CC BY
516
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ И ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ХАКАСИИ
С.В. Водолазова1, М.А. Мяделец2, М.Р. Карпова3, Ю.В. Саранчина1
1Хакасский государственный университет им. Н. Ф. Катанова, Абакан Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН, Новосибирск 3ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Томск
E-mail: [email protected]
ANTIMICROBIC ACTIVITY OF VOLATILE OILS AND WATER EXTRACTS FROM MEDICINAL HERBS OF KHAKASIA
S.V. Vodolazova1, M.A. Myadelets2, M.R. Karpova3, Yu.V. Saranchina1
1Khakasia State University n.a. N.F. Katanov, Abakan 2Central Siberian Botanical Garden of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk
3Siberian State Medical University, Tomsk
Изучена антимикробная активность суммарных извлечений из сырья 23 видов лекарственных растений флоры Хакасии. Антибактериальный эффект разной степени выраженности показали как эфирные масла, так и водные извлечения из изученных растений. Наиболее перспективными для дальнейшего исследования являются эфирные масла из травы Thymus petraeus, Ziziphora clinopodioides, Nepeta nuda, Nepeta sibirica и подземных органов (корневищ с корнями) Coluria geoides, а также водные извлечения 7 видов Губоцветных (Dracocephalum nutans, Glechoma hederacea, Lamium album, Lycopus europaeus, Mentha arvensis, Nepeta nuda, Ziziphora clinopodioides), 1 вида из семейства Астровые (Artemisia annua) и 1 вида из семейства Розоцветные (Coluria geoides). Отгонные воды, получаемые как побочный продукт при перегонке эфирного масла Thymus petraeus, Coluria geoides и Nepeta sibirica, целесообразно подвергать переработке с целью выделения биологически активных веществ с антимикробным эффектом.
Ключевые слова: водные извлечения, эфирные масла, антимикробная активность.
Antibacterial activity of total extraction from raw material of 23 species of Khakasia herbs is investigated. Volatile oils as well as water extraction from the investigated plants have shown different antibacterial effect. The most promising for the further research are volatile oils from grass Thymus petraeus, Ziziphora clinopodioides, Nepeta nuda, Nepeta sibirica and underground bodies (rhizomes with roots) Coluria geoides, and also water extraction of 7 species of Lamiaceae (Dracocephalum nutans, Glechoma hederacea, Lamium album, Lycopus europaeus, Mentha arvensis, Nepeta nuda, Ziziphora clinopodioides), 1 species from family Asteraceae (Artemisia annua) and 1 species from family Rosaceae (Coluria geoides). The waters obtained as a collateral product at distillation of volatile oil Thymus petraeus, Coluria geoides and Nepeta sibirica are expedient to process for producing biologically active substances with antimicrobial effect.
Key words: water extracts, volatile oils, antimicrobial activity.
Введение
Широкое распространение среди патогенных и условно-патогенных микроорганизмов устойчивости к антибиотикам делает актуальным изучение антимикробных свойств препаратов природного происхождения. Фитопрепараты реже, чем традиционные противомикробные средства вызывают формирование резистентных штаммов микроорганизмов. Биологически активные вещества (БАВ) лекарственных растений могут быть эффективным дополнением в комплексной терапии инфекционных заболеваний.
В настоящее время в РФ разрешено использовать в медицинской практике около 320 видов лекарственных растений [20, 21], это очень малая доля из всего биоразнообразия высших растений. В процессе поиска новых перспективных фитопрепаратов важным этапом является изучение фармакологической активности и химического состава лекарственных растений из арсенала народной и традиционной медицины. В этом плане большой интерес представляют растения трех семейств (Lamiaceae, Asteraceae, Rosaceae), используемые в народной медицине коренных жителей Южной Сибири, на которую огромное влияние оказали традиционные системы врачевания, сложившиеся в Монголии, Китае и Тибете. Виды этих семейств, произрастающие на территории Республики Хакасия, находят применение в народной медицине для лечения различных инфекционных заболеваний, ран и ожогов, что предполагает наличие у них антимикробных свойств [4, 11, 13-15]. Из них к эфиромасличным (накапливающим более 1% эфирного масла) относятся виды родов Thymus, Dracocephalum, Mentha, Ziziphora, Schizonepeta, Prunella, Salvia, Artemisia, Coluria. В состав эфирных масел этих растений входят терпеноиды и фенолы, оказывающие выраженное бактерицидное действие: альфа и бета амирины, борнеол, гераниол, карвон, ментол, лина-лоол, пулегон, альфа и бета-пи-нены, тимол, цинеол, эвгенол [4].
Экспериментально установлено антимикробное и антифунгаль-ное действие эфирных масел Ziziphora dinopodioides.
Schizonepetа multifida, Salvia stepposa, Dracocephalum
peregrinum, Artemisia annua; антимикробное и противовоспалительное действие эфирного масла Prunella vulgaris [1, 3, 18, 19].
Остальные виды перечисленных семейств накапливают эфирное масло в небольших и даже следовых количествах. Тем не менее, суммарные извлечения этих видов в эксперименте проявляют жаропонижающее (Amethystea coerulea), антимикробное (Lamium album) и ранозаживляющее (Dr. ruyschiana, L. album,
Рамеппа 1апа1а БиЬБр. а^угасеае, 81асЬуз ра1шШ8) действие [4, 9]. В надземной части большинства из них обнаружены биологически активные вещества, обладающие антимикробным действием: флавоноиды (акацетин, апи-генин, гиперозид, диосметин, диосмин, изокверцетин, кверцетин, кемпферол, астрагалин, лютеолин), фенолы (карвеол), фенолкарбоновые кислоты (ванильная, кофейная, феруловая), кумарины (умбеллиферон, эскулетин), стероиды (бета-ситостерин), иридоиды (гарпагид) и другие [4, 15]. Большинство из них растворимы в воде при нагревании и могут обуславливать антимикробные свойства водных извлечений. В результате анализа доступной литературы для исследований было отобрано 23 вида лекарственных растений (табл. 1).
Цель исследования: оценить антимикробную активность суммарных извлечений из сырья некоторых лекарственных растений флоры Хакасии, используемых в народной медицине.
Материал и методы
Сырье исследуемых растений собирали в степных и луговых фитоценозах на территории Республики Хакасии (РХ) в 2008-2009 гг: надземную часть в фазу цветения, подземные органы после плодоношения. Список исследованных видов и комплексов БАВ приведен в таблице 1. Для С. geoides исследуемым сырьем определили подземные органы (корневище с корнями), так как именно в них у этого растения локализовано эфирное масло
[4].
В качестве препаратов сравнения при изучении антимикробных свойств использовали эфирное масло и
Таблица 1
Список исследованных видов растений
№ п.п. Виды растений Исследуемый комплекс БАВ
1 Origanum vulgare L. - Душица обыкновенная Dracocephalum discolor Bunge - Змееголовник двуцветный Dracocephalum peregrinum L. - Змееголовник иноземный Nepeta sibirica L. - Котовник сибирский N. nuda L. - Котовник голый Salvia stepposa Shost. -Шалфей степной Thymus petraeus Serg. - тимьян каменный Ziziphora clinopodioides Lam. - Зизифора клиноподиевидная Artemisia annua L. - Полынь однолетняя Эфирное масло и водное извлечение из надземной части (травы)
г Amethystea caerulea L. - Аметистея голубая Dracocephalum nutans L. - Змееголовник поникший Dracocephalum ryshiana L. - Змееголовник Руйша Galeopsis speciosa Miller - Пикульник красивый Glechoma hederacea L. - Будра плющевидная Lamium album L. - Яснотка белая Leonurus tataricus L. - Пустырник татарский Lycopus europaeus L. - Зюзник европейский Mentha arvensis L. - Мята полевая Panzerina lanata (L.) subsp. argyraceae (Kuprian.) Krestovsk. - Панцерина серебристая Phlomis tuberosa L. - Зопник клубненосный Prunella vulgaris L. - Черноголовка обыкновенная Водное извлечение из надземной части (травы)
3 Coluria geoides (Pall.) Ledeb. - Колюрия гравилатовидная Эфирное масло и водное извлечение из подземной части (корневищ с корнями)
водное извлечение из сырья официального лекарственного растения - травы Душицы обыкновенной (Herba Origani), антимикробная активность которых уже известна [3-5, 8, 9].
Сырье высушивали на воздухе при температуре 2535 °С до воздушно-сухого состояния. Водные извлечения из растительного сырья получали в асептических условиях по методике Государственной Фармакопеи XI издания (1989 г.), выпаривали досуха, добавляли к питательной среде в дозе 3, 6, 12 и 24 мг/мл. Эфирные масла получали методом гидродистилляции из воздушно-сухого сырья при помощи аппарата Клевенджера в течение 3 ч [2]. В процессе получения эфирного масла также собирали отгонные воды.
Для изучения антимикробной активности использовали суточные культуры микроорганизмов музейных штаммов, рекомендованных Государственной Фармакопеей XI издания (1989 г.) - Staphylococcus aureus АТСС 6538-P (FDA 209-P) и Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453. Микробная нагрузка составляла 0,5 млн клеток/мл (по стандарту мутности). Изучение антимикробной активности эфирного масла проводили диско-диффузионным методом [2]. Для проведения исследования готовили взвесь, содержащую стандартное количество жизнеспособных клеток бактерий, которую засевали газоном на поверхность питательного агара в чашки Петри. На стерильные диски из фильтровальной бумаги наносили
0,01 мл свежеотогнанного эфирного масла или отгонной воды. Диски с препаратами накладывали на посев на расстоянии 2,5 см от центра чашки по кругу (на одну чашку 5 дисков). Посевы инкубировали 18-20 ч при 36 °С. После инкубации на фоне равномерного бактериального газона вокруг дисков образовывались зоны полного (бактерицидного действия) и частичного (бактериостатичес-кого действия) подавления роста круглой формы. Учет результатов осуществляли путем измерения диаметра бактерицидной и бактериостатической зон.
Антимикробные свойства водных извлечений оценивали методом разведения в питательном бульоне [16] в концентрации от 3 до 24 мг/мл. Посевы бактерий инкубировали при температуре 36 °С в течение 24 ч. Отсутствие роста микроорганизмов уточняли последующим контрольным посевом на питательный агар. За минимальную подавляющую концентрацию принимали дозу извлечения, полностью угнетающую рост тест-микроорганизмов.
Результаты и обсуждение
Результаты представлены в виде среднего арифметического значения и доверительного интервала по данным шести экспериментов. Наличие различий между антимикробной активностью исследуемых растений оценивали с помощью критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при достижении 1% уровня значимости.
На первом этапе исследования были изучены антимикробные свойства эфирных масел, полученных из надземной части 9 видов растений: змееголовников двуцветного (D. discolor) и иноземного (D. рeregrinum), котовников сибирского (N. sibirica) и голого (N. nuda), шалфея
степного (S. stepposa), зизифоры клиноподиевидной (Z. clinopodioides), полыни однолетней (A. annua), тимьяна каменного (T. petraeus) и корневищ с корнями колю-рии гравилатовидной (C. geoides). Результаты изучения антимикробной активности эфирных масел методом приведены в таблице 2.
Все исследуемые эфирные масла оказались активны в отношении S.aureus, причем по бактерицидному эффекту эфирные масла T. petraeus, Z. clinopodioides, N. nuda, C. geoides и N. sibirica достоверно превосходили препарат сравнения: диаметр зоны их бактерицидного действия составил 5,2±0,23; 4,5±0,19; 4,1±0,38; 3,6±0,23 и 3,0±0,38 см соответственно. Бактериостатические зоны всех исследуемых эфирных масел также оказались больше, чем у препарата сравнения. Максимальными оказались значения для эфирных масел A. annua (6,0±0,14 см), T. petraeus (5,9±0,26), Z. clinopodioides (5,4±0,24).
В отношении P. aeruginosa эфирные масла исследуемых растений оказались менее эффективными. Четыре исследуемых образца (эфирные масла C. geoides, N. sibirica, T. petraeus и N. nuda) достоверно превосходили бактерицидное действие эфирного масла O. vulgare (0,7±0,15).
Максимальный эффект проявили эфирные масла
C. geoides и N. sibirica (диаметр бактерицидной зоны составил 3,7±0,23 и 2,9±0,20 см), эти же эфирные масла проявили и бактериостатическое действие.
Эфирные масла из лекарственных растений нашли широкое применение в медицине, в то время как отгонные воды (собирающиеся в приемнике аппарата Клевенджера после отделения эфирного масла) обычно не используются. В случае обнаружения фармакологической активности отгонные воды можно было бы применять согласно принципам рационального использования растительного сырья. С этой целью мы провели изучение антимикробного эффекта отгонных вод (табл. 2, 3).
В эксперименте отгонные воды O. vulgare проявили бактерицидную активность в отношении золотистого стафилококка (1,3±0,18 см) и бактериостатическую активность в отношении золотистого стафилококка и синегнойной палочки (1,9±0,15 и 0,7±0,14 см соответственно). Достоверно в отношении S. аureus превосходила эти значения антимикробная активность отгонных вод N. sibirica (5,1±0,20 см бактерицидная и 6,1±0,28 см бак-териостатическая зона) и C. geoides (бактериостатичес-кая зона 2,6±0,17 см). Антимикробная активность отгонных вод исследуемых видов в отношении P. aeruginosa оказалась менее выраженной. Бактерицидное действие проявили отгонные воды 6 образцов сырья, максимальным оно оказалось для отгонных вод T. petraeus (1,7±0,17 см). Достоверно превосходили бактериостатическое действие препарата сравнения отгонные воды C. geoides, T. petraeus и S. stepposa (3,4±0,19; 2,1±0,16 и 1,5±0,19 см соответственно). Антимикробное действие отгонных вод исследуемых растений можно объяснить тем, что в процессе гидродистилляции некоторые биологически активные вещества растений (лактоны, фенольные соединения) могут подвергаться возгонке и попадать в отгонные воды, а также гидрофильностью некоторых компонентов эфирного масла.
Антимикробная активность эфирных масел, обуслов-
Таблица 2
Антимикробная активность эфирных масел и отгонных вод из сырья исследуемых растений в отношении тест-культуры Staphylococcus aureus
№ п.п. Вид Диаметр бактерицидной (1) и бактериостатической (2) зоны,см
Эфирные масла Отгонные воды
1 2 1 2
1 Origanum vulgare 1,3+0,25 1,7+0,12 1,3+0,18 1,9+0,15
2 Dracocephalum discolor 1,5+0,38 1,8+0,15 0,9+0,19 0
3 D. peregrinum 1,9+0,19 3,7+0,19* 0,8+0,18 1,5+0,30
4 Nepeta sibirica 3,0+0,38* 3,3+0,26* 5,1+0,20* 6,1+0,28*
5 N. nuda 4,1+0,38* 4,5+0,33* 0,9+0,17 1,9+0,24
6 Salvia stepposa 1,9+0,17 2,1+0,19 1,0+0,15 1,7+0,19
7 Ziziphora clinopodioides 4,5+0,19* 5,4+0,24* 0 0,7+0,12
8 Thymus petraeus 3* ,2 0, + ,2 5, 5,9+0,26* 1,1+0,21 2,2+0,19
9 Artemisia annua 1,7+0,13 6,0+0,14* 0 0
10 Coluria geoides 3,6+0,23* 4,6+0,22* 1,6+0,22 2,6+0,17*
Примечание: 1 - зона бактерицидного действия; 2 - зона бактериостатического действия; * - отличие от антимикробной активности БАВ Origanum vulgare достоверно.
Таблица 3
Антимикробная активность эфирных масел и отгонных вод из сырья исследуемых растений в отношении тест-культуры Pseudomonas aeruginosa
№ п.п. Вид Диаметр бактерицидной (1) и бактериостатической (2) зоны, см
Эфирные масла Отгонные воды
1 2 1 2
1 Origanum vulgare 0,7+0,15 0 0 0,7+0,14
2 Drara:ephalum discolor 0,9+0,19 0 0,7+0,23 1,0+0,16
3 D. peregrinum 0 0 0 0,8+0,25
4 Nepeta sibirica 2,9+0,20* 3,9+0,20* 0,9+0,20 1,1+0,25
5 N. nuda 1,3+0,22* 0 0 1,0+0,14
6 Salvia stepposa 0 0 0,8+0,13 19* 0, + ,5
7 Ziziphora clinopodioides 0,8+0,17 00,8+0,19 1,0+0,20
8 Thymus petraeus 13* 0, + ,8 0 1,7+0,17 2,1+0,16*
9 Artemisia annua 0,7+0,13 0 0 0
10 Coluria geoides 3,7+0,23* 7,2+0,15* 1,3+0,19 3,4+0,19*
Примечание: 1 - зона бактерицидного действия; 2 - зона бактериостатического действия; * - отличие от антимикробной активности БАВ Origanum vulgare достоверно.
ленная компонентами ароматической и терпеноидной структуры, общеизвестна. Чистые эфирные масла растений являются не очень удобными фитопрепаратами и используются, в основном, в составе лекарственных форм для наружного применения. К тому же они очень нестабильны при хранении. Кроме того, применение таких препаратов характеризуется рядом существенных недостатков: раздражающее действие, способность вызывать аллергические реакции, расстройства функций желудочно-кишечного тракта, поэтому в настоящее время активно разрабатываются и исследуются различные фитоэкстракционные препараты, представляющие собой суммарные извлечения из лекарственного растительного сырья. Создание фитоэкстракционных препаратов выгодно с точки зрения экономичности и рациональности использования растительного сырья, позволяет обеспечить максимальный выход биологически активных веществ [17].
В последние годы активно проводится изучение антимикробного действия водно-спиртовых и водных извлечений из лекарственного растительного сырья, содержащих БАВ различных классов (полифенолы, полисаха-
риды, сесквитерпеновые лак-тоны, фенилпропаноиды). Так, обнаружена бактериостати-ческая активность у водного извлечения из травы череды трехраздельной [12], установлены бактерицидные свойства в отношении S. aureus и P. aeruginosa экстрактов и отваров из коры дуба, цветков и листьев зверобоя продырявленного, почек сосны, надземной части восковницы обыкновенной [6, 7]. В качестве экстрагента рациональнее использовать воду, так как она способствует лучшему сепарированию тканей и разрыву клеточных стенок экстрагируемого сырья, облегчая тем самым течение диффузионного процесса [10]. В связи с этим следующим этапом исследования явилось изучение антимикробной активности водных извлечений из сырья 23 видов лекарственных растений в отношении S. aureus.
В результате анализа установили, что водные извлечения всех исследуемых видов растений в разной степени обладают антимикробной активностью. Максимальную активность, такую же, как препарат сравнения, проявили водные извлечения из сырья C. geoides и D. nutans (бактерицидная доза - 3 мг/мл). В дозе 6 мг/мл бактерицидное действие проявили извлечения из сырья 7 видов: A. annua, G. hederacea, Z. clinopodioides, L. europaeus, N. nuda, M. arvensis, L. album. Водные извлечения остальных исследуемых видов растений проявили слабую антимикробную активность: бактерицидная доза 11 образцов (из сырья A. coerulea, N. sibirica, D. discolor, D. peregrinum,
D. ruyschiana, G. speciosa, L. tataricus, P. lanata subsp. аrgyracea, P. tuberosa, S. palustris, T. petraeus) составила 13 мг/мл; бактерицидная доза водных извлечений
S. multifida и P. vulgaris - 25 мг/мл.
Заключение
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что эфирные масла и водные извлечения из изученных нами 23 лекарственных растений флоры Хакасии обладают противомикробным эффектом разной степени выраженности. Для дальнейшего изучения можно считать наиболее перспективными эфирные масла из травы T. petraeus, Z. clinopodioides, N. nuda, N. sibirica и подземных органов (корневищ с корнями) C. geoides. Кро-
ме того, при получении эфирного масла T. petraeus, C. geoides и N. sibirica целесообразно сохранять и использовать отгонные воды, которые обладают выраженным бактериостатическим, а в отдельных случаях и бактерицидным эффектом. В качестве перспективных источников биологически активных веществ антимикробного действия, извлекаемых водой, могут использоваться 7 видов Губоцветных (D. nutans, G. hederacea, L. album, L. europaeus, M. arvensis, N. nuda, Z. clinopodioides), 1 вид из семейства Астровые (A. annua) и 1 вид из семейства Розоцветные (C. geoides).
Литература
1. Винюков ДД., Яковлева М.П. Изучение антибактериальной активности эфирных масел полыни однолетней и тысячелистника // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сборник научных трудов Пятигорской гос. фарм. академии. - Пятигорск, 2005. -Вып. 60. - С. 313-314.
2. Государственная фармакопея СССР : XI изд. - М. : Медицина, 1987-1990. - Вып. 1, 2. - 328, 400 с.
3. Делова Г.В., Гуськова И.Н. Антибактериальные и антифун-гальные свойства эфирных масел некоторых видов губоцветных // Комплексное изучение полезных растений Сибири. - Новосибирск : Наука, 1974. - С. 131-146.
4. Дикорастущие полезные растения России / отв. ред. А.Л. Буданцев, Е.Е. Лесиовская. - СПб. : Изд-во ОТХФА, 2001.
- 663 с.
5. Казаринова Н.В., Ткаченко К.Г., Музыченко Л.М. и др. Компонентный состав и антибиотическая активность эфирного масла Origanum vulgare L., произрастающей в некоторых регионах Западной Сибири // Раст. ресурсы. - 2002. -Вып. 2. - С. 99-103.
6. Кашина А.А., Гурина С.В., Яковлев Г.П. Антимикробная активность эфирного масла и извлечений из надземной части Myrica gale (Myrycaceae) // Раст. ресурсы. - 2009. -Вып. 2. - С. 127-130.
7. Колесников А.Г. Бактерицидные и иммунокоррегирующие свойства некоторых растительных экстрактов // Микробиология и эпидемиология. - М. : Медицина, 1986. - С. 7478.
8. Кузнецова В.А., Рыбачук И.З. Фармакогнозия. - М. : Медицина, 1993. - 448 с.
9. Кумышева Л.А. Противовоспалительная и антибактериальная активность некоторых лекарственных растений и их сборов - перспективных мукозопротекторов // Раст. ресурсы. - 2009. - Вып. 1. - С. 126-139.
10. Лысянский В.М., Гребенюк С.М. Экстрагирование в пищевой промышленности. - М. : Агропромиздат, 1987. - 187 с.
11. Махов А.А. Зеленая аптека : лекарственные растения Красноярского края. - Красноярск : Кн. изд-во, 1986. - 352 с.
12. Микаэлян А.С., Оганесян Э.Т., Степанова Э.Ф. и др. Состав и биологические свойства полифенолов череды трехраздельной // Фармация. - 2008. - № 1. - С.33-35.
13. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири. - Новосибирск : Наука, 1991. - 410 с.
14. Никифоров Ю.В. Алтайские травы-целители. - Горно-Алтайск : Юг-Сюмер-Белуха, 1992. - 208 с.
15. Растительные ресурсы СССР : цветковые растения, их химический состав, использование семейства Hippuridaceae-Lobeliaceae. - СПб. : Наука, 1991. - 200 с.
16. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Медицина, 2005. - 32 с.
17. Самылина И.А., Блинова О.А., Кумышева Л.А. и др. Перспективы создания сухих экстрактов // Фармация. - 2006. -№ 2. - С. 43-47.
18. Сульдина А.Ф., Ефремов А.А, Рябков И.А. и др. Бактерицидная активность эфирных масел некоторых дикорастущих растений Сибири // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья : мат. II Всероссийской конференции. - Барнаул : Изд-во Алт. ун-та, 2005.
- Кн. 2. - С. 482-488.
19. Шалдаева Т.М. Содержание флавоноидов и антимикробная активность некоторых видов рода Artemisia L. // Мат. докл. VII Межд. симпозиума по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 19-23 октября 2009 г.). - 2009. - С. 283-284.
20. Растения для нас : справочное издание / под ред. Г.Л. Яковлева и К.Ф. Блиновой. - СПб. : Учебная книга, 1996. - 653 с.
21. Регистр лекарственных средств России / под ред. Ю.Ф. Крылова. Изд-е 5-е, перераб. и доп. - М. : Ремако, 1998. - 879 с.
Поступила 15.04.2011
