CC BY
82
Экспериментальная биология и медицина УДК 615:678.048:616.36-005.4
АНТИОКСИДАНТНАЯ ТЕРАПИЯ ПРИ КОРРЕКЦИИ ИШЕМИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
© Бежин Л.И., Перьков Л.Л.
Кафедра оперативной хирургии и топографической анатомии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: abezin@yandex. ru
Выполнено экспериментальное исследование на 35 собаках с целью изучения влияния антиоксидантного проти-воишемического лечебного комплекса, состоящего из мексикора и актовегина с временным портокавальным шунтированием, на выраженность 30-минутного ишемического повреждения ткани печени после пережатия печеночнодвенадцатиперстной связки. Животные разделены на 5 групп. Установлено, что в группе без антиоксидантной защиты наиболее выражено развитие цитолитического, холестатического и гепатодепрессивного синдромов. В экспериментальных группах с коррекцией ишемии мексикором и актовегином биохимические показатели были достоверно ниже контрольных, а к седьмым суткам наблюдения они нормализовались. Результаты исследования свидетельствуют о том, что применение антиоксидантного противоишемического комплекса снижает тяжесть поражения печени вследствие кислородного голодания, предотвращает развитие ишемических изменений в органе и обеспечивает защитный и лечебный эффекты.
Ключевые слова: Мексикор®, Актовегин®, ишемия печени, противоишемическая защита.
ANTIOXIDANT THERAPY AT ISHEMIC LIVER INJURY CORRECTION (THE EXPERIMENTAL RESEARCH)
Bezhin A.I., Perkov A.A.
Operative Surgery and Topographic Anatomy Department of the Kursk State Medical University, Kursk
The experiment involved 35 dogs. The research is devoted to the influence of antioxidant anti-ischemic treatment complex which consists of Mexicor® and Actovegin® with temporary porto-caval shunting. The idea was to investigate it’s impact on the intensity of 30-minute ischemic injury of hepar tissue after hepatic-duodenum ligaments clamping. The animals were de-vived into 5 groups. The results showed that animals of the experimental group without antioxidant protection suffered from the development of cytolytic, cholestatic and hepatodepressive syndroms. In the groups with correction of ischemia by Mexicor and Actovegin, presented low changes of biochemical showings which normilized to the seventh day of experiment. The conclusion of the experiment is concentrated on the idea that the use of antioxidant anti-ischemic complex reduces the level of liver injury caused by oxygen starvation, prevents the development of ischemic modification in the organ and provides protective and treatment effects.
Keywords: Mexicor®, Actovegin®, hepar ischemia, anti-ischemic protection.
В настоящее время проблема гемостаза при операциях на печени является одной из важнейших в хирургии. Наиболее эффективный способ остановки кровотечения - пережатие печеночнодвенадцатиперстной связки (ПДС). Однако сдавление ее ведет к дестабилизации гемодинамики, развитию портальной гипертензии, гипоксии и ишемии печени, что, в свою очередь, при 15минутном (и более) воздействии может привести к необратимым морфофункциональным изменениям в печени вплоть до появления участков некроза в гепатоцитах [1, 14, 17].
Наиболее перспективным в разработке методов профилактики и лечения ишемического поражения печени многие авторы считают поиск и применение медикаментозных средств, обладающих антиоксидантной (антиокислительной) активностью [8] и увеличивающих резистентность гепатоцитов к недостатку кислорода [16].
В различных областях медицины (кардиология, дерматология, эндокринология, хирургия)
исследовались возможности применения препаратов этой группы - токоферолы, витамины С и Е, эндогенный цитохром С, фенозан и его производные, дибунол, оксибутират Ка, ^510, рез-вератрол [11, 12, 15].
Однако их эффективность не всегда может удовлетворить практическую медицину.
В последнее время синтезировано много новых препаратов с антиоксидантными свойствами, будущее которых представляется весьма перспективным. К таким препаратам следует отнести мексикор [11] и актовегин [10].
Мексикор достаточно активно изучается в кардиологии [2, 3, 9]. Он нормализует микроциркуляцию, активирует метаболические процессы в ишемизированных участках, предупреждает ишемические аритмии, обладает прямым мембраностабилизирующим действием, уменьшает площадь поражения миокарда при окклюзионном инфаркте и в условиях тканевой гипоксии стимулирует репаративно-регенеративные процессы.
s
При использовании препарата у больных облите-рирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей [6], сахарным диабетом II типа с ишемическими поражениями стоп повышалась функциональная активность микрососудистого русла, уменьшалась тканевая гипоксия [4]. Что касается ишемических процессов в печени, мексикор мало изучен.
Актовегин улучшает транспорт и утилизацию глюкозы, повышает обмен высокоэнергетических фосфатов (АТФ), способствует диффузии и утилизации кислорода клетками различных органов и тканей, что приводит к улучшению оксигенации в микроциркуляторной системе с одновременным улучшением анаэробного и аэробного энергообмена [10].
Обладание мексикора и актовегина антиокси-дантными и противоишемическими свойствами делает возможным их совместное применение, тем более что до настоящего времени не было изучено комплексное использование этих препаратов с целью профилактики и лечения ишемии печени в условиях временного ее выключения из кровообращения.
В связи с этим целью нашей работы была разработка схемы профилактики и лечения ишемического поражения печени, возникающего после пережатия ПДС на 30 минут, комбинированным применением портокавального шунтирования и введением мексикора и актовегина.
Задачами настоящего исследования являлось изучение в сравнительном аспекте характера морфологических и биохимических изменений печени при ее ишемии с применением мексикора и актовегина и без них.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования выполнены на 35 беспородных разнополых собаках весом от 9 до 18,5 килограмма в возрасте от 2 до 5 лет (возраст определяли по зубам) [5]. Выбор животных был обусловлен тем, что печень и остальные органы у собак значительных размеров и удобны для манипуляций. Микроструктура достаточно схожа с таковой печени человека. При работе с экспериментальными животными и утилизации экспериментального материала мы руководствовались приказами министра здравоохранения СССР № 755 от 12.08.1977 г. и № 701 от 27.07.1978 г., Постановлением ГД ФС РФ
№ 4679-11 ГД от 01.12.1999 г., "Ветеринарносанитарными правилами" в ред. от 16.08.2007 г., Гражданским кодексом РФ (ч. I) ст. 137 в ред. от 09.02.2009 г. Все животные до начала эксперимента прошли карантинный режим вивария, со-
держались в одинаковых условиях на типовом пищевом рационе в течение 7-10 суток для адаптации к новой обстановке и выявления признаков возможных заболеваний. В день эксперимента кормление животных прекращали. Все исследования проводились в одинаковый временной интервал.
У всех животных до операции и после через 30 минут и на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки определяли уровни трансаминаз (АСТ и АЛТ) - активности аспартат- и аланинаминотрансфераз в сыворотке крови - по методу Райтмана-Френкеля, лактатде-гидрогеназы (ЛДГ) - по Савелю, остаточного азота - по методу Раппопорта-Эйхгорна, мочевины -диацетилмонооксимным методом, холестерина по Ильку, Р-липопротеидов - по Бурштейну, концентрации билирубина - по методу Ендрашика. Определяли уровни щелочной фосфатазы, общего белка, протромбинового индекса, фибриногена. Также ставили тимоловую пробу. Индикаторами цитолитического синдрома являлись лактатде-гидрогеназа, активнось аланин- и аспартатамино-трансфераз. Показателями синдрома холестаза -активность щелочной фосфатазы, концентрация билирубина, холестерина и бета-липопротеидов. Индикаторами гепатодепрессивного синдрома служили концентрация общего белка, содержание фибриногена и протромбиновый индекс (ПТИ); мезенхимально-воспалительного синдрома - тимоловая проба [7].
Проводили измерение артериального давления (АД) внутрисосудистым способом посредством канюлирования бедренной артерии с реги-стрирацией на биомониторе БМТ-701.
Всем животным под гексеналовым наркозом выполняли верхнесрединную лапаротомию. Пре-медикация производилась атропином 0,1 мл 0,1% раствора и димедролом 0,2 мл 1% раствора, которые вводили внутримышечно за 30 минут до операции. Гексенал вводился из расчета 30 мг/кг веса животного. У всех животных на протяжении хирургического вмешательства проводилась инфу-зионная терапия 5% раствором глюкозы и физиологическим раствором в объеме от 150 до 250 мл.
Для предупреждения выраженных гемодина-мических нарушений у животных осуществляли разгрузку портальной системы путем наложения временного экстракорпорального портокавально-го шунта [13] из силиконовой трубки между тонкокишечной веной большого диаметра (веной портального бассейна) и подкожной веной передней конечности собаки (система верхней полой вены). Перед работой шунт заполняли 5% раствором глюкозы с гепарином, который вводили из расчета 120 Ед/кг веса животного. Ишемию печени вызывали пережатием печеночно-двенадцатиперстной связки эластическим зажимом на 30 ми-
нут с предварительной ее инфильтрацией 1G мл G,25% раствора новокаина. После снятия зажима с ПДС производили перевязку канюлируемых вен. Обе раны - лапаротомную и на конечности животного - ушивали наглухо.
Первая серия экспериментов состояла из ин-тактных животных, которым оперативное вмешательство не производили. Эти собаки служили нам образцом нормы для всех биохимических показателей функции печени и морфологических исследований
Во второй серии опытов (контроль) на 8 собаках производили портокавальное шунтирование и моделирование 30-минутной ишемии печени посредством наложения эластического зажима на ПДС.
В третьей серии экспериментов на 8 животных также выполняли портокавальное шунтирование с пережатием ПДС на 3G минут. В этой группе животным мексикор вводили внутривенно струйно в виде 5% раствора в дозе 1G мг/кг веса животного за 2 часа до операции и в течение 7 дней после операции с интервалом в 24 часа.
В четвертой серии опытов на 8 собаках моделировали 30-минутную ишемию печени по вышеприведенной методике. Актовегин вводили собакам внутривенно струйно в виде раствора для инъекций в дозе 1G мг/кг веса животного за час до операции и в течение 7 дней после операции с интервалом в 24 часа.
В пятой серии на 8 животных моделировали 30-минутную ишемию печени и вводили растворы мексикора и актовегина по разработанной нами схеме. Мексикор вводили внутривенно струйно в виде 5% раствора в дозе 1G мг/кг веса за
2 часа до операции. Актовегин вводили внутривенно струйно в виде раствора для инъекций в дозе 1G мг/кг веса за час до операции. В послеоперационном периоде каждый из препаратов вводили один раз в сутки на протяжении 7 дней. Интервал между их введениями составлял 12 часов: мексикор вводили в 8.GG, актовегин - в 2G.GG.
Выбор разовых и курсовых доз, способа введения фармакологических препаратов в 3, 4 и 5-й сериях основывался на экспериментальных данных, приведенных в литературе, а также соответствовал рекомендациям, приведенным в аннотациях к препаратам.
Всем животным в послеоперационном периоде проводили симптоматическую терапию сердечными средствами и анальгетиками (коргликон
0,2-G,3 мл - G,G6% раствора, кордиамин по 1-2 мл в/м, строфантин К по G,5 - 1 мл G,G5% раствора в/в медленно в 1G мл 2G% р-ра глюкозы, димедрол до 1,G - 1% раствора в сутки, анальгин до 2,0 - 50% раствора в сутки).
Животных выводили из опыта на 1, 3, 7, 14, 30 сутки путем передозировки анестетиков. Брали ткань печени на гистологические и гистохимические исследования. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, на ШИК - положительные вещества - по МакМанусу. Препараты консультировал д.м.н., профессор В.С. Барсуков.
Полученные данные обрабатывали с помощью встроенных алгоритмов пакета анализа приложения для персонального компьютера путем вычисления средних арифметических (М) и средних ошибок средних (т) и достоверности различий (р < или = 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Во второй серии экспериментов умерло пять животных в течение первых семи суток наблюдения.
При 30-минутной ишемии печени у собак возникали цитолитический, холестатический и гепатодепрессивный синдромы, о чем свидетельствовали результаты биохимических исследований (табл. 1, 2). Увеличивалось содержание в крови щелочной фосфатазы, уменьшалось содержание фибриногена и ПТИ (табл. 2). Наиболее выраженные изменения этих показателей пришлись на период с третьих по седьмые сутки от начала эксперимента. На третьи сутки отмечалось повышение значений АЛТ в 6,98 и АСТ в 6,93 раза, ЛДГ - 3,07 раза, причем до седьмого дня включительно явной тенденции к снижению не наблюдалось, что свидетельствует о выраженности цитолитического синдрома (табл. 1). Содержание билирубина увеличивалось в 2,94 раза. Этот период характеризовался также ростом значений щелочной фосфатазы в 2,02 раза, Р-липопротеидов - в 1,47 раза и снижением концентрации холестерина в 1,35 раза по сравнению с контролем. Через 7 суток после начала эксперимента ясных изменений в сторону нормализации показателей все еще не наблюдалось, что свидетельствует о развитии синдрома холестаза (табл. 1). Гепатодепрессивный синдром на исходе третьих суток послеоперационного периода проявлялся количественным уменьшением фибриногена в 1,91 раза, ПТИ в 1,82 и общего белка в 1,16 раза по сравнению с исходными данными с отсутствием тенденции к повышению этих значений на седьмые сутки эксперимента (табл. 2). На протяжении двух недель все еще оставалось высоким содержание мочевины с пиком значений на третьи-седьмые сутки после операции. Достоверных изменений тимоловой пробы на всех сроках не наблюдалось.
Таблица 1
Изменение биохимических показателей у животных 2-3 серии (М±т)
Условия опыта Время после ишемии Н Ч < н и < 1-і ч Билирубин Щелочная фосфатаза Холесте- рин -ы -о д пи 8 2 Ч & са &
1. Здоровые животные - 0,74 ± 0,08 0,46 ± 0,06 1,37 ± 0,15 13,46 ± 0,27 2,46 ± 0,29 3,94 ± 0,42 0,32 ± 0,017
2. Модель ишемии 30 минут 1,95 ± 0Д1*1 1,11 ± 0,04*1 2,09 ± 0,07*1 22,94 ± 0,83#1 3,81 ± 0,27*1 3,87 ± 0,57*1 0,35 ± 0,026*1
3. Модель ишемии; мексикор 1,16 ± 0,07*' 0,67 ± 0,09*1 1,66 ± 0,08*1 16,72 ± 0,34і*1 2,92 ± 0,18 3,93 ± 0,36 0,28 ± 0,019
4. Модель ишемии 1-е сутки 3,44 ± 0,36*1,2 1,71 ± 0,17*1,2 3,98 ± 0,14*1,2 35,18 ± 0,47*1,2 4,08 ± 0,39*1,2 3,64 ± 0,89*1,2 0,39 ± 0,031*1,2
5. Модель ишемии; мексикор 2,21 ± 0,09*1,2,3 0,96 ± 0,08*1,2,3 2,09 ± 0,16*1,2,3 19,94 ± 0,71*1,2,3 3,84 ± 0,19 3,89 ± 0,43 0,34 ± 0,027
6. Модель ишемии 3-и сутки 5,17 ± 0,28*1,2,4 3,19 ± 0,14*1,2,4 4,21 ± 0,12*1,2,4 39,53 ± 0,92*1,2,4 4,96 ± 0,32*1,2 2,92 ± 0,13*1,2 0,47 ± 0,033*1,2
7. Модель ишемии; мексикор 2,32 ± 0,14*1-5 1,48 ± 0,11*1-5 2,87 ± 0,17*1-5 23,96 ± 0,85*1-5 2,89 ± 0,27 3,81 ± 0,39*7 0,33 ± 0,029
8. Модель ишемии 7-е сутки 5,11 ± 0,17*1,2 3,08 ± 0,15*1,2 4,13 ± 0,15*1,2 30,05 ± 0,73*1,2 3,83 ± 0,33*1,2 2,83 ± 0,23*1,2 0,38 ± 0,027*1,2
9. Модель ишемии; мексикор 1,87 ± 0,15*1-7 1,22 ± 0,13*1-7 2,03 ± 0,12*1-7 18,69 ± 0,69*1-7 2,75 ± 0,31 3,72 ± 0,51 *9 0,32 ± 0,019
10. Модель ишемии 14-е сутки 2,34 ± 0,21 *1,2 1,71 ± 0,14*1,2 2,31 ± 0,16*1,2 21,13 ± 0,81*1,2 2,57 ± 0,32*1,2 3,48 ± 0,44*1,2 0,30 ± 0,025*1,2
11. Модель ишемии; мексикор 1,12 ± 0,18*1"9 0,85 ± 0,07*1"9 1,49 ± 0,14*1-9 14,87 ± 1,48*1-9 2,41 ± 0,21 3,83 ± 0,52 0,36 ± 0,032
12. Модель ишемии 30-е сутки 1,30 ± 0,11*1,2 0,60 ± 0,08*1,2 1,47 ± 0,07*1,2 18,36 ± 0,72*1,2 2,35 ± 0,19 3,84 ± 0,47 0,27 ± 0,019
13. Модель ишемии; мексикор 0,73 ± 0,08*1-11 0,47 ± 0,11м1 1,38 ± 0,151-11 13,51 ± 0,83*1-11 2,44 ± 0,17 3,93 ± 0,23 0,31 ± 0,02
Примечание: единицы измерения: АЛТ, АСТ, ЛДГ - ммоль/(ч-л); билирубин - мкмоль/л, холестерин - ммоль/л, щелочная фосфатаза - ммоль/(ч-л), Р-липопротеиды - г/л; - цифры рядом со зведочкой указывают, по отношению к показателю какой группы различия достоверны с уровнем значимости р<0,05; п - количество животных в группе; в группах "модель ишемии" п=8; в группах "модель ишемии; мексикор" п=8.
При морфологическом исследовании ткани печени после 30-минутной ишемии у животных определяли полнокровие триад и центральных вен, увеличение площади участков печеночной паренхимы с дистрофическими и некробиотиче-скими изменениями, нарастание межуточного отека и усугубление гемодинамических расстройств. В центральных зонах печеночных долек и в зоне триад отмечались распространенные стазы в портальных и центральных венах, разры-
вы их стенок на фоне нарастающей дискомплек-сации самих долек (рис. 1).
Цитоплазма гепатоцитов была набухшей, наблюдались отдельные очаги плазморрагий. Ли-поидоз сочетался с зернистой и гидропической дистрофиями с преобладанием последней. Вплоть до третьих суток в ткани печени сохранялись дисциркуляторные расстройства - дилатация и полнокровие сосудов, визуализировались отдельные клетки с признаками некроза, между пече-
ночными дольками и балками появилось большое количество лейкоцитов, в гепатоцитах практически не было ШИК-позитивных веществ. На седьмые сутки в исследуемых образцах печени встречались участки мостовидных некрозов, очаговая лейкоцитарная инфильтрация, изредка по периферии печеночных долек отмечалась жировая инфильтрация гепатоцитов (рис. 2). К 14-м сут-
кам отмечалась организация некротических очагов, но уже появлялись ШИК-позитивные гранулы в гепатоцитах. На 30-е сутки все еще встречались значительные участки гидропической и зернистой дистрофии.
В 3-й серии после 30-минутной ишемии печени и введения мексикора по схеме из 8 животных погибла 1 собака на третьи сутки эксперимента.
Таблица 2
Изменение биохимических показателей у животных 2-3 серии (М±т)
Условия опыта Время после ишемии Фибрино- ген Е Общий белок Мочевина Тимоловая проба
1. Здоровые животные - 3,88±0,18 81,7±2,11 70,1±1,12 3,82±0,29 1,43±0,07
2. Модель ишемии 30 минут 2,64±0,13*1 71,9±2,21 68,5±1,92 4,02±0,43*1 1,37±0,09
3. Модель ишемии; мексикор 3,41±0,12*1,2’3 80,8±1,73 69,3±2,03 3,91±0,18 1,41±0,04
4. Модель ишемии 1 сутки 2,12±0,25*и 58,7±1,39*1,2 61,3±1,29*12 5,73±0,29*1,2 1,46±0,07
5. Модель ишемии; мексикор 3,24±0,17*1-3 76,2±1,26*1-3 67,4±1,23*1-3 4,58±0,33*1-3 1,42±0,09
6. Модель ишемии 3 сутки 2,03±0,15*1,2 44,8±1,28*12 60,2± 1,15 7,51±0,27*12 1,51±0,05
7. Модель ишемии; мексикор 2,97±0,19*1-5 75,2±1,31*1-5 66,2±2,17*1-5 4,84±0,32*1-5 1,49±0,07
8. Модель ишемии 7 сутки 2,11±0,21*12 53,6±1,48*12 67,8±1,11 6,93±0,34*1’2 1,57±0,08
9. Модель ишемии; мексикор 3,15±0,18*1-7 76,9±1,36*1,7 68,2±2,34 3,95±0,21*1 1,45±0,04
10. Модель ишемии 14 сутки 3,46±0,22*1,2 62,4±1,21*12 70,1± 1,68 4,72±0,27*1,2 1,47±0,06
11. Модель ишемии; мексикор 3,74±0,19 80,2±1,15*7 71,3± 1,82 3,87±0,29*п 1,44±0,05
12. Модель ишемии 30 сутки 3,75±0,25 78,8±1,64 72,5± 1,93 3,76±0,31 1,45±0,09
13. Модель ишемии; мексикор 3,87±0,21 82,4±1,37 71,7±1,42 3,81±0,33 1,43±0,07
Примечание: единицы измерения: фибриноген - мг/л, ПТИ -%, общий белок - г/л; мочевина - ммоль/л, тимоловая проба - ед; - цифры рядом со зведочкой указывают, по отношению к показателю какой группы различия достоверны с уровнем значимости р<0,05; п - количество животных в группе; в группах "модель ишемии" п=8; в группах "модель ишемии; мексикор" п=8.
Рис. 1. Ткань печени через 30 минут после ишемии без применения препаратов. Стаз эритроцитов. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 280х.
Рис. 2. Ткань печени на седьмые сутки после ишемии без применения препаратов. Инфильтрация в зоне некроза. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 280х.
Через 30 минут после воздействия ишемии наблюдалось менее значительное изменение показателей аминотрансфераз (табл. 1). На третьи сутки послеоперационного периода отмечаются максимальные изменения изучаемых параметров. Показатели АЛТ, АСТ, ЛДГ вырастали в 3,14;
3.22 и 2,09 раз соответственно, в то же время они ниже значений, полученных при 30-минутной ишемии печени без введения мексикора: АЛТ - в
2.23 раза, АСТ - в 2,16 раза, ЛДГ - в 1,47 раза. К 14-м суткам содержание АЛТ, АСТ, ЛДГ в сыворотке крови снизились в 2,07; 1,74 и 1,93 раза соответственно (в среднем в 1,91 раза) с полной нормализацией к 30-му дню после операции.
При биохимическом исследовании содержания билирубина (табл. 1) наибольший уровень в сыворотке крови был отмечен на третьи сутки наблюдения за оперированными животными, по сравнению с контролем увеличение составляло 1,78 раза. Затем, параллельно с трансаминазами, к 14-м суткам происходило заметное его снижение в 1,61 раза относительно максимальных значений на третьи сутки. К концу эксперимента разницы с нормальными значениями уже не было.
Достоверных изменений холестерина, Р-липопротеидов, щелочной фосфатазы и тимоловой пробы на всех сроках наблюдения не отмечалось (табл. 1, 2).
В то же время наблюдалось незначительное снижение фибриногена, ПТИ и общего белка на протяжении первых семи суток после операции (табл. 2).
Содержание мочевины в сыворотке крови ха-растеризовалось повышением ее уровня в 1,27 раза на третьи сутки с постепенным снижением до нормы к исходу 14-х суток (табл. 2).
Таким образом, все биохимические показатели, начиная с седьмых суток, имели тенденцию положительной динамики вплоть до полной нор-
мализации их значений к 30-м суткам наблюдения.
Морфологические исследования печени показали, что введение мексикора (у животных 3 серии) сопровождалось набуханием гепатоцитов, а в отдельных участках паренхимы печени встречались крупноклеточные инфильтраты. Однако дистрофические и дисциркуляторные расстройства были выражены в меньшей степени, чем во 2 серии, структура долек сохранялась (рис. 3). На протяжении первых трех суток эксперимента в гепатоцитах содержалось умеренное количество ШИК-положительных веществ, явления некроза клеток были редкими и встречались лишь эпизодически. В дальнейшем интенсивно восстановли-вались запасы гликогена. Так уже в период с третьих по седьмые сутки отмечено достаточно высокое его содержание в печеночных клетках. При гистологическом исследовании на 7 сутки очагов мостовидных некрозов не определялось, лейкоцитарная инфильтрация была выражена гораздо слабее. На 14-е сутки количество ШИК-положительных веществ увеличивалось, присутствовали участки гидропической и зернистой дистрофии. На протяжении последующих двух недель продолжалось интенсивное накопление ШИК-положительных веществ и к 30-м суткам только на отдельных участках встречались явления зернистой дистрофии.
Анализируя полученные результаты данной серии исследований, становится ясно, что, хотя обескровливание печени сроком на 30 минут нарушает ее функциональную активность, введение мексикора препятствует развитию выраженных функционально-морфологических изменений, приводит к коррекции биохимических показателей и возвращению их до исходного уровня к 30-м суткам после операции. Таким образом, можно отметить, что мексикор, уменьшая выраженность морфологических изменений и препят-
Рис. 3. Ткань печень на первые сутки после пережатия ПДС и введения мексикора. Сохранение структуры долек. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 280х.
Таблица 3
Изменение биохимических показателей у животных 4 серии (М±т)
№ ия а вт § с £ ° Время после ишемии Т Ч А Т и А Г Л Билирубин яа аз ачн таза ° 1Ф ес а н и в ч о оМ
1. Здоровые животные - 0,74±0,08 0,46±0,06 1,37±0,15 13,46±0,27 2,46±0,29 3,82±0,29
2. Модель ишемии; актовегин 30 минут 1,42 ± 0,06*' 0,75 ± 0,05ч 1,79 ± 0,08ч 18,79 ± 0,64*1 3,16 ± 0,15*J 3,86 ± 0,19*J
3. 1 сутки 2,61 ± 0,08*1,2 1,16 ± 0,08*1,2 2,48 ± 0,12*1,2 23,38 ± 0,76*1,2 3,85 ± 0,17*1,2 4,69 ± 0,26*1,2
4. 3 сутки 3,83 ± 0,24*1-3 2,18 ± 0,13*1-3 3,52 ± 0,19*1-3 26,17 ± 0,94*1-3 3,21 ± 0,14*1-3 4,97 ± 0,32*1-3
5. 7 сутки 3,54 ± 0,14*1-4 1,89 ± 0,12*1-4 3,34 ± 0,18*1-4 24,38 ± 0,66*1-4 2,87 ± 0,13*1-4 4,01 ± 0,29*1-4
6. 14 сутки 1,25 ± 0,19*1-5 1,14 ± 0,06*1-5 1,82 ± 0,13*1-5 19,06 ± 0,43*1-5 2,49 ± 0,24*1-5 3,93 ± 0,25*1-5
7. 30 сутки 0,77 ± 0,05*1-6 0,47 ± 0,07*1-6 1,34 ± 0,11*1-6 14,12 ± 0,82*1-6 2,33 ± 0,25*1-6 3,80 ± 0,23*1-6
Примечание: единицы измерения: АЛТ, АСТ, ЛДГ - ммоль/(ч-л); билирубин - мкмоль/л; щелочная фосфатаза - ммоль/(ч-л), мочевина - ммоль/л; - цифры рядом со зведочкой указывают, по отношению к показателю какой группы различия достоверны с уровнем значимости р<0,05; п - количество животных в группе; в группах "модель ишемии; актовегин" п=8.
ствуя развитию биохимических синдромов поражения гепатоцитов при ишемической аноксии печени, способствовал росту выживаемости животных, уменьшению выраженности биохимических сдвигов и улучшению морфологической картины в послеоперационном периоде.
В четвертой серии экспериментов умерли 3 собаки в первые трое суток.
Биохимические исследования показали, что активность трансаминаз после пережатия ПДС в течение получаса (табл. 3) достоверно увеличивалась по сравнению с исходными данными: АЛТ -в 1,92; АСТ - в 1,63 и ЛДГ - в 1,31 раза, но по сравнению с животными, которым антиоксиданты не вводили, отмечалось снижение цифровых
значений: АЛТ - в 1,37, АСТ - в 1,48, ЛДГ - в 1,17 раза.
На третьи сутки исследуемые показатели увеличились до максимальных цифровых значений (АЛТ - 5,18, АСТ - 4,74, ЛДГ - 2,57 раза), в то же время оставаясь ниже полученных данных в группе опытов без фармакологической поддержки: АЛТ - в 1,35, АСТ - в 1,46 и ЛДГ - в 1,20 раза. На седьмые сутки было зафиксировано некоторое снижение активности, но несмотря на это, она продолжала оставаться на сопоставимой с предыдущими показаниями высоте. К 30-м суткам уровень ферментов приближался к исходным значениям.
Билирубин и мочевина (табл. 3) в ответ на получасовую ишемию через 30 минут реперфузии также отреагировали ростом своих значений: на фоне введения актовегина - в 1,40 и 1,01 раза соответственно, без него - в 1,70 и 1,05 раза. Затем последовало прогрессивное увеличение содержания этих показателей с сыворотке крови, достигая своего максимума к третьим суткам и незначительно снижаясь к концу недели наблюдения, то есть к седьмым суткам использования актовегина выраженной тенденции к снижению вышеуказанных показателей не обнаружило. И лишь в начале второй недели их значения стали уменьшаться, с трудом достигая исходных значений к 30-м суткам.
Достоверных изменений тимоловой пробы, концентрации холестерина и Р-липопротеидов на фоне применения актовегина не было зарегистрировано. Также в послеоперационном периоде несколько снижалось содержание фибриногена, ПТИ и общего белка, но значительных изменений не отмечалось.
Морфологическое исследование у животных 4 серии показали, что через полчаса после восстановления кровотока отмечались выраженные явления зернистой и вакуольной дистрофии и набухание гепатоцитов с ясно различимыми граница-
ми. На протяжении трех суток количество ШИК-положительных веществ снизилось вплоть до минимального с отсутствием на отдельных площадях (рис. 4).
В данной серии экспериментов первые трое суток характеризовались значительным количеством гепатоцитов в состоянии некроза, достаточно четкой выраженностью лейкоцитарной инфильтрации (рис. 5).
На седьмые сутки эксперимента единичные мостовидные некрозы встречались на отдельных участках, отмечалось появление в гепатоцитах ШИК-положительных веществ. К 14-м суткам наблюдали в печеночной ткани организацию некротических очагов и постепенное повышение содержания гликогена, увеличение содержания ШИК-позитивных веществ. На 30-е сутки отмечались отдельные участки зернистой и гидропи-ческой дистрофии, происходило активное накопление гликогена. И все же даже на этом сроке структура гепатоцитов и количество гликогена полностью не восстанавливаются.
Таким образом, применение актовегина для коррекции 30-минутной ишемии печени обеспечивало снижение выраженности цитолитическо-го, холестатического и гепатодепрессивного синдромов. В процессе экспериментальных исследо-
Рис. 4. Ткань печени на первые сутки после пережатия ПДС и введения актовегина. Потеря гликогена. Окраска по Мак-Манусу. Увеличение 500х.
Рис. 5. Ткань печень на третьи сутки после пережатия ПДС и введения актовегина. Некроз гепатоцитов. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 280х.
ваний нами отмечено увеличение содержания ферментов, повышение уровня билирубина, в ткани печени с последующей их длительной стабилизацией. Морфологическая картина говорила о том, что ткань печени не успевала преодолеть последствия 30-минутной ишемии. Анализ данных, полученных в четвертой серии экспериментов, позволяет сделать вывод о том, что применение актовегина не полностью купирует ишемические изменения в паренхиме печени.
В 5 серии экспериментов нами использованы оба препарата по разработанной схеме. Все животные этой серии выжили.
Анализ биохимических исследований показал, что через 30 минут после восстановления кровотока отмечался невыраженный рост показателей цитолитического синдрома: АЛТ в 1,30 раза, АСТ в 1,28 раза, ЛДГ в 1,01 раза по сравнению с контролем. Пик активности ферментов зарегистрирован на третьи сутки: АЛТ в 1,76 раза, АСТ в 2,22 раза, ЛДГ в 1,34 раза, после чего происходило снижение значений. На остальных сроках наблюдения отмечалось достоверное снижение активности трансаминаз. На седьмые сутки регистрировали снижение активности АЛТ в 1,16 раза, АСТ 1,24 в раза, ЛДГ 1,14 в раза с нормализацией этих показателей к 14-м суткам (табл. 4).
Достоверных изменений уровней холестерина, Р-липопротеидов, ЩФ и тимоловой пробы не отмечалось на всех сроках наблюдения.
Тридцатиминутное выключение печени из кровотока сопровождалось также незначительным снижением ПТИ, общего белка и фибриногена без статистически значимых изменений. Содержание билирубина и мочевины повышалось в течение первых трех суток после операции с полным восстановлением к 14-м суткам (табл. 4).
Морфологическое исследование паренхимы печени в данной серии исследований выявило слабо выраженное полнокровие центральных вен с единичными зонами зернистой дистрофии вокруг них. В зоне триад появлялись единичные круглоклеточные инфильтраты, в цитоплазме макрофагов из состава инфильтратов встречались фагоцитарные частицы, а в отдельных случаях -и целые эритроциты, некротических изменений гепатоцитов не было. Содержание гликогена в цитоплазме гепатоцитов на первые сутки после операции снизилось умеренно, что проявлялось незначительным уменьшением количества крупных гранул ШИК-положительных веществ. Содержание гликогена в гепатоцитах было достаточно высоким, быстро увеличивалось количество ШИК-положительных веществ. 14-е сутки после операции характеризовались дальнейшим накоплением гликогена, на данном этапе ткань печени фактически возвратилась к своему исходному состоянию и в последующем практически не отличалась от нормальной.
Анализ параметров артериального давления у исследуемых животных показал, что ишемия тка-
Таблица 4
Изменение биохимических показателей у животных 5 серии (М±т)
№ ия а вт 5 £ £ ° Время после ишемии Т Ч А Т и А Г Л Билирубин Мочевина
1. Здоровые животные - 0,74±0,08 0,46±0,06 1,37±0,15 13,46±0,27 3,82±0,29
2. 30 минут 0,96±0,04*1 0,59±0,07*1 1,39±0,16*1 13,77±0,78*1 3,84±0,28*1
3. Модель 1 сутки 1,28±0,11*1’2 0,71±0,13*1,2 1,57±0,09*1,2 15,08±0,64*12 3,87±0,26*1,2
4. ишемии; 3 сутки 1,30±0,14*1-3 1,02±0,06*1"3 1,83±0,12*1-3 15,12±0,87*1-3 3,91±0,24*1"3
5. мексикор + 7 сутки 1,12±0,13*1-4 0,82±0,08*1"4 1,61±0,06*1-4 13,68±0,63*1-4 3,86±0,30*1-4
6. актовегин 14 сутки 0,75±0,05*1-5 0,47±0,03*1-5 1,39±0,07*1-5 13,47±0,87*1-5 3,83±0,19*1-5
7. 30 сутки 0,73±0,03*1-6 0,45±0,07*1-6 1,35±0,09*1-6 13,46±0,92*1-6 3,82±0,25*1-6
Примечание: единицы измерения: АЛТ, АСТ, ЛДГ - ммоль/(ч-л); билирубин - мкмоль/л; мочевина - ммоль/л; - цифры рядом со зведочкой указывают, по отношению к показателю какой группы различия достоверны с уровнем значимости р<0,05; п - количество животных в группе; в группах "модель ишемии; мексикор+актовегин" п=8.
Таблица 5
Динамика изменения артериального давления у экспериментальных животных (М±т)
Условия опыта Здоровые животные Прекращение кровотока 30 минут реперфузии 1 час после операции 2 часа после операции
Модель ишемии 114,2±1,9 67,4±2,7* 75,1±3,4* 89,3±3,1* 112,5±2,3*
Модель ишемии; актовегин; 114,2±1,9 72,1±1,4* 79,7±2,6* 92,9±1,5* 112,7±1,9*
Модель ишемии; мексикор 114,2±1,9 84,9±1,2* 91,5±1,8* 106,2±1,6* 113,4±1,1*
Модель ишемии; мексикор+актовегин 114,2±1,9 96,8±1,5* 110,4±1,2* 113,7±0,9* 115,2±1,7*
Примечание: единицы измерения - мм рт.ст.; - достоверность различий по сравнению с контролем соответствует уровню значимости р<0,05; п - количество животных в группе; в группах "модель ишемии", "модель ишемии; мексикор", "модель ишемии; актовегин","модель ишемии; мексикор+актовегин" п=8.
ни печени приводила к достоверному снижению АД (табл. 5). Медикаментозная защита печени мексикором и актовегином способствовала раннему восстановлению артериального давления.
Таким образом, проведенное исследование показало, что внутривенное введение мексикора и актовегина по разработанной нами схеме с коррекцией гемодинамики посредством наложения временного экстракорпорального портокавально-го шунта при 30-минутной ишемии печени способствует нормализации биохимических процессов, препятствуя нарушению структуры печеночной паренхимы и развитию цитолитического, хо-лестатического и гепатодепрессивного синдромов. Комплексная противоишемическая защита предотвращает развитие ишемических изменений в органе, что значительно снижает тяжесть возможного поражения печени вследствие кислородного голодания и обеспечивает не только защитный, но и лечебный эффект.
На основании проведённого исследования можно сделать следующие выводы.
1. Внутривенное введение актовегина в суточной дозировке 10 мг/кг в условиях ишемии печени и временного экстракорпорального порто-кавального шунтирования оказывает гепатопро-текторный и антиоксидантный эффект, снижая выраженность биохимических синдромов поражения гепатоцитов, уменьшает активность органоспецифических ферментов.
2. Внутривенное введение мексикора в суточной дозировке 10 мг/кг обладает выраженной антиоксидантной и антигипоксической активностью в условиях длительной ишемии печени (30 минут) и временного экстракорпорального портокавального шунтирования при коррекции ишемического повреждения печени, уменьшает степень структурно-функциональных изменений в органе.
3. Комплексное применение мексикора и ак-товегина по разработанной нами схеме на фоне
временного экстракорпорального портокавально-го шунтирования препятствует развитию деструкции ткани печени и способствует нормализации биохимических показателей крови и артериального давления, позволяет продлить безопасный срок окклюзии ПДС до 30 минут.
ЛИТЕРАТУРА
1. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. - М.: Медицина, 1999. -С. 19-22.
2. Голиков А.П., Давыдов Б.В., Руднев Д.В. и др. Влияние мексикора на окислительный стресс при остром инфаркте миокарда // Кардиология. -
2005. - № 7. - С. 21-26.
3. Голиков А.П., Михин В.П., Полумисков В.Ю. и др. Эффективность цитопротектора мексикора в неотложной кардиологии // Терапевтический архив. -2004. - № 4. - С. 60-65.
4. Ефимова Т.Е. Применение мексикора в комплексном лечении больных сахарным диабетом 2 типа с сосудистыми поражениями нижних конечностей // Поликлиника. - 2007. - № 2. - С. 34-37.
5. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А., За-паднюк Б.В. Лабораторные животные (разведение, содержание, использование в эксперименте). 3-е изд., перераб. и доп. - Киев: Вища школа, 1983. -384 с.
6. Инчина И.В., Смирнов Л.Д., Романов М.Д. и др. Ангиопротекторная активность мексикора при об-литерирующем атеросклерозе артерий нижних конечностей // Ангиология и сосудистая хирургия. -2007. - Т. 13, № 3. - С. 17-20.
7. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина. - 1987. - 365 с.
8. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - 1БВМ 5-900228-55-Х. - М.: Ф. "Слово",
2006. - 553 с.
9. Михин В.П., Голиков А.П., Полумисков В.Ю. и др. Применение кардиоцитопротекторов в неотложной кардиологии // Тегга теШса. - 2006. - № 2. -С. 7-12.
10. Нордвик Б.П. Механизм действия и клиническое применение препарата актовегина // Актовегин. Новые аспекты клинического применения. - М., 2002. - С. 18-24.
11. Оковитый С.В. Клиническая фармакология анти-гипоксантов (часть II) // ФАРМиндекс-Практик, 2004. - № 7. - С. 48-63.
12. Покровский М.В., Пашин Е.Н., Гуманова Н.Г. и др. Влияние антиоксидантов ^510 и резвератрола на регуляторную функцию эндотелия у крыс с моделированной артериальной гипертензией // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. -2007. - Т. 143, № 6. - С. 619-622.
13. Русанов В.П., Погорелов Ю.В., Головнева В.И. Временное портокавальное шунтирование при двухэтапной резекции печени // Хирургия. -1977. - № 9. - С. 20-23.
14. Шнейвайс В.Б., Левин Г.С. Роль свободнорадикального окисления в патогенезе острого некроза печени при висцерально-ишемическом шоке // Па-тол. физиология и эксперим. терапия. - 199б. -№ 2. - С. 39-43.
15. Dagenais G.R., Marhioli R., Yusuf S. et al. Beta-carotene, vitamin C, vitamin E and cardiovascular diseases // Curr. Cardiol. Rep. - 2000. - Vol. 2, N 4. -Р. 293-299.
16. Halliwell B. Antioxidants in human health and disease // Ann. Rev. Nutr. - 199б. - Vol. 1б. - P. 33-50.
17. McLeish P.E. The role of xanthine oxidase and the effects of antioxidants in ishemia reperfusion cell injury // Acta Physiol. Pharmacol. Ther. Latinoam., 2003. - Vol. 49. - P. 13-20.
