ААТ)п с высоким уровнем общего ^Е в плазме крови (р=0,044), однако не установлено достоверной ассоциации с уровнем FeNO (р=0,158) [15]. У 225 детей с бронхиальной астмой (от 6 до 12 лет) штата Огайо в проспективном когортном исследовании не выявлено ассоциации полиморфизмов гена Ж87(ААТ)п и воздействия окружающей среды (никотин, находящийся в воздухе, зарегистрированное воздействие табачного дыма, сывороточного и волосяного котинина, аллергенов помещений, повышенная чувствительность к любому внешнему аллергену), проводимой терапии ИГКС, недавней инфекции верхних дыхательных путей, времени года, пола, расы с уровнем FeNO [16].
В литературе опубликованы статьи с двумя статистическими подходами к расчету частоты аллелей гена М982А(ССТТТ)п при разделении на генотипы. Одни авторы считают генотипами с длинными аллелями (ЬЬ) генотипы с *14 или *15 повторами и более (ССТТТ)п [10, 17], другие - с *12 повторами и более [8, 18]. В нашем исследовании мы применили второй способ статического расчета, так как у больных бронхиальной астмой определялись аллели с *9—*16 повторами, где наибольшая частота аллеля с *12 повторами - 0,351. Короткие аллели S содержали 9-11 повторов, длинные Ь - 12-16 повторов. Нами установлено, что для больных бронхиальной астмой с повышенным уровнем FeNO характерна ассоциация аллелей и генотипов, содержащих длинные тандемные повторы Ь гена М982А(ССТТТ)п, со сред-нетяжелым течением бронхиальной астмы и с повышенным уровнем ^Е. При низком уровне FeNO определена ассоциация аллелей и генотипов, содержащих длинные тандемные повторы Ь гена Ж>82А(ССТТТ)п, с пониженным ОФВ1.
У китайских детей (возраст от 5 до 18 лет; п=291), больных бронхиальной астмой, при многофакторном регрессионном анализе не установлено ассоциации гена М982(ССТТТ)п с диагнозом бронхиальной астмы (р=0,949), атопией (р=0,305), ^Е-сенсибилизацией к аэроаллергенам (р>0,2 для всех) и уровнем FeNO (р=0,847). Показан унимодальный пик распределения аллелей с *12 повторами.
Полученные данные не подтверждают, что NOS2 является основным геном-кандидатом для бронхиальной астмы или IgE-опосредованных аллергических заболеваний у китайских детей [19].
У взрослых больных с высоким уровнем FeNO (>35 ppb; n=23) установлена повышенная экспрессия iNOS (р=0,04) и ARGII (р=0,05) в дыхательных путях, низкие ОФВ1 (р<0,001), ОФВ/ФЖЕЛ (р=0,0002) и PC20*** (р<0,001), подтверждая, что FeNO служит маркером метаболического эндотипа с высоким уровнем аргинина, который клинически характеризуется более выраженной обструкцией и реактивностью дыхательных путей. У больных с низким уровнем FeNO (<35 ppb; n=29) определена почти нормальная экспрессия iNOS и ARGII (р>0,05) и более высокая РС20 (р<0,001). Исследования in vitro по оценке метаболических эффектов показали, что сверхэкспрессия iNOS и коэкспрессия iNOS + + ARGII в эпителиальных клеточных линиях бронхов человека приводят к большей зависимости от гликолиза и более высокой скорости превращения пирувата в лактат у лиц с высоким FeNO. Фенотип с высоким уровнем FeNO представляет большую часть популяции больных бронхиальной астмой и характеризуется повышенным метаболизмом аргинина, большей реактивностью дыхательных путей и более тяжелым течением заболевания [7].
Так, у взрослых пациентов из Японии со средне-тяжелой и тяжелой бронхиальной астмой не установлено различий между двумя группами генотипов (S/S+ S/L и L/L) по уровню FeNO (30,0 ppb; 16,9-48,2) и концентрации нитритов и нитратов в плазме крови, ОФВ1, уровню общего IgE и эози-нофилов в крови. Определялась ассоциация высокого уровня экспрессии мРНК NOS2 (р=0,001) и ОФВ/ФЖЕЛ (р=0,038) с генотипами, содержащими короткие аллели (S/S и S/L), имеющими *11 или менее повторов NOS2(CCTTT)n. Кроме того, выявлена ассоциация более высокого риска обострения заболевания с генотипами, содержащими короткие аллели (S/S и S/L) NOS2 (OR=2,4, 95% ДИ 1,1—5,3). Исследователи предположили, что наличие коротких аллелей (*11 и менее повторов) способствовало ухудшению клинических результатов после лечения бронхиальной астмы у пациентов со средне-тяжелой и тяжелой формами заболевания [8].
В другом японском исследовании у 91 взрослого больного диагноз бронхиальной астмы был установлен еще в детстве. Средний уровень FeNO до лечения составил 105,1 ppb (10,3-585,0). Больных распределили на 2 группы: генотипы с обеими аллелями коротких (<14*) повторов (S/S) и генотипы с одним длинным аллелем и с одним коротким повтором (L/S или L/L). Средний уровень FeNO до лечения был
""" Концентрация метахолина, вызвавшая уменьшение ОФВ1 на 20%.
значительно выше у больных с генотипами L/S+L/L NOS2(CCTTT)n (154,0±26,8 ppb), чем c генотипами S/S (87,6±9,4 ppb; /=0,019). Выявлена также слабая корреляция между уровнем FeNO до лечения и генотипами L/S+L/L NOS2 (CCTTT)n (r=0,233; /=0,026). Ассоциации между этими генотипами и специфическими IgE к домашней пыли не установлено. Однако определена слабая корреляция между уровнем в сыворотке крови специфического IgE к домашней пыли и генотипами L/S+ L/L NOS2(CCTTT)n (r=0,224; p=0,034). После лечения уровень FeNO достоверно не различался между двумя группами. Исследователи пришли к заключению, что уровень FeNO не всегда отражает активность эозинофильного воспаления дыхательных путей у японских больных бронхиальной астмой, имеющих короткие повторы S/S NOS2A(CCTTT)n [9].
Мы нашли в литературе только одно исследование, в котором выявлена ассоциация NOS2A с уровнем FeNO у больных бронхиальной астмой, но в нем исследовались лишь гаплотипы. В нашем исследовании у детей с повышенным уровнем FeNO установлена ассоциация аллеля *А гена ARGII (rs3742879) со среднетяжелым течением заболевания. Полученные данные совершенно не противоречат результатам исследования, проведенного в Южной Калифорнии, в котором у детей с бронхиальной астмой (6—11 лет) была выявлена ассоциация гаплотипа NOS2A 3 h1000010 с уровнем FeNO, значительно варьировавшая в зависимости от варианта ARG2(rs3742879) (р=0,009). Среди детей с генотипом АА* ARGII(rs3742879) гаплотип NOS2A ассоциировался с более высоким уровнем FeNO. Напротив, среди детей, несущих генотип GG* ARGII(rs3742879), гаплотип NOS2A ассоциировался с более низким уровнем FeNO. Распределение на генотипы проведено по NOS2A(CCTTT)n с >14* повторами. Не установлено ассоциаций респираторной аллергии в анамнезе с уровнем FeNO и NOS2A [10]. Исследователи предположили, что гаплотипы NOS2A promoter могли влиять на уровень FeNO посредством дифференциальной экспрессии генов. ARGII(rs3742879) является детерминантой уровня FeNO, особенно у детей с бронхиальной астмой. Механизм наблюдаемого взаимодействия генов может быть обусловлен конкуренцией за общий субстрат — L-аргинин, поскольку аргиназа была связана с пониженным синтезом оксида азота путем ингибирования экспрессии iNOS на уровне трансляции [20].
Полученные нами данные согласуются со сведениями литературы, утверждающими, что аллели с 8—9 повторами CCTTT гена NOS2 имеют более низкие уровни транскрипционной активности, чем аллели с 12—15 повторами. У индивидов — носителей аллелей с короткими повторами продуцируется меньше iNOS и, как следствие, вырабатывается меньше оксида азота II. У индивидов — носителей
аллелей с длинными повторами отмечалась более высокая скорость транскрипции iNOS, индуцированная IL-1ß, в ответ на экзогенные стимулы, включая такие патогены, как вирусы и бактерии, что приводит к повышенной продукции оксида азота. K.M. Warpeha и соавт. обнаружили, что повторы 9, 12 и 14 NOS2A(CCTTT)n давали прогрессивное увеличение экспрессии генов [12, 17, 21].
Область применения результатов. Измерение уровня FeNO в выдыхаемом воздухе как маркера аллергического воспаления для диагностики или контроля эффективности терапии бронхиальной астмы и связь уровней FeNO с полиморфизмами промотора NOS2A может нести важную диагностическую информацию. Анализ экспрессии генов может помочь в определении новых терапевтических подходов, направленных на контроль уровня оксида азота и аллергического воспаления в целом, а также выявить генетические факторы, определяющие предрасположенность к бронхиальной астме.
Выводы
У больных бронхиальной астмой доказано наличие определенной, но неоднозначной и не абсолютной взаимосвязи между уровнем FeNO, детерминирующими его генами NO-синтаз и аргиназы и особенностями течения заболевания. А именно:
- в группе больных с повышенным уровнем FeNO (>20 ppb) установлен ряд ассоциаций, носительства аллелей и генотипов, содержащих короткие тан-демные повторы S (9—11) гена NOS1 (AAT)n с ранним дебютом и тяжелым течением болезни, повышенным уровнем общего IgE в сыворотке крови; носитель-ства аллелей и генотипов, содержащих длинные тан-демные повторы L (12—16) гена NOS2A(CCTTT)n со среднетяжелым течением болезни, с повышенным уровнем IgE; носительства аллеля *А гена ARGII(rs3742879) со среднетяжелым течением болезни; носительства аллеля *G и гетерозиготного генотипа *AG гена ARGII(rs3742879) с пониженным уровнем ОФВ1/ФЖЕЛ; носительства аллелей L и сочетания генотипов SL и LL гена NOS1(AAT)n с повышенным уровнем эозинофилов в крови (эози-нофилией); сочетания генотипов S/L+L/L гена NOS1(AAT)n с грибковой сенсибилизацией. Установлены корреляции между тяжестью заболевания и NOS1(AAT)n, возрастом манифестации заболевания и NOS1(AAT)n; ОФВ1/ФЖЕЛ и ARGII(rs3742879); обратная связь между эозинофилией в крови и NOS1(AAT)n;
- в группе больных с низким уровнем FeNO (<20 ppb) также определен ряд ассоциаций: носительства аллелей и генотипов, содержащих короткие тан-демные повторы S (9—11) гена NOS1(AAT)n с грибковой сенсибилизацией; носительства аллелей и генотипов, содержащих длинные тандемные повторы L (12—16) гена NOS2A(CCTTT)n с пони-
женными ОФВ1 и ОФВ1/ФЖЕЛ; носительства гомозиготного генотипа *GG гена ARGII(rs3742879) с эпидермальной сенсибилизацией. При пониженном уровне FeNO определена связь между степенью тяжести бронхиальной астмы и NOS1(AAT)n,
степенью эффективности противовоспалительной базисной терапии и NOS1(AAT)n; грибковой сенсибилизацией и NOS1(AAT)n, а также обратная связь между ОФВ1 и Ж№2(ССТТТ)п; ОФВ/ФЖЕЛ и Ж№2(ССТТТ)п.
ЛИТЕРАТУРА REFERENCES)
1. Мизерницкий Ю.Л., Цыпленкова С.Э., Мельникова И.М. Современные методы оценки функционального состояния бронхолегочной системы у детей. М.: МЕДПРАК-ТИКА-М, 2012; 176. [Mizernitsky Yu.L., Tsyplenkova S.E., Mel'nikova I.M. Modern methods of assessing the functional state of the bronchopulmonary system in children. M.: MED-PRAKTIKA-M, 2012;176 (in Russ.)]
2. Petsky H.L., Kew K.M., Chang A.B. Review Exhaled nitric oxide levels to guide treatment for children with asthma. Cochrane Database Systematic Reviews. 2016; Issue 11. Art. NO.: CD011439.
3. DweikR.A., Boggs P.B., Erzurum S.C., Irvin C.G., Leigh M. W, Lundberg J.O. et al. An official ATS clinical practice guideline: interpretation of exhaled nitric oxide levels (FeNO) for clinical applications. Am J Respir Crit Care Med 2011; 184(5): 602-615. DOI: 10.1164/rccm.9120-11ST
4. Barnes P.J, Dweik R.A., Gelb A.F., Gibson P.G., George S.C., Grasemann H. et al. Exhaled nitric oxide in pulmonary diseases: a comprehensive review. Chest 2010; 138(3): 682-692. DOI: 10.1378/chest.09-2090
5. Rao D.R., Phipatanakul W. An Overview of Fractional Exhaled Nitric Oxide and Children with Asthma. Expert Rev. Clin Immunol 2016; 12(5): 521-530. DOI: 10.1586/1744666X.2016.1141049
6. Wechsler M.E., Grasemann H., Deykin A., Silverman E.K., Yandava C.N., Israel E. et al. Exhaled nitric oxide in patients with asthma: association with NOS1 genotype. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162(6): 2043-2047.
7. Xu W, Comhair S.A.A., Janocha A.J., Lara A., Mavrakis L.A., Bennett C.D. et al. Arginine metabolic endotypes related to asthma severity. PLoS One 2017; 12(8): e0183066. DOI: 10.1371/journal.pone.0183066
8. Hirai K., Shirai T., Suzuki M., Shimomura T., Itoh K. Association between (CCTTT)n repeat polymorphism in NOS2 promoter and asthma exacerbations. J Allergy Clin Immunol 2018; 142(2): 663-665. DOI: 10.1016/j.jaci.2018.02.023
9. Sato S, WangX., Saito J., Fukuhara А., Uematsu M., Suzuki Y. et al. Exhaled nitric oxide and inducible nitric oxide synthase gene polymorphism in Japanese asthmatics. Allergol Internat 2016; 65(3): 300-305. DOI: 10.1016/j.alit.2016.02.007
10. Salam M.T., Bastain T.M., Rappaport E.B., Islam T., Ber-hane K., Gauderman W.J. et al. Genetic variations in nitric oxide synthase and arginase influence exhaled nitric oxide levels in children. Allergy 2011; 66(3): 412-419. DOI: 10.1111/j.1398-9995.2010.02492.x
11. Brindicci C., Ito K., Barnes P.J., Kharitonov S.A. Differential ow analysis of exhaled nitric oxide in patients with asthma of differing severity. Chest 2007; 131(5): 1353-1362. DOI: 10.1378/chest.06-2531
Поступила: 07.08.19
Конфликт интересов:
Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов и финансовой поддержки, о которых
необходимо сообщить.
12. Warpeha K.M., Xu W., Liu L. Charles I.G., Patterson C.C., Ah-Fat F. et al. Genotyping and functional analysis of a polymorphic (CCTTT) (n) repeat of NOS2A in diabetic retinopathy. FASEB J 1999; 13(13): 1825-1832.
13. Maarsingh H., Leusink J., Bos I.S., Zaagsma J., Meurs H. Arginase strongly impairs neuronal nitric oxide-mediated airway smooth muscle relaxation in allergic asthma. Respir Res 2006; 7(1): 6. DOI: 10.1186/1465-9921-7-6
14. Maarsingh H., Zaagsma J., Meurs H. Arginase: a key enzyme in the pathophysiology of allergic asthma opening novel therapeutic perspectives. British J Pharmacol 2009; 158(3): 652664. DOI: 10.1111/j.1476-5381.2009.00374.x
15. Leung T.F., Liu E.K., Tang N.L., Ko F.W., Li C.Y., Lam C.W., Wong G.W. Nitric oxide synthase polymorphisms and asthma phenotypes in Chinese children. Clin Exp Allergy 2005; 35(10): 1288-1294.
16. Spanier A.J., Kahn R.S., Hornung R.W., Wang N., Sun G., Lierl M.B. et al. Environmental Exposures, Nitric Oxide Syn-thase Genes, and Exhaled Nitric Oxide in Asthmatic Children. Pediatr Pulmonol 2009; 44(8): 812-819. DOI: 10.1002/ ppul.21071
17. Konno S., Hiz,awa N., Yamaguch, E., Jinushi E., Nishimura M. (CCTTT)n repeat polymorphism in the NOS2 gene promoter is associated with atopy. J Allergy Clin Immunol 2001; 108(5): 810-814.
18. Батожаргалова Б.Ц., Мизерницкий Ю.Л., Дьякова С.Э., Петрова Н.В., Зинченко Р.А. Роль полиморфных вариантов генов NO-синтаз и аргиназы в формировании бронхиальной астмы у детей. Медицинская генетика 2017; 16(2): 40-48. [Batozhargalova B.TS., Mizernitsky Yu.L., Dy-akova S.E., Petrova N.V., Zinchenko R.A. The role of polymorphic variants of NO synthases and arginase genes in the formation of bronchial asthma in children. Meditsinskaya ge-netika 2017; 16(2): 40-48 (in Russ.)]
19. Leung T.F., Liu E.K., Li C. Y, Chan I.H., Yung E., Lam C.W., Wong G.W. Lack of association between NOS2 pentanucle-otide repeat polymorphism and asthma phenotypes or exhaled nitric oxide concentration. Pediatric Pulmol 2006; 41(7): 649-655. DOI: 10.1002/ppul.20428
20. Lee J., Ryu H., Ferrante R.J., Morris S.M.Jr., Ratan R.R. Translational control of inducible nitric oxide synthase expression by arginine can explain the arginine paradox. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 4843-4848.
21. Sarnelli G., Grosso M., Palumbo I., Pesce M., D'Alessandro A., Zaninotto G. et al. Allele-specific transcriptional activity of the variable number of tandem repeats of the inducible nitric oxide synthase gene is associated with idiopathic achala-sia. United Eur Gastroenterol J 2017; 5(2): 200-207. DOI: 10.1177/2050640616648870
Received on: 2019.08.07
Conflict of interest: The authors of this article confirmed the lack of conflict of interest and financial support, which should be reported.
