CC BY
99
УДК 616-056.43:577.22
АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОв ИНТЕРЛЕЙКИНА-13 И СИСТЕМЫ ДЕТОКСИКАЦИИ
ксенобиотиков у детей с аллергопатологией
Д.В. Бахаев1, А.М. Стенкова1, Ю.В. Иванова2, О.В. Щеголева2, Е.В. Просекова2, В.А. Рассказов1, М.П. Исаева1
1 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159),
2 Владивостокский государственный медицинский университет (690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 2)
Ключевые слова: генетический полиморфизм, интерлейкин-13, глутатион-Б-трансферазы, аллергические заболевания.
Представлены результаты генотипирования интерлейкина-13 в отношении трех полиморфных локусов (-1512А>С,-1112С>Т и +2044G>A), а также исследования нуль-полиморфизма генов M1 и T1 глутатион^-трансфераз (GST) у детей Владивостока с аллергическими заболеваниями (73 человека) и без аллерго-патологии (27 человек). В ходе исследования не установлено связи «нулевых» генотипов GSTM1 и GSTT1 с развитием аллергических заболеваний. Обнаружено значимое преобладание гетерозиготного носительства варианта -1112С/Т среди больных (58 % против 22,2 % в контроле). В группе детей с клиническими проявлениями аллергических заболеваний достоверно чаще встречались гетерозиготные состояния одновременно по 2-3 полиморфным локусам (48,4 % против 18,5 % в контроле). Генотипирование интерлейкина-13 по трем полиморфным локусам может быть рекомендовано к использованию как дополнительный критерий групп риска реализации аллергических заболеваний.
Аллергические заболевания по распространенности, склонности к хронизации и социально-экономическому ущербу помещены в группу глобальных проблем здравоохранения [4]. В основе развития аллергических заболеваний, таких как атопическая бронхиальная астма, атопический дерматит и аллергический ринит, лежит иммуноглобулин-Е-зависимое аллергическое воспаление. Исходя из сложнонаследуемой (муль-тифакториальной) природы этой группы заболеваний, определяемой комплексным взаимодействием генетических и средовых факторов, важной задачей становится выяснение «неблагоприятных» сочетаний полиморфных вариантов генов, которые с высокой долей вероятности могут привести к развитию аллер-гопатологии.
Центральную роль в аллергическом воспалении играет секретируемый Т-хелперами 2-го типа интерлейкин-13 (IL-13), ключевыми свойствами которого являются переключение В-лимфоцитов на синтез иммуноглобулина Е, индукция бронхиальной гиперреактивности и гиперсекреции слизи, активация эозинофилов и привлечение их в очаг воспаления [1, 5, 7, 14]. Очевидно, что полиморфизм гена IL-13 (Arg130Gin) определяет разнообразие его фенотипических проявлений. К настоящему времени в этом гене идентифицирован ряд мутаций, наиболее общими из которых являются две в промоторном участке (-1512А>С и -1112С>Т) и одна в кодирующей части (+2044G>A). Показано, что мутации в промоторной части гена вызывают
Исаева Марина Петровна - канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН; тел.: +7 (423) 231-07-03; e-mail: [email protected]
увеличение транскрипции IL-13, а миссенс-мутация +2044A (замена Arg130 на Gln) приводит к появлению функционально-активного варианта цитокина и увеличению уровня сывороточного иммуноглобулина E [8, 9, 13]. При сочетании мутаций по локусам -1112Т/Т и +2044А/А наблюдается синергичный эффект в виде гиперэкспрессии высокоактивного варианта IL-13 [13]. К генам, предрасполагающим к развитию аллергических заболеваний, т.е. способным влиять на увеличение аллергенной нагрузки в условиях, например, сниженной активности биотрансформации ксенобиотиков и медиаторов воспаления, относят гены глутатион-S-трансфераз (GST). Для них характерен высокий полиморфизм, при котором белковый продукт может отсутствовать или различаться по уровню ферментативной активности [3, 6]. Полиморфизм по «нулевым» аллелям, описанный для генов GSTM1 и GSTT1, наиболее интенсивно изучается при различных патологиях, в том числе атопической бронхиальной астме и атопичес-ком дерматите, при этом литературные данные об ассоциации «нулевых» типов этих генов с риском развития аллергопатологии противоречивы [2, 10-12].
Целью настоящего исследования явился анализ полиморфизма гена IL-13 в отношении трех полиморфных локусов (-1512А>С, -1112С>Т и +2044G>A), а также нуль-полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 у детей с аллергопатологией.
Материал и методы. Обследованы 73 ребенка с атопи-ческой бронхиальной астмой, аллергическим ринитом и атопическим дерматитом в возрасте 3-15 лет. В качестве контроля послужила группа сверстников (27 человек) без каких-либо признаков аллергопатологии и с неотя-гощенным наследственным анамнезом. Материалом для получения ДНК служили лейкоциты периферической крови или эпителиальные клетки слизистой оболочки щеки. ДНК выделяли с использованием набора Genomics DNA Purification Kit (Fermentas, Евросоюз). Генотипирование ДНК-полиморфизмов гена IL-13 проводили методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, используя структуры праймеров, температурный режим и условия анализа, описанные в работе P.E. Graves et al. [8]. Детекцию полиморфных маркеров I/D генов GSTM1 и GSTT1 выполняли с использованием наборов ГосНИИгенетики (Москва). Содержание общего иммуноглобулина E в сыворотке крови определяли с использованием тест-системы фирмы «ВекторБест» (Новосибирск). Статистическую обработку материала
64
Тихоокеанский медицинский журнал, 2012, № 1
80 -1
60 -
S 40 -
20 -
| | Здоровые | | Больные
-1112С -1112Т* -1504А -1504С +20440 +2044А Рис. 1. Распределение аллелей гена 1Ь-13 у здоровых детей и детей с аллергическими заболеваниями (* - разница статистически значима).
Таблица
Распределение генотипов IL-13 и GSTу здоровых детей и детей с аллергическими заболеваниями, %
Здоровые Больные
Генотип я О d т я О d т
о н V О еи ^ со мута ция о н V О еи ^ со мута ция
IL-13-1504A>C 59,3 37,0 3,7 41,9 48,4 9,7
IL-13-1112C>T 66,7 22,2 11,1 25,8 58,0 16,1
IL-13+2044G>A 50,0 32,1 17,9 50,7 33,3 16,1
GSTM1 42,0 - 58,0 46,1 - 52,9
GSTT1 88,0 - 12,0 83,8 - 16,2
Примечание. Норма: А/А - для IL-13-1504, C/C - для IL-13-1112, G/G - для IL-13+2044, 0/+ или +/+ - для GSTM1 и GSTT1; мутация: С/С - для IL-13-1504, T/T - для IL-13-1112, А/А - для IL-13+2044, 0/0 или 0/0 - для GSTM1 и GSTT1; гетерозигота: А/C - для IL-13-1504, C/T - для IL-13-1112, G/A - для IL-13+2044.
проводили в программе Statistica 6. При сравнении частот генотипов применяли стандартный критерий х2 Пирсона. При условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали критерий х2 с поправкой Йейтса. Отношение шансов подсчитывали по методу Woolf с 95 %-ным доверительным интервалом.
Результаты исследования и обсуждение полученных данных. Число генов-кандидатов предрасположенности к аллергическим заболеваниям достаточно велико, тем не менее, исходя из особенностей развития данной патологии, первостепенными для исследований являются гены, ответственные за гипериндукцию синтеза иммуноглобулина E - одного из основных маркеров аллергопатологии. По нашим данным, частота встречаемости аллеля +2044G (Arg130) составила 67,4 % в группе детей с аллергопатологией и 66,1 % среди здоровых лиц, а частота встречаемости минорного аллеля +2044А (Gln130) - 32,6 и 33,9 % соответственно. В группе здоровых частота встречаемости нормальных аллелей -1112С и -1504А была одинаковой и составила 78 % (доля минорных аллелей - 22 %). Однако в группе с аллергическими заболеваниями наблюдалось преобладание минорных аллелей -1112Tи -1504C, но статистически значимым было только увеличение частоты встречаемости аллеля -1112T (рис. 1, табл.).
Анализ распределений генотипов зафиксировал неравномерность для всех трех полиморфных локусов гена IL-13 (табл.). Статистический анализ распределений генотипов не дал достоверно значимых различий, за исключением -1112С/Т: гетерозиготное носительс-тво этого варианта наблюдалось среди больных в 2 раза чаще (58 % против 22,2 % в контроле). Следует отметить, что распределение генотипов -1504А>С в группе контроля было близким к распределению полиморфных вариантов в европейской популяции (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/ projects/SNP/snp_ref. cgi?rs=1881457), тогда как распределение генотипов по полиморфному локу-су -1112С>Т соответствовало этнически смешанной популяции (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ snp_ref.cgi?rs=1800925).
Интересными являются данные, полученные по распределению генотипов по локусу +2044G>A: частота их регистрации у аллергиков и здоровых детей была практически одинаковой и в обеих группах наблюдался довольно высокий процент гомозигот (табл.). Аналогично высокая частота гомозигот А/А (17,4 %) характерна для испанской популяции (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/ projects/ SNP/snp_ref.cgi?rs=20541). Полученные результаты отличаются от ранее опубликованных [8, 9] и могут свидетельствовать об отсутствии решающей роли данной мутации в развитии аллергических заболеваний у детей во Владивостоке. Ранее в японской и британской популяциях была выявлена ассоциация полиморфизма +2044А (Gln130) с атопической бронхиальной астмой, но не с увеличением уровня сывороточного иммуноглобулина E [9].
При сравнении распределения генотипов GSTM1 и GSTT1 в группе контроля было обнаружено их соответствие литературным данным [11]. В распределении этих «нулевых» генотипов, а также их комбинаций в исследуемой и контрольной группах значимых различий обнаружено не было. Частоты «нулевых» генотипов GSTM1 и GSTT1 составили 52,9 и 16,2 % у больных против 58 и 12 % у здоровых соответственно. Мы проанализировали также нуль-полиморфизм GSTM1 и GSTT1 в группах детей с бронхиальной астмой (21 человек) и с бронхиальной астмой в сочетании с аллергическим ринитом (31 человек) как наиболее многочисленных. Распределение относительных частот «нулевых» генотипов у детей с аллергическими заболеваниями мало отличалось от распределения в группе контроля: GSTM1 0/0 при бронхиальной астме встретился в 48 %, при бронхиальной астме в сочетании с аллергическим ринитом - в 55 %, в контрольной группе - в 58 % случаев. GSTT1 0/0 в группе зарегистрирован при бронхиальной астме в 14 %, при бронхиальной астме в сочетании с аллергическим ринитом - в 16 %, в контрольной группе - в 12 % случаев. Сочетание «нулевых» генотипов также было неинформативным (8 % случаев у здоровых против 5 и 6 % случаев
60 -|
40 -
20 -
Здоровые
Больные
2-3 нормы 2-3 гетерозиготы 2-3 мутации Рис. 2. Частота одновременного носительства генотипов IL-13 у здоровых детей и у детей с аллергическими заболеваниями.
в группах больных). Полученные данные показывают, что влияние полиморфных вариантов GSTM1 и GSTT1 на атопию в рамках изучаемой выборки было незначимым, что также согласуется с результатами других исследований [2, 12].
Нами также были проанализированы случаи одновременного носительства нормальных и минорных аллелей IL-13 (рис. 2). В группе детей с аллергопато-логией достоверно чаще встречались гетерозиготные состояния одновременно по 2-3 полиморфным локусам (48,4 % против 18,5 % в контроле; отношение шансов - 4,1). У детей без аллергопатологии достоверно чаще наблюдалось одновременное носительство нормальных аллелей по разным локусам (55,6 % против 29 %). Одновременное носительство 2-3 мутаций гена IL-13 было достаточно редким явлением, чаще наблюдаемым в группе больных (9,7 %), чем здоровых (3,7 %). Важно отметить, что +2044G/A и -1112C/T проявляют высокую аддитивность, в результате чего наблюдается и гиперэкспрессия, и сверхактивность IL-13 [13].
Анализ полиморфизма генов IL-13 и глутатион-S-трансфераз показал перспективность исследования ассоциаций генотипов только для IL-13. Мы полагаем, что генотипирование здесь по трем полиморфным локусам информативно как критерий выделения групп риска реализации аллергических заболеваний у детей. В перспективе желательно расширение объемов выборок, а также включение других генов-кандидатов атопии для дальнейших исследований в этом направлении.
Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-98547_р_ восток_а. References
1. Kaznacheev V.A., Gervaziev Ju.V. The role of cytokines gene polymorphisms and their receptors in the development of atopic asthma, Astma. 2004. Vol. 5, No. 1. P. 73-84.
2. Frejdin M.B., Bragina E.Ju., Ogorodova L.M., Puzyrev V.P. [Glutathione transferase gene polymorphism 91 and |1 (GSTT1 and GSTM1) in patients with atopic asthma in Western Siberia region, Molekuljarnaja biologija. 2002. Vol. 36, No. 4. P. 630-634.
3. Frejdin M.B., Bragina E.Ju., Ogorodova L.M., Puzyrev V.P. The genetics of atopy: current status, Vestnik VOGiS. 2006. Vol. 10, No. 3. P. 492-503.
4. Haitov R.M., Ilina N.I., Latysheva T.V Rational pharmacotherapy of allergic diseases. M.: Litterra, 2007. 504 p.
5. Cameron L., Webster R.B., Strempel J.M. et al. Th2-selective enhancement of human IL-13 transcription by IL-13-1112C>T, a polymorphism associated with allergic inflammation, J. Immunol. 2006. Vol. 177. P. 8633-8642.
6. Eaton D.L. Concise Review of the Glutathione S-Transferases and theig Significance to Toxicilogy, Toxicological sciences. 1999. Vol. 49. P. 154-164.
7. Georas S.N., Gue J., Fanis U.D., Casolaro V. T-helper cell type-2 regulation in allergic disease, European respiratory journal. 2005. Vol. 26. P. 933-947.
8. Graves P.E., Kabesch M., Halonen M. et al. A cluster of seven tightly linked polymorphisms in the IL-13 gene is associated with total serum IgE levels in three populations of white children, J. Allergy Clin. Immunol. 2000. Vol. 105. P. 506-513.
9. Heinzmann A., Mao X.Q., Akaiwa M. et al. Genetic variants of IL-13 signalling and human asthma and atopy, Hum Mol Genet. 2000. Vol. 9. P. 549-559.
10. Islam T., Berhane K., McConnell R. et al. Glutathione-S-trans-ferase (GST) P1, GSTM1, exercise, ozone and asthma incidence in school children, Thorax. 2009. Vol. 64. P. 197-202.
11. Minelli C., Granell R., Newson R. et al. Glutathione-S-transferase genes and asthma phenotypes: a Human Genome Epidemiology (HuGE) systematic review and meta-analysis including unpublished data, Int. J. Epidemiol. 2010. Vol. 39. P. 539-562.
12. Vavilin V.A., Safronova O.G., Lyapunova A.A. et al. Interaction of GSTM1, GSTT1, and GSTP1 genotypes in determination of predisposition to atopic dermatitis, Bull. Exp. Biol. Med. 2003. Vol. 136. P. 388-391.
13. Vladich F.D., Brazille S.M., Stern D. et al. IL-13 R130Q, a common variant associated with allergy and asthma, enhances effector mechanisms essential for human allergic inflammation, J. Clin. Invest. 2005. Vol. 115. P. 747-754.
14. Wills-Karp M., Luyimbazi J., Xu X. et al. Interleukin-13: central mediator of allergic asthma, Sience. 1998. Vol. 282. P. 2258-2261.
Поступила в редакцию 27.05.2011.
polymorphism OF INTERLEUKIN-13 genes
and xenobiotic detoxification systems in children
with allergic pathology
D.B. Bakhaev1, A.M. Stenkova1, Yu.V. Ivanova2, O.V. Schegoleva2,
E.V. Prosekova2, V.A. Rasskazov1, M.P. Isaeva1
1 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry of the Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences (159 100 Year Anniversary of Vladivostok Prospekt, Vladivostok, 690022 Russian Federation),
2 Vladivostok State Medical University (2, Ostryakova Prospekt, Vladivostok, 690950 Russian Federation)
Summary - The paper provides results of interleukin-13 geno-typing with respect to three polymor-phous locuses (-1512А>С, -1112С>Тand +2044G>A) as well as studies on zero-polymorphism of genes M1 and T1 glutathione-S-transferase in children living in Vladivostok diagnosed with allergic diseases (73 patients) and allergic pathology-free (27 patients). As reported, there are no evidences that the "zero" genotypes GSTM1 and GSTT1 cause allergic diseases. There has been considerable prevalence of heterozygous carrier state of 1112С/Т among the patients (58 % against 22.2 % in control). The heterozygous states were reliably more often observed simultaneously by 2 or 3 polymor-phous locuses (48.4 % against 18.5 % in control) in children with clinical manifestations of the allergic diseases. The interleukin-13 genotyping by three polymorphous locuses can be recommended for applying as additional criterion of risk groups for the allergic diseases. Key words: genetic polymorphism, interleukin-13,
glutathione-S-transferase, allergic diseases.
Pacific Medical Journal, 2012, No. 1, p. 63-65.
