Антиоксидантные эффекты тонарола, мексидола, оксиметилурацила, тиетазола и атропина при острой интоксикации карбофосом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И БИОЛОГИЯ

УДК б15.9: 54б. 18:бб1.718.1] - 085.2 © В.А. Мышкин, Ш.Ф. Фасхутдинов, Д.В. Срубилин,

Д.А. Еникеев, В.А. Катаев, А.И. Савлуков, С.А. Сергеева, 2008

В.А. Мышкин, Ш.Ф. Фасхутдинов, Д.В. Срубилин,

Д.А. Еникеев, В.А. Катаев, А.И. Савлуков, С.А. Сергеева АНТИОКСИДАНТНЫЕ ЭФФЕКТЫ ТОНАРОЛА, МЕКСИДОЛА, ОКСИМЕТИЛУРАЦИЛА, ТИЕТАЗОЛА И АТРОПИНА ПРИ ОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ КАРБОФОСОМ Федеральное государственное учреждение науки «Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Уфа.

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, г. Уфа НИИ Фармакологии РАМН, Москва

Цель исследования. Сравнительная оценка эффективности антиоксидантной терапии и атропинизации в качестве средств коррекции процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), ферментов антиоксидантной защиты и биоэнергетических процессов в миокарде после тяжелого острого отравления карбофосом.

Материалы и методы. Исследование проведено на крысах - самцах. Исследована модель острых отравлений карбофосом (320 мг/кг). В одном эксперименте изучены тонарол (ионол), мексидол, оксиметилурацил, тиетазол и атропин. Продукты перекисного окисления липидов исследованы в липидных экстрактах ткани миокарда и эритроцитах различными методами. Оценивали активность каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), глюкозо - б - фосфатдегидрогеназы (Г - б -ФДГ) методами количественной гистохимии, в тканях миокарда определяли активность моноаминоксидазы (МАО), сукци-натдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Измерение и оценку числа химических реакций проводили на микроскопе с телевизионным анализатором MT - 9. Антиоксидантную активность препаратов исследовали в витральных системах автоокисления, аскорбатзависимого и НАДФН - зависимого ПОЛ. Антирадикальную активность препаратов регистрировали методом хемилюминесценции в модельной системе инициированного окисления этилбензола.

Результаты. Антиоксиданты в режиме монотерапии оказывают выраженное терапевтическое действие, в том числе на содержание ретикулоцитов, активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, количество продуктов ПОЛ, а также активность МАО, СДГ и ЛДГ в миокарде. Выявлены различия в механизме действия оксиметилурацила, мексидола и тонаро-ла. В отличие от тиетазола они обладают прямой антирадикальной активностью. Атропин антиоксидантной (антиради-кальной) активностью не обладает.

Заключение. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать тиетазол, мексидол и оксиметилурацил для дальнейших доклинических испытаний в качестве средств коррекции окислительного стресса и биоэнергетических нарушений в восстановительном периоде после тяжелых острых отравлений ксенобиотиками.

Ключевые слова: интоксикация, антиоксиданты, окислительный стресс, фосфорорганические соединения, карбофос.

V.A. Myshkin, Sh.F. Faskhutdinov, D.V. Srubilin,

D.A.Enikeyev, V.A.Katayev, A.I. Savlukov, S.A.Sergeeva ANTIOXIDANTS EFFECTS TONAROL, MEXIDOL, OXIMETHILURACIL, THIETAZOL AND ATROPIN IN ACUTE INTOXICATION BY MALATHION

The purpose of the study. Comparative assessment of the efficacy of anti-oxidant and atropine therapy as a means for the correction of lipid peroxide oxidation (LPO), enzymes of antioxidant protection and bioenergetic processes in the myocardium after severe induced intoxication by malathion.

Materials and methods. Male rats were used in the experiments. The model of acute poisoning by malathion (320 mg/kg) was studied. Tonarol (ionol), mexidol, oxymethyluracil, thietazol and atropine were studied experimentally. The products of lipid peroxide oxidation were assessed in lipid extracts of myocardial tissues and erythrocytes by means of various methods. The activity of catalase, superoxide dismutase, glucose - б - phosphate dehydrogenase (G - б - PhDG) were determined by means of quantitative histochemistry; in the tissues of myocardium the activity of monoaminooxydase (MAO), succinate dehydrogenase (CDG) and lactate dehydrogenase (LDG) were assessed. The measurement and assessment of the number of chemical reactions were carried by the microscope with MT - 9 televisonal analyzer. Antioxidant activity of the preparations was investigate in in - vitro systems of auto -oxidation, ascorbate - dependent and NADPhH- dependent LPO. Antiradical activity of the preparations was registered by chemo-luminescence (ChL) technique in the model system of initiated ethylbensol oxidation.

Results. Antioxidants used as monotherapeutic agents have a marked therapeutic effect, they affect the amount of reticulocytes, the activity of superoxide dismutase, catalase, the amount of LPO products as well as activity of MAO, SDG and LDG in the myocardium. Certain difference in the mechanism of preparation action have been revealed: unlike thietazol, oxymethyluracil, mexidol and tonarol have been found to possess direct antiradical activity. Atropine has no antioxidant (antiradical) activity.

Conclusions. The results of the experiments allow us to recommend thietazol, mexidol and oxymethyluracil for further preclin-ical tests as means for the correction of oxidative stress and bioenergetic impairments during the restorative period after acute intoxication by xenobiotics.

Key words: intoxication, antioxidants, oxidative stress, phosphoroorganic compounds, malathion

Ранее нами было показано что функционально-метаболические нарушения в органах и тканях после тяжелых отравлений некоторыми липофильными фосфорорганическими соединениями (ФОС) сопровождаются избыточной продукцией активных форм кислорода (АФК), активацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что приводит к напряжению и последующей декомпенсации механизмов антиоксидантной защиты организма и развитию окислительного стресса [1].

Широкое участие свободнорадикальных процессов в патогенезе отравлений ФОС, затрагивающих головной мозг, сердце, печень, почки, а также эритроциты, ставит вопрос о возможности профилактики и коррекции нарушений фармакологическими средствами. В то же время, несмотря на значительное число работ, посвященных изучению патогенетической роли радикальных процессов в патогенезе тяжелых отравлений химическими веществами вообще и карбофосом в частности, перечень препаратов антиоксидантов, использующихся в клинической практике, остается немногочисленным.

Целью работы явилось сравнительное изучение антиоксидантной эффективности окси-метилурацила, тиетазола, мексидола, тонаро-ла (ионола), а также атропина на ПОЛ, систему антиоксидантной защиты и некоторые биоэнергетические показатели в миокарде и эритроцитах у крыс после тяжелого отравления карбофосом.

Материалы и методы Исследование проведено на 109 белых беспородных крысах - самцах массой 180 -230 г, которых содержали на обычном пищевом рационе в условиях вивария.

Острое отравление создавали путем однократного введения карбофоса в желудок крысам. В опытах был использован 50% препарат карбофоса. Все крысы были разделены на семь групп по 12 особей в каждой. Биологическим контролем служили здоровые (ин-тактные) крысы. В контрольную группу вошли животные, которым вводили карбофос в дозе 320 мг/кг (0,9 ЛД50). Животных первой группы лечили атропином. Антидот в дозе 10 мг/кг вводили внутримышечно через 30 минут, 1 час и 2 часа после отравления карбофосом. Крыс второй, третьей, четвертой и пятой групп лечили тиетазолом, оксиметилураци-лом, мексидолом и тонаролом (ионолом).

Начиная со 2-х суток антиоксиданты применяли в виде монотерапии ежесуточно по 50 мг/кг в течение одной недели. Тестирование

проводили на 14-е сутки эксперимента. Количество эритроцитов, концентрацию гемоглобина, показатель гематокрита и относительное количество ретикулоцитов исследовали традиционными методами [2]. Содержание кетодиенов (КТД) определяли по З. Плацеру, количество ТБК - реагирующих продуктов (ТБК - РП) - по методу И.Д. Стальной [3, 4, 5]. Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности антиоксидантных ферментов - каталазы [6], супероксиддисмутазы (СОД) [7]. Определяли также активность глюкозо - б - фосфатдегидрогеназы (Г - б - ФДГ) [8], активность ферментов миокарда - моно-аминоксидазы (МАО), сукцинатдегидрогена-зы (СДГ) и лактатдегидрогеназы - определяли гистохимическими методами [9]. Антиради-кальную активность препаратов регистрировали методом хемилюминесценции в модельной системе инициированного окисления этилбензола по В. Я. Шляпинтоху [10]. Величину антирадикальной активности оценивали путем вычисления константы К7 скорости реакции между молекулами изучаемого вещества и перекисными радикалами этилбензола. В качестве референтного препарата использовали ионол (4 - метил - 2,6 - дитретбутилфе-нол), широко применяемый антиоксидант с антирадикальным механизмом действия. Антиоксидантную активность препаратов исследовали в витральных системах ПОЛ [11]. Фактическую обработку цифровых данных осуществляли с использованием критерия Стьюдента [12].

Литиевая соль тиетазола синтезирована доктором х.-ф. наук В. А. Катаевым в ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет»

Результаты и обсуждение

Установлено, что карбофос в дозе 0,9 ЛД50 вызывает гибель 30% крыс в течение 1-х суток и в постинтоксикационном периоде оказывает выраженное прооксидантное действие на систему эритрона и миокард. У отравленных животных выявлены увеличение в крови содержания ретикулоцитов, подавление активности антиоксидантной системы и увеличение концентрации первичных и вторичных продуктов ПОЛ (табл. 1).

Так, количество ретикулоцитов у крыс увеличилось в 1,7 раза - с 34,0±3,5 до 58,2±2,70/00 (Р < 0,001). Снизилась активность антиоксидантных ферментов: СОД с

1,07±0,04 до 0,68±0,07 усл. ед./мг Hb (Р < 0,001), каталазы с 37,1±1,8 до 24,4±2,5 ммоль/мин/г Hb (Р < 0,001). Активность Г - б

- ФДГ уменьшилась с 15,7±0,40 до 10,2±0,36 мкмоль/мин/мг НЬ (Р < 0,01), что значительно подавляет антиокислительный потенциал эри-трона и способствует активации процессов ПОЛ. Это подтверждается увеличением в эритроцитах количества первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Содержание КТД возросло с 102,1±5,0 до 182,1±1,8 нмоль/г НЬ (Р

< 0,01), а количество ТБК - РП увеличилось с 0,26±0,11 до 0,56±0,02 нмоль/мг белка (Р <

0,01).

В миокарде отравленных крыс обнаружено увеличение концентрации первичных и вторичных продуктов ПОЛ при одновременном подавлении активности СОД и митохондриальных ферментов МАО, СДГ и ЛДГ (табл.2).

Таблица 1

Морфофункциональные показатели эритроцитов и ПОЛ их мембран у крыс на 14-е сутки после острого отравления карбофосом на фоне лечения (М±т)

Показатели Препараты (группа животных)

здоровые крысы (контроль) карбофос атропин тиетазол оксиметил -урацил мексидол тонарол

Гемоглобин, г/л 148,2±5,2 142,5±2,8 140,2±4,8 148,2±3,2 150,0±3,0 155,0±6,5 140,0±3,3

Эритроциты, 10 2 /л 4,6±0,1 4,5±0,18 4,6±0,2 4,5±0,1 4,7±0,08 4,2±0,12 4,0±0,20

Гематокрит, % 42,0±3,4 41,5±4,0 41,6±3,5 43,0±2,5 40,8±1,7 40,5±1,8 40,6±6,5

Ретикулоциты , 0/00 34,0±3,5 58,2±2,7* 36,4±2,0** 25,8±1,7** 30,6±2,0** 35,5±1,8** 55,6±3,5*

Каталаза, ммоль/мин/ г НЬ 31,7±1,8 24,4±2,5* 26,5±1,6* 30,0±1,1** 33,0±1,5** 26,2±3,3* 30,2±1,4**

СОД, усл.ед/мг НЬ 1,07±0,04 0,68±0,07* 0,70±0,05* 1,08±0,05** 1,10±0,04** 0,98±0,04** 0,88±0,12

Г - 6 - ФДГ, мкмоль/ мин/ мг НЬ 15,7±0,40 10,2±0,36* 12,8±0,40 11,5±0,58* 16,8±0,44* ** 16,6±0,50* ** 9,8±0,07*

КТД, нмоль/ г НЬ 102,1±5,0 182,0±1,8* 125,0±2,4** 92,1±5,00** 98,6±11,5** 88,9±10,2** 99,8±6,6**

ТБК - РП, нмоль/ мг белка 0,26±0,11 0,56±0,02* 0,68±0,05* 0,31±0,06** 0,24±0,04** 0,28±0,10** 0,19±0,18**

Достоверность (Р < 0,05) различий: * со здоровыми крысами, * * с контролем.

Таблица 2

Метаболические реакции миокарда крыс на 14-е сутки после тяжелого отравления крыс карбофосом на фоне лечения (М±т)________________________________

КТД, показатели Препараты (группа животных)

Здоровые крысы (контроль) карбофос атропин тиетазол оксиметил -урацил мексидол тонарол

КДК, Д332 0,37±0,01 1,41±0,10* 0,80±0,048 0,68±0,06** 0,44±0,05** 0,50±0,06** 0,51±0,03* **

ШО, усл.ед/мг липидов 0,38±0,04 1,04±0,06* 0,84±0,048 0,58±0,05** 0,48±0,05** 0,66±0,05** 0,60±0,02**

СОД , ед/мг белка 1,32±0,08 1,48±0,05* 0,46±0,04* 0,76±0,04** 0,88±0,03** 1,00±0,06** 0,52±0,08*

МАО, усл.ед. 5,30±0,33 3,93±0,39* 3,92±0,59* 5,87±0,12** 5,90±0,26** 5,02±0,44** 3,78±0,59*

СДГ, усл.ед 9,27±0,10 8,04±0,04* 8,10±0,05* 9,24±0,05** 9,35±0,04** 9,8±0,11** 9,12±0,10

ЛДГ, усл.ед 8,64±0,03 8,82±0,06* 8,68±0,05 8,52±0,08** 8,55±0,10** 8,48±0,07** 8,86±0,12*

Достоверность (Р < 0,05) различий: * со здоровыми крысами, * * с контролем.

Активность СОД снизилась более чем в 2,7 раза - с 1,32±0,08 до 0,48±0,05 ед./мг белка. В то же время увеличилось количество КТД, в 3,8 раза и в 2,7 раза содержание Шиффовых оснований (ШО), что свидетельствует о глубоких нарушениях про - и антиоксидантного равновесия в миокарде отравленных карбофосом крыс. Оксидантные нарушения сопровождаются снижением активности МАО и СДГ при одновременном увеличении активности ЛДГ. МАО уменьшилась в 1,35 раза: с 5,30±0,33 до 3,93±0,039 условных единиц. В меньшей степени, но статистически достоверно снизилась активность СДГ: с 9,27±0,10 до 8,04±0,04 условных единиц при одновременном увеличении активности ЛДГ с 8,64±0,03 до 8,82 условных единиц, последнее может свидетельствовать о накоплении лактата.

Таким образом, карбофос оказывает выраженное прооксидантное действие в организме крыс. Введение крысам атропина защищает их от гибели, предупреждает развитие рети-кулоцитоза и ограничивает рост содержания КТД, однако атропинизация не влияет на ан-

тиоксидантную систему, ПОЛ эритрона и миокарда, а также не предупреждает нарушения активности МАО, СДГ и ЛДГ (табл. 1,2). Применение антиоксидантов в режиме монотерапии оказывает выраженное терапевтическое действие на большинство нарушенных показателей, в том числе на содержание рети-кулоцитов, активность СОД и каталазы, содержание продуктов ПОЛ и также активность МАО, СДГ и ЛДГ в миокарде. В качестве средств коррекции морфофункциональных показателей в эритроцитах по степени убывающей терапевтической эффективности исследованные препараты можно расположить в следующей последовательности: оксиметилу-рацил > мексидол ~ тиетазол > тонарол > атропин.

Для выяснения механизма действия исследованных препаратов проведены модельные эксперименты с использованием различных систем свободнорадикального окисления. Результаты представлены в таблице 3.

Tаблица 3

Антирадикальная и антиокислительная активность препаратов в модельных системах__________

Препарат Антиради-кальная активность, константа К7 (л/моль).с-1 Антиокислительная активность, %

спон- танная ПОЛ нефер- ментная ПОЛ фер- ментная ПОЛ

Атропин (4,3±1,3)10* - - -

Оксимети- лурацил (2,6±0,3)104 51,8 31,8 57,2

Петазол 0 - 20,8 10,5

Мексидол (2,1±0,6)104 80,6 92,0 68,3

Ионол (тонарол) (2,3±0,6)104 96,0 100 70,3

В витральной системе этилбензол / ледяная уксусная кислота величина константы К7 для атропина равна (4,3±1,3). 101 (л/моль).с, что свидетельствует о его низкой антирадикаль-ной активности. Напротив, оксиметилурацил, мексидол и тонарол имеют высокие значения: К7 > 104 (л/моль).с, что свидетельствует о их высокой антирадикальной активности. В системах природного происхождения (гомогенат печени) мексидол и тонарол значительно ак-

тивнее тиетазола. В системах неферментного (аскорбатзависимого) и ферментного ПОЛ это более чем пятикратное различие (табл. 3).

Таким образом, антиоксидантные эффекты тиетазола, с одной стороны, и мексидола, ок-симетилурацила и тонарола - с другой, реализуются через различные механизмы. Наряду с основным активирующим действием препаратов на эндогенные антиоксидантные системы клеток мексидол, оксиметилурацил и тонарол в отличие от тиетазола обладают прямой ан-тирадикальной активностью.

Заключение

Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать тиетазол, мексидол и оксиметилурацил для дальнейших доклинических испытаний в качестве средств коррекции окислительного стресса и биоэнергетических нарушений в восстановительном периоде после тяжелых острых отравлений ксенобиотиками.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мышкин В. А., Гуляева И. Л., Ибатуллина Р. Б. и др. Влияние актопротекторов на перекис-ное окисление липидов и состояние мембран эритроцитов у крыс при отравлении карбофосом // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 2004. - №3. - С. 10-12.

2. Колб В. Г., Камышников В. С. Клиническая биохимия. - Минск; 1978.

3. Плацер З., Видланова М., Кушелева Л. Процессы переокисления липидов при повреждении и ожирении печени //Чехословацкое медицинское обозрение. - 1970; 16 (1): 30-41.

4. Стальная И. Д., Гаришвили Т. Г. Метод определения диальдегида с помощью тиобарбитуро-вой кислоты //Современные методы в биохимии. - М., 1988. - С. 66-68.

5. Волчегорский И. А., Долгушин И. И., Колесников О. А. и др. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма. - Челябинск; 2000.

6. Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г. Метод определения активности каталазы //Лабораторное дело. - 1988. - №1. - С. 16-18.

7. Чумаков В. Н., Осинская Л. Ф. Количественный метод определения Zn - Cu - зависимой су-пероксиддисмутазы в биологическом материале //Вопросы медицинской химии. - 1977. - № 5.

- С. 712-716.

8. Gloc G., Melean P. Futurt studies on the properties and assny of glucose - 6 - phosphate degidro-genaze and 6 - phospogluconate degidrogenaze of rat liver. Biochemistry 1953; 55 (3): 400-408.

9. Берстон М. Гистохимия фермантов. - М.: Мир; 1965.

10.Шляпинтох В. Я., Карпухин О. Н. и др. Хемилюминисцентные методы исследования медленных химических процессов. - М., 1966.

11.Клебанов Г. И., Бабенков И. В., Теселкин Ю. А. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением ЖЛП // Лабораторное дело. - 1988. - №5. - С. 7-11.

12.Хафизьянова Р. Х., Бурыкин И. Н., Алеева Г. Н. Математическая статистика в экспериментальной и клинической фармакологии. - Казань: Медицина, 2006.