CC BY
32
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.82:612.821.6:612.822.5
АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СОЕДИНЕНИЯ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПИЯВИТ® НА УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНУЮ ПАМЯТЬ, НЕЙРОНО-ГЛИАЛЬНЫЕ СООТНОШЕНИЯ ГИППОКАМПА И НЕОКОРТЕКСА МОЗГА КРЫС
Н.А. Логинова*, Н.А. Тушмалова, И.П. Баскова, Е.Б. Воеводина, В.Н. Мац*, Н.В. Пасикова*
(кафедра высшей нервной деятельности, лаборатория эволюции механизмов памяти; e-mail: [email protected])
В данном исследовании был выявлен мнемотропный эффект в действии Пиявита® — биологически активного соединения природного происхождения — на формирование у крыс условного рефлекса активного избегания. Морфологические изменения в нейроно-глиаль-ном комплексе и капиллярах головного мозга при введении Пиявита® в неокортексе и гип-покампе были разнонаправленными. Предполагается, что улучшение формирования памяти на фоне введения Пиявита® связано с изменением метаболизма в нервной ткани.
Ключевые слова: пиявит, память, морфометрический анализ, моторная кора, гиппокамп.
Данная работа выполнена в рамках концепции Н.А. Тушмаловой об эволюционно-молекулярных основах памяти и посвящена исследованию влияния биологически активных соединений природного происхождения на регуляцию формирования памяти [1]. Пиявит® является соединением метаболического типа действия, полифункциональное действие которого связано с содержащимся в нем секретом слюнных желез, который вызывает увеличение синтеза оксида азота в эндотелиальных клетках капилляров [2]. В нервной системе гирудин, входящий в состав Пиявита®, может действовать через рецепторы PARs (protease-activated receptors), которые экспрессируются на нейронах и глии в коре, гиппокампе, амигдале и других структурах [3]. Секрет слюнной железы, входящий в состав Пияви-та®, вызывает изменение степени метилирования ДНК [4], которое является одним из механизмов регуляции экспрессии генов [5, 6]. В аспекте участия Пиявита® в формировании и сохранении памяти [7] весьма важно подчеркнуть, что ранее нами в совместных функционально-молекулярных исследованиях в рамках развития гипотезы параллельного кодирования памяти [8] было обнаружено повышение степени метилирования ДНК мозга крыс, отражающее феномен условно-рефлекторной памяти [9]. Важно подчеркнуть, что эти изменения были структурно специфичны и максимально выражены в гиппокампе по сравнению с корой и мозжечком [9, 10].
Чтобы оценить действие препарата на функции нервной системы наиболее оптимальным является комплексный подход к исследованию структурных и функциональных перестроек в организме.
В процессах формирования памяти ведущая роль принадлежит гиппокампу и коре больших полушарий головного мозга [11—15]. Изменение нейроно-глиальных соотношений, состояние триады "ней-рон—глия—сосуд" рассматриваются как отражение функциональной активности различных структур в головном мозге [16—22].
В настоящей работе исследовали влияние Пиявита® в дозе 100 мг/кг на формирование у крыс условного рефлекса активного избегания как модели ассоциативной памяти и анализировали изменения нейроно-глиальных соотношений и плотности капилляров в V слое моторной коры и поля СА3 дорзального гиппокампа.
Материалы и методы
Работа проведена на 43 крысах-самцах линии Вистар массой 200—220 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Животные были разделены на 4 группы, у них вырабатывали условный рефлекс активного избегания (УРАИ) на фоне введения физиологического раствора (группа УРАИ + ФР, п = 13) или Пиявита® в дозе 100 мг/кг (группа УРАИ + П100, п = 10) либо не вырабатывали рефлекса (группа активного контроля — КОНТР), но
* Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, лаборатория функциональной нейроцитологии.
при этом им хронически вводили физиологический раствор (группа КОНТР + ФР, п = 10) или Пия-вит® в дозе 100 мг/кг (группа КОНТР + П100, п = 10). Препараты начинали вводить за 5 дней до начала эксперимента и продолжали введение до его окончания. Раствор для внутрибрюшинных инъекций готовили, используя лиофилизированный порошок из медицинской пиявки (Штийо medicinalis Ь.) (ООО Научно-внедренческая фирма "Гируд И.Н.", регистрационный № 000363/022001). Навеску порошка растворяли в физиологическом растворе из расчета 100 мг на 1 кг веса животного. Полученную смесь помещали в термостат при 37° на 40 мин, затем центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант использовали для внутрибрюшинного введения [23].
Выработку условного рефлекса активного избегания проводили в челночной камере по стандартной методике в течение 5 и более сеансов (по 20 предъявлений в каждом). Опыт протекал по следующей схеме: включали условный раздражитель (звук) и через 10 с — безусловный (ток, сила тока — 0,2—1 мА). Перемещение животного в другую половину камеры выключало оба стимула. Межсигнальный период равнялся 25—30 с. Регистрировали латентный пе-
риод совершения реакции, на основании которого вычисляли коэффициент обучения [24, 25], который характеризует прочность памятного следа:
Пп = (1/20)2(10 - |
где ^ — время (в секундах) от начала подачи условного стимула (звук) до перехода крысы в другую часть камеры или до конца действия безусловного стимула (ток); | — номер предъявления условного стимула (звука), п — эксперимент в п-й день.
После окончания поведенческих экспериментов животных декапитировали, головной мозг фиксировали в 4%-м растворе формалина на фосфатном буфере (рН = 7,2—7,4), получали фронтальные срезы и окрашивали по методу Ниссля. Затем проводили морфометрический анализ нейроно-глиальных соотношений в V слое моторной коры (рис. 1, А) и поле СА3 дорзального гиппокампа (рис. 1, Б). Подсчет числа нейронов и глии проводили на случайно выбранных полях зрения площадью 0,0144 мм2 при увеличении 640 раз, а количества капилляров — на случайно выбранных полях зрения площадью 0,016 мм2 при увеличении в 320 раз. Анализировали плотность распределения нейронов, свободной и сателлитной глии, капилляров (рис. 1, В), вычис-
Рис. 1. Фотография атласа головного мозга крысы: А — фронтальный срез мозга крысы (bregma 1,60 мм), заштрихованная область — V слой моторной коры, Б — фронтальный срез мозга крысы (bregma —3,14 мм), заштрихованная область — поле СА3 дорзального гиппокампа. В — микрофотография фрагмента фронтального среза V слоя моторной коры крысы; окраска по методу Ниссля, ув. 640: об. 40, ок. 16; 1 — нейрон, 2 — сателлитная глия, 3 — свободная глия, 4 — капилляр
ляли глиальный индекс (отношение количества глии к числу нейронов).
Статистический анализ данных поведенческих экспериментов проводили с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни для независимых признаков, а данные морфометрических исследований — с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ЛКОУЛ с последующим сравнением по критерию Ньюмана—Кеулса. Уровень р < 0,05 считался статистически значимым, а р < 0,1 — как тенденция.
Результаты и обсуждение
При исследовании действия препарата Пиявит® в дозе 100 мг/кг на выработку у крыс условного рефлекса активного избегания было выявлено, что в 1-м сеансе величина коэффициента в группе УРАИ + П100 выше (—1,5 ± 0,7), чем в контроле УРАИ + ФР (-4,4 ± 0,7) (р < 0,05). Во 2-м сеансе коэффициент обучения в группе УРАИ + П100 выше, чем в контроле УРАИ + ФР (0,9 ± 0,9 и -2,0 ± 1,4 соответственно, р < 0,1 — тенденция), так же, как и в 4-м и 5-м сеансах (р < 0,1 — тенденция) (рис. 2).
Таким образом, введение Пиявита® в дозе 100 мг/кг ускоряло формирование памяти, что выражалось в увеличении коэффициента обучения по сравнению с контрольной группой животных. Эти данные согласуются с предыдущими исследованиями, в которых было показано улучшение сохранности памятного следа на модели условного рефлекса пассивного избегания [7].
После выработки у крыс условного рефлекса активного избегания в У слое моторной коры и поле СА3 дорзального гиппокампа анализировали изменение нейроно-глиальных соотношений (рис. 3) и плотности капилляров (рис. 4). При анализе морфо-метрических показателей учитывали влияние факторов обучения, вводимого препарата, а также сочетание этих факторов.
4,0
0,0
* V - ■ Л ' ........1 -1 \ I [ X
о-р•' 21- 40^-^41 -60 61-80 81 -100 >100 -УРАИ+ФР -УРАИ+П100
-6,0
Рис. 2. Динамика выработки условного рефлекса активного избегания (УРАИ) на фоне введения физиологического раствора (УРАИ + ФР) и Пиявита® в дозе 100 мг/кг (УРАИ+П100). По оси абсцисс — номера предъявлений, по оси ординат —
величина коэффициента обучения. *р < 0,05, Л — р < 0,1 — по сравнению с группой УРАИ + ФР, непараметрический критерий Манна—Уитни для независимых признаков
Рис. 3. Величина глиального индекса на единицу площади среза в У слое моторной коры и поле СА3 дорзального гиппокампа крыс в контроле на фоне введения физиологического раствора (КОНТР + ФР) и Пиявита® в дозе 100 мг/кг (КОНТР + П100), а также при выработке условного рефлекса активного избегания (УРАИ) на фоне введения физиологического раствора (УРАИ + + ФР) и Пиявита® в дозе 100 мг/кг (УРАИ + П100). По оси абсцисс — структуры мозга, по оси ординат — величина гли-
ального индекса. ** — р < 0,001, *** — р < 0,0001 — по сравнению с группой КОНТР + ФР, # — р < 0,05, ## — р < 0,001 — по сравнению с группой КОНТР + П100, л — р < 0,05, лл — р < 0,001 — по сравнению с группой УРАИ + ФР, двухфакторный дисперсионный анализ ЛКОУЛ с последующим сравнением по критерию Ньюмана—Кеулса
Рис. 4. Количество капилляров на единицу площади среза в У слое моторной коры и поле СА3 дорзального гиппокампа крыс в контроле на фоне введения физиологического раствора (КОНТР + ФР) и Пиявита® в дозе 100 мг/кг (КОНТР + П100), а также при выработке условного рефлекса активного избегания (УРАИ) на фоне введения физиологического раствора (УРАИ + ФР) и Пиявита® в дозе 100 мг/кг (УРАИ + П100). По оси абсцисс — структуры мозга, по оси ординат — плотность капилляров. * — р < 0,05 — по сравнению с группой КОНТР + ФР, # — р < 0,05 — по сравнению с группой КОНТР + П100, Л — р < 0,05 — по сравнению с группой УРАИ + ФР, двухфактор-ный дисперсионный анализ ЛМОУЛ с последующим сравнением по критерию Ньюмана—Кеулса
Было показано, что на величину глиального индекса в V слое моторной коры оказывает влияние фактор обучения (F(1,1644) = 4,24, p < 0,05), а также сочетание факторов обучения и введения препарата: F (1,1644) = 5,07, p < 0,05. При обучении в группе УРАИ + ФР происходило увеличение глиального индекса (1,32 ± 0,03) по сравнению с группой необученных крыс КОНТР + ФР (1,08 ± 0,03) (p < 0,001), что согласуется с данными литературы [17—19]. У обученных крыс в группе УРАИ + П100 величина глиального индекса снижалась (1,15 ± 0,03) по сравнению с группой УРАИ + ФР (p < 0,05), но не изменялась по сравнению с необученными животными (рис. 3), что может быть объяснено анти-пролиферативным эффектом Пиявита® [23].
Введение препарата вызывало изменение величины глиального индекса в поле СА3 дорзально-го гиппокампа: F (1,962) = 24,23, p <0,0001. Введение Пиявита® необученным животным приводило к увеличению глиального индекса в гиппокампе (0,83 ± 0,02) по сравнению с группой КОНТР + ФР (0,70 ± 0,02) (p < 0,0001) (рис. 3). Различия в реакции нейроно-глиального комплекса в коре и гип-покампе в ответ на введение Пиявита® могут быть объяснены большей экспрессией рецепторов PAR именно в гиппокампе [3], через которые путем изменения концентрации эндогенного тромбина [26] может действовать Пиявит®. Обучение приводило к увеличению глиального индекса в группе крыс УРАИ +ФР (0,85 ± 0,02) по сравнению с группой КОНТР + ФР (0,70 ± 0,02) (p < 0,0001). Как и в коре, в гиппокампе глиальный индекс в группе УРАИ + + П100 снижался (0,72 ± 0,02) по сравнению с группами крыс КОНТР + П100 (0,83 ± 0,02) (p < 0,001) и УРАИ + ФР (0,85 ± 0,02) (p < 0,001) (рис. 3).
Плотность капилляров в V слое моторной коры у крыс изменялась при обучении (F (1,756) = 9,50, p < 0,01) и введении препарата (F (1,756) = 13,53, p < 0,001). Обучение приводило к снижению количества капилляров в группе УРАИ + ФР (2,09 ± ± 0,08) по сравнению с группами КОНТР + ФР (2,46 ± 0,09) (p < 0,05) и КОНТР + П100 (2,68 ± 0,08) (p < 0,001) (рис. 4). Введение Пиявита® на фоне обучения приводило к увеличению количества капилляров (2,51 ± 0,1) по сравнению с контрольной груп-
пой УРАИ + ФР (2,09 + 0,08) (p < 0,05) (рис.4). На количество капилляров в гиппокампе оказывал влияние фактор введения Пиявита® (F (1,796) = = 26,60, p < 0,0001). У необученных животных введение Пиявита® вызывало увеличение количества капилляров (2,24 ± 0,07) по сравнению с группой крыс КОНТР + ФР (1,89 ± 0,07) (p < 0,05). В группе УРАИ + П100 количество капилляров увеличивалось (2,39 ± 0,07) по сравнению с группами КОНТР + ФР (1,89 ± 0,07) (p < 0,05) и УРАИ + ФР (2,02 ± 0,07) (p < 0,05) (рис. 4). Таким образом, снижение плотности капилляров при выработке рефлекса нивелировалось введением Пиявита®. Увеличение плотности капилляров на фоне введения Пи-явита® может быть связано с влиянием секрета слюнных желез на активацию NO-синтазы, как это было показано на культуре эндотелиальных клеток человека (HUVEC) [2].
Итак, было получено, что Пиявит® улучшает выработку условного рефлекса активного избегания на первых этапах обучения, что согласуется с предыдущими исследованиями [7]. Морфометри-ческий анализ, проведенный в V слое моторной коры и поле СА3 дорзального гиппокампа показал, что введение Пиявита® необученным животным вызывает увеличение глиального индекса и плотности капилляров только в гиппокампе, что может быть связано с различной плотностью рецепторов PAR [3, 26], через которые может действовать тромбин, концентрацию которого изменяет гирудин — основной компонент препарата [23]. В то же время введение Пиявита® при обучении вызывает снижение глиального индекса как в гиппокампе, так и в коре, что может быть связано с антипро-лиферативным действием препарата [25], а увеличение плотности капилляров в этих структурах — с активацией синтеза NO-синтазы в эндотелиаль-ных клетках капилляров [2] (одного из механизмов ангиогенеза [27]).
Таким образом, мы предполагаем, что улучшение формирования памяти на фоне введения Пия-вита® может быть обусловлено воздействием компонентов препарата на микроциркуляторное русло неокортекса и гиппокампа.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Тушмалова H.A., Прагина Л.Л. Эволюционно-мо-лекулярный принцип индикации мнемотропных свойств биологически активных соединений природного происхождения // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 2002. № 3. С. 3—6.
2. Баскова И.П., Алексеева А.Ю., Вейко H.H. Секрет слюнных желез медицинской пиявки стимулирует синтез NO в культуре эндотелиальных клеток человека (HUVEC) // Всерос. конф. с междунар. участием "Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению". М., 2009. С. 8—9.
3. Striggow F., Riek-Burchardt M, Kiesel A., Schmidt W, Henrich-Noack P., Breder J., Krug M., Reymann K.G., Reiser G. Four different types of protease-activated receptors are widely expressed in the brain and are up-regulated in hippocampus by severe ischemia // European J. of Neuroscience. 2001. Vol. 14. N 4. P. 595-608.
4. Никонов Г.И., Романенко Е.Б., Ванюшин Б.Ф., Баскова И.П. Влияние препаратов из пиявок Hirudo medici-nalis на метилирование ДНК печени крыс // Биол. науки. 1990. № 4. С. 21-25.
5. Ванюшин Б.Ф. Энзиматическое метилирование ДНК — эпигенетический контроль за генетическими функциями клетки // Биохимия. 2005. Т. 70. Вып. 5. С. 598—611.
6. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes and Development. 2002. Vol. 16. P. 6—21.
7. Тушмалова H.A., Прагина Л.Л., Баскова И.П., Ба-санова А.В, Завалова Л.Л. Улучшение выработки и воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания у крыс под влиянием пиявита // Журн. высш. нервн. деят. 2001. Т. 51. № 2. С. 252—253.
8. Тушмалова Н.А. Гипотеза параллельного кодирования памяти // Биол. науки. 1973. № 6. С. 37—41.
9. Ашапкин В.В., Романов Г.А., Тушмалова Н.А, Ванюшин Б.Ф. Индуцированный обучением избирательный синтез ДНК в мозге крыс // Биохимия. 1983. Т. 48. Вып. 3. С. 355—362.
10. Гусъкова Л.В, Бурцева Н.Н., Тушмалова Н.А, Ванюшин Б.Ф. Уровень метилирования ДНК ядер нейронов и глии коры больших полушарий мозга крыс и его изменения при выработке условного рефлекса // Докл. АН СССР. 1977. Т. 233. № 5. С. 993—996.
11. Гамбарян Л.С., Ковалъ И.Н. Гиппокамп. Физиология и морфология. Ереван: Изд-во АН Армянской ССР, 1973. 103 с.
12. Виноградова О.С. Гиппокамп и память. М.: Наука, 1975. 333 с.
13. Бериташвили И.С. Память позвоночных животных. М.: Наука, 1974. 300 с.
14. Cavallaro S., Schreurs B.G, Zhao W, D'Agata V., Alkon D.L. Gene expression profiles during long-term memory consolidation // Eur. J. Neurosci. 2001. Vol. 13. N 9. P. 1809—1815.
15. Hatsopoulos N.G., Xu Q., Amit ^.Encoding of movement fragments in the motor cortex // J. of neuroscience. 2007. Vol. 27. P. 5105—5114.
16. Бродский В.Я. Трофика клетки. М.: Наука, 1966. 355 c.
17. Ройтбак А.И. Глия и ее роль в нервной деятельности. СПб.: Наука, 1993. 352 с.
18. Мац В.Н. Нейроно-глиальные соотношения в нео-кортексе при обучении. М.: Наука, 1994. 95 с.
19. Anderson B.J, Li X., Alcantara A.A, Isaacs K.R, Black J.E., Greenough W.T. Glial hypertrophy is associated with synaptogenesis following motor-skill learning, but not with angiogenesis following exercise // Glia. 1994. Vol. 11. N 1. P. 73—80.
20. Banaclocha M.A. Neuromagnetic dialogue between neuronal minicolumns and astroglial network: a new approach for memory and cerebral computation // Brain Res. Bull. 2007. Vol. 73. N 1—3. P. 21—27.
21. Gibbs M.E., Hutchinson D., Hertz L. Astrocytic involvement in learning and memory consolidation // Neurosci. Biobehav. Rev. 2008.
22. Salmina A.B. Neuron-glia interactions as therapeutic targets in neurodegeneration //J. Alzheimers Dis. 2009. Vol. 16. N 3. P. 485—502.
23. Баскова И.П., Исаханян Г.С. Гирудотерапия. Наука и практика. М.: Наука, 2004. 507 с.
24. Новоселецкая А.В., Тушмалова Н.А., Воеводина Е.Б. Количественная оценка степени консолидации памятного следа на примере изучения мнемотропных свойств препарата деринат //IV Междунар. междисциплинарный конгресс "Нейронаука для медицины и психологии". 10—20 июня. 2008. Судак, Крым, Украина. С. 215.
25. Тушмалова Н.А., Прагина Л.Л, Мальцева Е.Л., Воеводина Е.Б., Бурлакова Е.Б. Влияние малых доз полидана на условный рефлекс пассивного избегания (как модели памяти) у крыс // Вестн. Моск. ун-та. 2008. № 4. С. 3—7.
26. Горбачева Л.Р. Нейропротективное действие ключевых протеиназ гемостаза: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М, 2008. 48 с.
27. Cooke J.P., Losordo D.W.Nitric Oxide and Angiogenesis // Circulation. 2002. Vol. 105. P. 2133—2135.
Поступила в редакцию 28.04.2011
ANALYSIS OF INFLUENCE OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUND
OF NATURAL ORIGIN PIYAVIT® ON CONDITIONED MEMORY,
NEURON-GLIA INTERACTION OF HIPPOCAMPUS
AND NEOCORTEX OF RATS' BRAIN
N.A. Loginova, N.A. Tushmalova, I.P. Baskova,
E.B. Voevodina, V.N. Mats, N.V. Pasikova
In the present research we studied mnemotropic effect of Piyavit® — the biologically active compound of natural origin — on the fear conditioning. Morphological changes in the neocortex and hippocampus of neuron-glia complex and brains' capillaries under the Piyavit® injection were differently directed. We suggest that improvement of memory under the Piyavit® is associated with metabolic changes in nervous tissue.
Key words: Piyavit, memory, morphometric analysis, motor cortex, hippocampus.
Сведения об авторах
Логинова Надежда Александровна — канд. биол. наук, науч. сотр. лаборатории функциональной нейроцитологии Учреждения Российской академии наук Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Тел.: (495)334-82-19; e-mail: [email protected]
Тушмалова Нина Александровна — докт. биол. наук, проф., гл. научн. сотр., заслуженный научный сотрудник Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, кафедра высшей нервной деятельности, лаборатория эволюции механизмов памяти. Тел.: 8(495)939-50-01; e-mail: [email protected]
Баскова Изольда Порфирьевна — докт. биол. наук, проф., вед. науч. сотр. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-14-11; e-mail: [email protected]
Воеводина Елена Борисовна — мл. науч. сотр. кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ. Тел.: (495)939-50-01; e-mail: [email protected]
Мац Валентина Николаевна — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории функциональной нейроцитологии Учреждения Российской академии наук Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Тел.: (495)334-82-19; e-mail: [email protected]
Пасикова Наталья Викторовна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр., ученый секретарь Учреждения Российской академии наук Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Тел.: (495)334-82-19; e-mail: [email protected]
