CC BY
20
АНАЛИЗ СВЯЗИ ПОЛИМОРФИЗМА ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ NO-СИНТАЗЫ (NOS 2) С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ
ANALYSIS OF ASSOCIATION OF PROMOTER REGION OF GENE OF INDUCIBLE NO-SYNTHASE (NOS2) WITH BRONCHIAL ASTHMA
Огородова Л.М. Петрова И.В. Рукин К.Ю.
ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский
университет Росздрава»,
г. Томск, Россия
Ogorodova L.M. Petrova I.V. Rukin K.Y.
Central scientific research laboratory by Siberian State Medical University,
Tomsk, Russia
Оксид азота (NO) играет важную роль в развитии бронхиальной астмы (БА), поскольку он принимает участие в механизмах формирования как атопии, так и гиперреактивности бронхов. Наличие мутаций в промоторной области гена индуцибельной NO-синтазы может влиять на частоту инициации транскрипции а, следовательно, и на уровень мРНК, и на количество вырабатываемого оксида азота. В связи с этим, целью нашего исследования явилось изучение роли полиморфизма промоторной области гена индуцибельной NO-синтазы в развитии БА различной степени тяжести, а также исследование ассоциации этих полиморфных вариантов с клиническими и функциональными характеристиками болезни. Обследовано 929 детей в возрасте от 7 до 14 лет, больных бронхиальной астмой различной степени тяжести. Контрольную группу составили 720 здоровых детей того же возраста. Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора для выделения ДНК и РНК на колонках «QIAGEN RNA/DNA». Для выявления полиморфных вариантов в промоторной области гена индуцибельной NO-синтазы использовали анализ конформаци-онного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP, single-strand conformational ро1утогр1^т).Для нахождения в известной последовательности ДНК сайтов связывания для тех или иных транскрипционных факторов использовали специальную on-line программу «Промотор-скан». Таким образом, нами установлено, что полиморфизм промоторной области гена индуцибельной NO-синтазы связан с регуляцией экспрессии гена, вследствие чего изменяется количество вырабатываемого эндогенного NO. Нуклеотидные замены в сайтах связывания нуклеарных факторов являются одним из механизмов регуляции ба-зальной и индуцированной транскрипционной активности гена NOS2. Ключевые слова: полиморфизм; гены; NO синтаза; бронхиальная астма.
Nitric oxide (NO) plays an important role in the development of bronchial asthma (BA), because it participates in the formation of mechanism of atopy and bronchial hyperreactivity.
The presence of mutations in the promoter region of the gene of inducible NO-synthase may influence the frequency of transcription initiation and, consequently, the level of mRNA and the amount of produced NO. Therefore, the aim of our study was to examine the role of polymorphism in the promoter region of the gene of inducible NO-synthase in development of asthma of varying severity, as well as study of the association of these polymorphisms with clinical and functional characteristics of the disease. The study involved 929 children aged 7-14 with asthma of varying severity. The control group included 720 healthy children of similar age. Isolation of genomic DNA from venous blood of the subjects was performed by phenol-chloroform extraction. Isolation of total RNA was performed using a kit for isolation of DNA and RNA on columns «QIAGEN RNA/DNA». To identify polymorphisms in the promoter region of the gene of inducible NO-synthase the analysis of the conformational polymorphism of single-chain fragments of DNA (SSCP, single-strand conformational polymorphism) was used. To find a certain sequence of DNA binding sites the special on-line program «Promoter-scan» was used for certain transcription factors. Thus, we have found that the polymorphism of promoter region of the gene of inducible NO-synthase gene was associated with regulation of gene expression, thus changing the amount produced by endogenous NO. Nucleotide substitutions in binding sites of nuclear factors are one of the mechanisms of regulation of basal and induced transcriptional activity of gene NOS2. Key words: polymorphism; genes; NO synthase; bronchial asthma.
Оксид азота (N0) играет важную роль в развитии бронхиальной астмы (БА), поскольку принимает участие в механизмах формирования как атопии, так и гиперреактивности бронхов. В результате многочисленных исследований было показано, что повышение содержания оксида азота в выдыхаемом воздухе связано с выраженностью клинических симптомов астмы [1, 2].
В организме синтез N0 осуществляется семейством цитохром-Р-450-
подобных гемопротеинов — N0-™^ таз (КФ 1.14.13.39), включающим три изоформы: нейрональную N0-синтазу (N0S1), эндотелиальную (N0S3) и макрофагальную (N0S2) [3]. Индуцибельная N0-синтаза, в отличие от конститутивных изо-форм, проявляет активность только при наличии патологического процесса, что служит причиной гиперпродукции оксида азота. Количество эндогенного оксида азота зависит от активности матричной РНК гена N0S2. Регуляция транс-
крипции и, соответственно, уровня матричной РНК опосредуется связыванием варьирующего числа разнообразных факторов транскрипции со специфическими родственными им элементами промоторов и энхансеров [4-6].
Наличие мутаций в промоторной области гена индуцибельной N0-синтазы может влиять на частоту инициации транскрипции и, следовательно, на уровень мРНК и количество вырабатываемого оксида азота [7, 8].
1 ■ ■
№ 1[март] 2011
В связи с этим, целью нашего исследования явилось изучение роли полиморфизма промоторной области гена индуцибельной N0-синтазы в развитии БА различной степени тяжести, а также исследование ассоциации этих полиморфных вариантов с клиническими и функциональными характеристиками болезни.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Обследованы 929 детей в возрасте от 7 до 14 лет, больных бронхиальной астмой различной степени тяжести. Контрольную группу составили 720 здоровых детей того же возраста. Диагноз БА устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов. Степень тяжести заболевания оценивали по критериям проекта GI-NA.
Критерии включения больных бронхиальной астмой:
1. Амбулаторные и стационарные пациенты.
2. ^Е в сыворотке крови > 100 МЕ/ мл.
3.Пациенты, имеющие подтвержденный диагноз бронхиальной астмы:
- легкая персистирующая: симптомы чаще 1 раза в неделю, но реже 1 раза в день, обострения, нарушающие активность и сон, ночные симптомы чаще 2 раз в месяц, ОФВ1 или ПСВ не менее 80 % от должных значений, вариабельность пиковой скорости выдоха (ПСВ) или объем форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1) не более 30 %;
- персистирующая среднетяжелая: симптомы ежедневно, обострения, нарушающие активность и сон, ночные симптомы более 1 раза в неделю, ежедневный прием ингаляционных Р2-агонистов короткого действия, ОФВ1 или ПСВ 60-80 % от должных значений, вариабельность ПСВ или ОФВ1 более 30 %;
- тяжелая персистирующая: симптомы ежедневно, частые обострения, частые ночные симптомы БА, ограничения физической активности, ОФВ1 или ПСВ не превышает 60 % от должных
значений, вариабельность ПСВ или ОФВ4 не менее 30 %) (GINA 2006).
Критерии включения в контрольную группу:
1. Возраст от 5 до 17 лет.
2. Отсутствие аллергических болезней на момент включения и в анамнезе.
3. Отсутствие острых респираторных заболеваний в течение 4-х недель до включения в исследование.
4. Отрицательные результаты кожных аллергопроб.
5. IgE в сыворотке крови < 100 МЕ/ мл.
Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора для выделения ДНК и РНК на колонках «QIAGEN RNA/DNA».
Для выявления полиморфных вариантов в промоторной области гена индуцибельной NO-синтазы использовали анализ конформаци-онного полиморфизма одноцепо-чечных фрагментов ДНК (SSCP, single-strand conformational polym-orphysm). Реакцию амплификации проводили на автоматическом ам-плификаторе «Терцик». Состав реакционной смеси (50 мкл): 67 мМ Трис-HCl, рН = 8,8; 16,7 мМ сульфат аммония; 1,5 мМ хлорид магния; по 0,2 мМ каждого dNTP; 0,1 % твин-20; 2 ед. tag-полимеразы; 50-100 нг геномной ДНК человека; по 5 пМ каждого из специфических праймеров: NOS2 (прямой — 5'-GCCTTCTGGAACCTGGGATTT-3') и NOS2 (обратный - 5'-TTCG-ACTCGCTACAAAGTTAT-3').
В результате ПЦР получаются фрагменты ДНК длиной 570 пар нуклеотидов. Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР): преднагрев: 95°С — 5 мин; основная программа - 38 циклов: 95°С — 15 сек; 56°С — 15 сек; 72°С
— 40 сек; заключительная стадия: 72°С — 1 мин. Термоциклер
— «Терцик». Детекцию проводили в полиакриламидном геле. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК (по Сенжеру) проводили на автоматическом секвенаторе ДНК модели
ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer.
Для нахождения в известной последовательности ДНК сайтов связывания для тех или иных транскрипционных факторов использовали специальную on-line программу «Промотор-скан».
РТ-ПЦР (reverse transcription PCR) проводили с использованием набора «Titan One Tube RT-PCR System», согласно приложенной инструкции. РТ-ПЦР выполняли с использованием следующих праймеров:
мРНК NOS2: прямой - 5'-GGA-AGCGGTAACAAAGGAGATAGAA-3', обратный - 5'-GGCAGGGCG-TACCACTTTAGCT-3';
Экспрессию мРНК оценивали количественно в сравнении с экспрессией мРНК глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФД). Ген этого фермента относится к постоянно экспрессирующим (house keeping) генам, экспрессия этого гена является стабильной и постоянной во всех клетках организма. Степень экспрессии мРНК выражали в процентах по отношению к экспрессии мРНК ГАФД.
Оценку нормальности распределения полученных результатов по каждой величине проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Статистическую обработку результатов для признаков с нормальным распределением проводили с использованием t-кри-терия Стьюдента, для признаков, не соответствующих нормальному закону распределения, применяли U-тест Манна-Уитни. Для корреляционного анализа использовали критерий Пирсона. Различия между показателями считали достоверными при значении р < 0,05. Сравнение частот аллелей в группах обследованных проводили с помощью точного критерия Фишера и Колмогорова-Смирнова. Статистически достоверными считали различия при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования было обнаружено достоверное повышение экспрессии мРНК гена индуцибельной NO-синтазы у всех детей, больных
БА, вне зависимости от тяжести заболевания (табл.). После лечения обнаружена лишь тенденция к снижению уровня экспрессии гена NOS2. Так, у детей с тяжелой и среднетяжелой астмой уровень матричной активности NOS2 значительно снизился и составил 50,4 ± 7,1 % и 46,9 ± 4,7 %, соответственно, однако не достиг значений, полученных у здоровых детей (17,4 ± 2,6 %; р < 0,001).
При изучении взаимосвязи уровня мРНК индуцибельной N0-™^ тазы с клинико-патогенетическими признаками БА обнаружена отрицательная корреляционная зависимость между уровнем мРНК и показателями ФВД (ОФВ1 и
Рисунок
ПСВ) и БГР (ПК20) как при обострении, так и в период ремиссии (г = -0,5 р < 0,05).
Учитывая тот факт, что уровень экспрессии гена N0S2 тесно связан с показателями, характеризующими функциональное состояние легких, можно говорить о том, что высокий уровень мРНК гена инду-цибельной N0-синтазы может приводить к негативным последствиям, которые при БА проявляются патологическими нарушениями функции дыхательных путей. Механизм реализации этих изменений опосредован через действие N0 на эффекторные клетки воспаления, в результате чего происходит синтез медиаторов, а также через непо-
средственное действие N0 на эпителий гладких мышц дыхательных путей.
В результате SSCP-анализа в промоторной области гена индуци-бельной N0-синтазы было идентифицировано четыре полиморфных варианта, обозначенных нами как паттерны: паттерн N0S-21, паттерн N0S-22, паттерн N0S-23 и паттерн N0S-24 (рис.). Паттерн N0S-23 на электрофореграмме был представлен двумя бэндами, что соответствует гомозиготе. Все остальные паттерны имели четыре бэнда, что соответствует гетеро-зиготе. В гетерозиготах один из аллелей соответствовал варианту N0S-23.
12Э45 6 7 А Э 1С
^_____■___ — —-- N05-:]
А 5
Примечание: А — Результаты анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP) у больных бронхиальной астмой с различным полиморфизмом гена NOS2; Б — Расположение бэндов одноцепочечных фрагментов ДНК промоторной области гена NOS-2 на электрофореграмме (SSCP-анализ). Две полосы — гомозиготы, четыре полосы — гетерозиготы.
Таблица
Экспрессия генов 1\Ю-синтаз у больных бронхиальной астмой до лечения, М ± т
Группы пациентов (чел.) Уровень мРНК гена NOS2 (%) Уровень мРНК гена NOS2 (%)
до лечения после лечения
97,9 ± 6,3 41,4 ± 5,5
рс = 0,033 рс = 0,049
Легкая БА, п = 414
рт < 0,001 рт = 0,025
рк < 0,001 рк < 0,001
116,2 ± 10,5 46,9 ± 4,7
Среднетяжелая БА, п = 358 рт = 0,016 рт = 0,058
рк < 0,001 рк < 0,001
129,1 ± 13,4 50,4 ± 7,1
Тяжелая БА, п = 157
рк < 0,001 рк < 0,001
Контроль, п = 720 17,4 ± 2,6
Примечание: рк - уровень значимости различий по сравнению с контролем; рс - уровень значимости различий по сравнению с показателями у пациентов со среднетяжелой астмой; рт - уровень значимости различий по сравнению с показателями у пациентов с тяжелой астмой.
№ 1[март] 2011
В результате секвенирования нуклеотидных последовательностей и выравнивания их по соответствующим консенсусным последовательностям было установлено, что паттерн NOS-23 соответствует консенсусной последовательности (GenBank № L36031.1), аллель паттерна NOS-22 имеет делецию -343 (С/-), а аллель паттерна NOS-24 — инсерцию -189 (-/GTGTGT). В одном из аллелей паттерна NOS-21 гена инду-цибельной NO-синтазы (NOS-2) была обнаружена замена (G/T) в положении -326 п.о.
Установлено, что инсерция -189 (-/GTGTGTT) находится в сайте связывания для NFkB, трансверсия -326 (G/T) — в сайте для связывания ТФ Myc-Max, а деле-ция -343 (-/C) — в сайте связывания для рецептора ретиноевой кислоты (RAR).
Было установлено, что аллель, соответствующий дикому типу, а также аллели -326 (G/T) и -343 (С/-) встречались как у больных БА, так и в группе контроля. В свою очередь, аллель -189 (-/GTGTGTT) был обнаружен только у больных БА, причем только при тяжелой и среднетяжелой астме. У здоровых детей данный аллельный вариант найден не был. Вероятно, наличие инсерции -189 (-/GTGTGTT) в промоторной области гена NOS2 может оказывать влияние на фенотипическую манифестацию характерных для БА патогенетических признаков. Действительно, удалось установить ассоциацию аллеля -189 (-/GTGTGTT) практически со всеми исследованными количественными и качественными патогенетическими признаками заболевания. Tак, средний уровень мРНК и, соответственно, содержание нитритов в дыхательном конденсате у пациентов с этим аллелем были значительно выше (р < 0,001), чем у больных с другими аллельными вариантами гена NOS2. В период ремиссии наблюдалась лишь тенденция к уменьшению этих показателей. Уровень мРНК и содержание нитритов в конденсате выдыхаемого воздуха оставались на достаточно высоком уровне и достоверно отличались от контрольных значений (р < 0,001).
Это может быть связано с тем, что аллель -189 (-/GTGTGTT) встречается только при тяжелой и средне-тяжелой БА, когда в нижних дыхательных путях (ДП) появляются характерные морфологические изменения, включающие гипертрофию гладкой мускулатуры, повышенное образование бокаловидных эпителиальных клеток и отложение интерстициального коллагена под эпителием (утолщение базальной мембраны). Усиленная слизистая секреция, экссудат белков сыворотки и клеточный детрит совместно формируют плотные пробки, которые при тяжелой БА вызывают окклюзию мелких бронхов, в результате затрудняется доставка ингаляционных кортикостероидов (ИКС) в очаг воспаления. В то же время возрастает количество медиаторов, которые вызывают активацию экспрессии гена N0S2. У детей с аллелем -189 (-/GTGTGTT) наблюдались также наиболее выраженные нарушения вентиляции легких по обструктивному типу. На фоне терапии ИКС отмечалось лишь незначительное увеличение показателей ФВД. В то время как у больных с другими аллелями значения ОФВ4 и ПСВ приблизились к контрольным и значимо от них не отличались. В период обострения у пациентов с аллелем -189 (-/GTGTGTT) были обнаружены наиболее низкие значения дозы метахолина, приводящей к бронхо-спазму, ситуация не изменилась и на фоне терапии ИКС. В период ремиссии уровень ПК20 у детей с аллелем -189 (-/GTGTGTT) составил 3,5 ± 0,7 и 4,8 ± 0,3 мг/мл при тяжелой и среднетяжелой астме, соответственно, против 10,4 ± 0,8 мг/мл в группе контроля (р < 0,001). Ранее было установлено, что структурное ремоделирова-ние дыхательных путей, характерное для тяжелой БА, способствует поддержанию бронхиальной гиперреактивности даже при отсутствии клинических проявлений.
Полученные данные могут свидетельствовать о том, что аллель -189 (-/GTGTGTT) ассоциирован как с обструкцией ДП, так и с высокой степенью бронхиальной гипер-реактивеости (БГР). Вероятно, за счет инсерции -189 (-/GTGTGTT)
в сайте узнавания транскрипционного фактора происходит усиление связывания нуклеарного фактора kB (NFkB) с последовательностью промоторной области. В результате, эта аллельная форма гена обладает более сильной, по сравнению с другими аллелями, способностью к экспрессии и обуславливает повышенную продукцию оксида азота, который участвует в модуляции тонуса ДП, а также является важным регулятором иммунного ответа и воспаления.
У пациентов с аллелем -326 (G/T) гена NOS2 наблюдался высокий уровень мРНК (133,5 ± 21,4 % против 16,5 ± 1,7 % у здоровых детей) и повышенное содержание нитритов в дыхательном конденсате (0,78 ± 0,04 мкМ против 0,33 ± 0,03 мкМ в группе контроля). Уровень мРНК у детей с данным ал-лелем возрастал пропорционально тяжести заболевания и в период ремиссии не достигал контрольных значений. При обострении у больных с аллелем -326 (G/T) гена NOS2 отмечались выраженные нарушения вентиляции легких по об-структивному типу. Tак, было обнаружено, что уровень ОФВ4 при легкой астме у пациентов с аллелем -326 (G/T) был значительно ниже, чем у больных с аллелем -343 (С/-) (91,9 ± 1,9 % против 100,6 ± 3,8 %, соответственно, р < 0,05) и алле-лем, соответствующим дикому типу (91,9 ± 1,9 % против 100,3 ± 5,3 %, р < 0,05). На фоне терапии ИКС значения ОФВ4 и ПСВ приблизились к контрольным и достоверно от них не отличались. Основой полученных ассоциаций аллеля -326 (G/T) с БА и характерными для нее патогенетическими признаками, видимо, также является изменение силы связывания TФ (в данном случае TФ - Myc-Max) с промотором гена NOS-2. Как следствие, происходит увеличение экспрессии гена и количества нарабатываемого оксида азота.
Обнаружен также аллельный вариант гена NOS-2 с делецией -/C в положении -343 (относительно точки инициации транскрипции +1), которая находится в сайте связывания для рецептора ретиноевой кислоты (RAR). Нами установлен факт эффективности глюкокорти-
ПОЛИТРАВМА
костероидной терапии у больных с аллельным вариантом -343 (С/-) гена N0S2 в отношении лабораторных (уровень мРНК; содержание нитритов в выдыхаемом воздухе) и клинических показателей (ОФ-В4; ПСВ), что дает возможность рассматривать этот полиморфизм как благоприятный в плане прогноза лечения больных. Можно предположить, что наличие де-леции -343 (С/-) в промоторной области гена индуцибельной N0-синтазы приводит к ингибиро-ванию экспрессии гена и умень-
Литература:
шению уровня мРНК у больных БА.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, нами установлено, что полиморфизм промоторной области гена индуцибельной N0-синтазы связан с регуляцией экспрессии гена, вследствие чего изменяется количество вырабатываемого эндогенного N0. Нуклеотидные замены в сайтах связывания нукле-арных факторов являются одним из механизмов регуляции базаль-ной и индуцированной транскрип-
ционной активности гена N0S2. Наличие точечных замен в сайтах связывания для транскрипционных факторов, ОТкВ, Мус-Мах и ИАИ может оказывать влияние на экспрессию мРНК гена N0S2 и, соответственно, на количество эндогенного оксида азота. Транскрипционные факторы NFkB и Мус-Мах являются важной составной частью патогенетической структуры подверженности к атопической БА и вовлечены как в «воспалительное», так и в «обструктивное» звенья патогенеза заболевания.
1. Локшина, Э.Э. Роль генетических маркеров в ранней диагностике атопических заболеваний /Э.Э. Локшина //Педиатрия.
- 2006. - № 3. - С. 87-89.
2. Alderton, W.K. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition /W.K. Alderton, C.E. Cooper, R.G. Knowles //Biochem. J. - 2001. - Vol. 357. - P. 593-615.
3. Association of a Missense Mutation in the NOS3 Gene with Exhaled Nitric Oxide Levels /K. Storm van's Gravesande, M.E. Wechsler, H. Grasemann [et al.] //Am. J. Respiratore and Critical Care Medicine - 2003. - Volume. 168. - P. 228231.
4. Pitt, B.R. Complex Regulation of iNOS in Lung /B.R. Pitt, C.M.St. Croix //Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 2002. - Vol. 26, N 1. - P. 6-9.
5. Nitric oxide in health and disease of the respiratory system /L.M. Ricciardolo, P.J. Sterk, B. Gaston, G. Folkerts //Physiol. Rev.
- 2004. - Vol. 84. - P. 731-765.
6. Newton, D.C. Translational Regulation of Human Neuronal Nitric-oxide Synthase by an Alternatively Spliced 5'-Untranslated Region Leader Exon /D.C. Newton //J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278, N 3.
- P. 636-644.
7. Payne, D.N.R. Nitric oxide in allergic airway inflammation /D.N.R. Payne //Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. - 2003. - Vol. 3, N 2.
- P. 133-137.
8. Pattern of NOS2 and NOS3 mRNA expression in human A549 cells and primary cultured AEC II /D.V. Pechkovsky, G. Zissel, T. Goldmann [et al.] //Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. - 2002.
- Vol. 282, N 4. - P. 684-692.
Сведения об авторах: Information about authors:
Огородова Л.М., д.м.н., профессор, член-корр. РАМН, проректор Ogorodova L.M., PhD, professor, corresponding member of Russian
по НР И ПП, г. Томск, Россия. Academy of Medical Science, pro-rector of scientific work and postgradu-
ate training, Tomsk, Russia.
Петрова И.В., к.м.н., старший научный сотрудник ЦНИЛ СибГМУ, Petrova I.V., MD, senior researcher, Central scientific research labo-
г. Томск, Россия. ratory by Siberian State Medical University, Tomsk, Russia.
Рукин К.Ю., студент 6 курса медико-биологического факультета Rukin K.Y., 6-year student of medicobiological department, Siberian
СибГМУ, г. Томск, Россия. State Medical University, Tomsk, Russia.
Адрес для переписки: Address for correspondence:
Рукин К.Ю. Московский тракт 6/2-534, г. Томск, Россия, 634050 Rukin K.Y., Moscovskiy tract 6/2-534, Tomsk, Russia, 634050
Сот. тел: +7-923-433-5151 Mobile phone: +7-923-433-5151
E-mail [email protected] E-mail [email protected]
m
№ 1[март] 2011
