CC BY
53
OáñáíeT Ё.А., OSóñoaéáaa E.E., ЁабёТа А.Ё.
ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный университет МСХА имени К.А.Тимирязева
АГАЁЁд AÁÍI1A ЁОёА-ААООГА (ALLIUM FISTULOSUM)
ÍA ГAËЁXЁÁ 0ÁËИÁDÍIАI IIA0IDA (TTAGGG)N
0áëыáSü áTëü0ëíñoáa ffieáüó TSaaíeglTá ñTñoTyo eg i'STñoüó ITáoTSy^üeóñy GC-áTaaoüó iTñëáaTáaoáëüíTñoáé АГЁ, aTñoSaeáa^üeóñy óáSTáíoTi oáëT^á5aga.. Аёу áTëü0ëíñoáa áüñ0eó Sañoáíeé óaSaéoáSáí, oae íagüáaámé, a5aáeaTiñeñ-iTáoT5 (TTTAGGG)n. O iSáañoaáëoáëáé óëëT-aáíáoé^áñéTé ááoáe AñiaSaaTáüá yoTo iTáoTS gaiáüáí ía oáëыáSíüén iTáoTS, óaSaéoáSíüé aëy i'TgáTíT^íüó ffieáToíüó (TTAGGG)n. laíaeT, aT ñeó iTS Tñoaáoñy gaaaaéTé éaéeá iTñëáaTáaoáëüíT-ñoe áüi^íy^o óóíéóe^ oáëыáS ó ËóëTáüó - STa Allium, eToTSüé ToíTñéoñy e AñiaSaaTám. А ía0áé SaáToá iSTááaáí aíaëëg aáíTia A. fistulosum ía íaëë^ëá oáëыáSíTaT iTáoTSa (TTAGGG) . ЁñiTëügTáaíëá óëóTSáñóáíoíTé in situ aeáSeaegaóee (FISH) ё ñëTo-áëTo aíaëëga íá áüyáëëT yoTai iTáoTSa á aáíTiá A. fistulosum. laíaeT áTëáá ^óáñoáëoáëüíüé iáoTa TaíTñoTSTííáaT IOD iTëagaë íaëë^ëá ëTSToëëó óSaaiáíoTá ëgó^aá^TaT iTáoTSa. А SaáToá Táñóffiaa^oñy áTgiTffiíüá ióoë yáT-ë^óëë oáëыáSíüó iTáoTSTá ó ËóëTáüó.
ВВЕДЕНИЕ
Одним из основных элементов эукариотических хромосом являются теломеры, их физические окончания. Теломеры защищают хромосомы от деградации нуклеазами и прогрессирующего укорачивания в результате незавершенной репликации в 5’-концах [1]. Имеются данные о важной роли теломер в коррекции спаривания гомологичных хромосом в мейозе [2, 3], играют важную роль в процессах старения организма и пролиферации клеток [4].
Теломеры большинства групп организмов, таких как простейшие, беспозвоночные и позвоночные животные, а также грибы, водоросли и высшие растения представлены простыми повторяющимися GC-богатыми последовательностями, имеющими сходный нуклеотидный состав [5], связанными со специфичными белками.
Долгое время, характерным для высших растений считали теломерный повтор (TTTAGGG)n [6], однако сравнительно недавно у растений филогенетической ветви Ас-параговые был обнаружен повтор (TTAGGG)n, раннее выявленный только у позвоночных животных [7, 8]. Также было показано, что у Аспараговых, содержащих теломерный повтор TTAGGG, присутствуют и другие варианты, преимущественно TTTAGGG (арабидопсис-типа), а также TTGGGG (характерный для простейших) и TTAGG (характерный для насекомых).
В отличие от других видов растений, включая филогенетически близкие таксоны, у рода Луков (Allium), не обнаружен теломер-
ный повтор (TTTAGGG)n, характерный для высших растений, равно как и теломеразная активность [5, 8]. Следует отметить, что у некоторых представителей семейства Луковых - Iphenion uniflorum, Tulbaghia violacea было выявлено наличие теломерного повтора TTAGGG, характерного для позвоночных, а также показано, что теломерный повтор Tulbaghia violacea содержит значительное количество единиц повтора TTTTGGGG, характерного для водорослей. При этом род Allium, по-видимому, характеризуется отсутствием на окончаниях хромосом известных типов теломерных повторов [8].
Ранее, нами было показано, что окончания хромосом лука репчатого (A. cepa) и лука-батуна (A. fistulosum) содержат сател-литную ДНК размером 378-380 пар нуклеотидов [9]. Сателлитный повтор A. fistulosum содержит инверсии, делеции и вставки неса-теллитной ДНК (микросателлиты, ретрот-ранспозоны), возможно участвующей в вос-тановлении теломерных окончаний путем рекомбинации. Однако, в настоящее время неизвестно, как луковые защищают окончания своих хромосом, и какие последовательности ДНК выполняют функцию теломер.
Целью нашей работы являлось изучение генома A. fistulosum на наличие теломерного повтора, характерного для филогентической ветви Аспараговые.
Материалы и методы
Растительный материал.
В работе был использован следующий растительный материал: лук-батун
A. fistulosum (2n=16), линии CGN 14763; лук репчатый A. cepa, сорт Jumbo (полученны из Центра генетических ресурсов, Вагенинген, Нидерланды).
Растительный материал был выращен в пленочной теплице. Семена проращивали в чашках Петри при температуре 24° С.
Получение цитологических препаратов.
Цитологические препараты для флюоресцентной in situ гибридизации были приготовлены методом давления.
Предметные стекла обрабатывали 5N HCl в течении 3 часов. Затем промывали в бидистиллированной воде (не менее 3 раз). Перед использованием стекла погружались в спирт на 10 мин. и высушивали на воздухе.
Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге, после 3-5 дней семена обрабатывали а-бромнафталином при 4°С в течение 24 часов. Корешки фиксировали в смеси из этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение часа и хранили при температуре +4°С до использования.
Для приготовления препаратов корешки промывали в бидистиллированной воде 3 раза и в цитратном буфере. Затем обрабатывали в ферментной смеси: целлюлаза Onozuka 2%, пектинаназа 5S 2%, мацерозиме 2,5%, драйзелаза 1% в течение 1 часа при 37°С. После этого корешки отмывали в цитратном буфере и готовили давленные препараты в 45% уксусной кислоте.
Для перевода временных препаратов в постоянные использовали метод замораживания - скалывания. Для этого свежеприготовленные препараты замораживали при температуре - 70° С в течение 30 минут. После этого снимали покровное стекло и обрабатывали препарат 96% спиртом в течение 5 минут и высушивали на воздухе. Постоянные препараты хранили при температуре -20°С до использования.
Выделение ДНК.
ДНК выделяли из молодых листьев по следующему методике: молодые листья растирали в буфере для экстракции (0.35 М сор-битол, 100 мМ трис-HCl, 5мМ ЭДТА, рН 7) на холоду. Центрифугировали 10 мин. 14000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость,
добавляли буфер для экстракции, интенсивно встряхивали. Лизировали при 650 С в буфере для лизиса (1 М трис- HCl pH 7.5, 0.5 ЭДТА, 5 М NaCl, 2% CTAB) с добавлением 5% саркосила. После лизиса, производили очистку смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали при 14 000 об/мин. в течении 10 мин. Отбирали надосадочную жидкость и осаждали ДНК в одном объеме изопропанола. Центрифугировали в 14 000 об/мин. в течение 10 мин., осадок высушивали и растворяли в MQ-воде. Размер выделенной ДНК и степень загрязненности РНК оценивали методом электрофореза в 1% агарозном геле.
ПЦР -анализ.
На основании данных о нуклеотидной последовательности терминального сател-литного повтора 378 п.н. лука-батуна были подобраны и синтезированы следующие праймеры:
34902 5’-ATCGATTCTTCGGACGGCCT-3’
34903 5’-ATCCGCAGGGTGCAACATCTGCGG-3’. Праймеры, обратные выше названным:
34905 5’-AGATGTTGCACCCTTCGGAT-3’
34906 5 ’-TGGCCGTCCGAAGAATCGAT-3 ’. Для определения наличия теломерных
повторов были использованы праймеры, специфичные для растительного теломерного повтора:
PTELO1 5’ TTT AGG GTT TAG GGT TTA GGG TTT AGG GTT TAG GG 3’
PTELO2 5 ’ CCC TAA ACC CTA AAC CCT AAA CCC TAA ACC CTA AA 3’
Также праймеры, специфичные для теломерного повтора млекопитающих: HTELO1 5’ TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG 3’
HTELO2 5’ CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA 3’.
В 25 мкл смеси для ПЦР содержалось:
0,2 мМ каждого нуклеотида
1х буфер для ПЦР
100 нг ДНК-матрицы
20 нг каждого праймера
2,5 U ДНК-полимеразы.
Для мечения продуктов ПЦР использовалась смесь нуклеотидов, содержащая
biotin-11-dUTP или Dig-11-dUTP («Синтол», Москва).
Амплификацию проводили на амплифи-каторе «Терцик» («ДНК-технология», Москва) при следующих параметрах:
Для амплификации сателлитного повтора 94°С - 2 минуты;
94°С - 30 с Л
57°С - 30 с, ?- 30 циклов
72°С - 30 с, J
72°С -7 мин.
Для амплификации теломерного повтора 94°С - 5 минут;
94°С - 1 мин
55°С - 40 с * 15 циклов
72°С - 2 мин 30 с _
94°С -1 мин 60°С - 40 с "
72°С - 2 мин 30 ► с 25 циклов 72°С - 7 мин. ^
Продукты ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле с буфером ТВЕ при напряженности поля 6 V/см. В качестве маркера размеров использовали «100 bp leader» (Fermentas).
После окрашивания бромистым этиди-ем продукты ПЦР были визуализированы с помощью трансиллюминатора и задокументированы цифровой камерой «NIKON».
Слот-блот гибридизация.
Перенос ДНК осуществляли в 20 Х SSC, с помощью вакуумного насоса (Millipore, USA) на мембрану Immobilon-N (Millipore, USA).
В качестве метки использовали зонды, меченные biotin-11-dUTP (‘Синтол’, Москва), полученные методом ПЦР. После гибридизации мембрану промывали в 2x SSC, 0,5% SDS два раза при комнатной температуре. Затем в 0,2 Х SSC, 0,5% SDS два раза при комнатной температуре, 0,16 X SSC, 0,5% SDS два раза по 15 минут при 56 С.
После отмывки проводили детекцию в буфере (0,1 M трис-HCl, pH 7.5,2 mM MgCl2,
0,1 M NaCl, 0,05% Triton X-100), с добавленным стрептавидином, который ковалентно связан со щелочной фосфатазой.
Для визуализации мембрану инкубировали в субстратном буфере (0.1 M трис - HCl pH 9.5, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl2) с добавлением NBT и BCIP.
Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH)
Флюоресцентную in situ гибридизацию проводили как описано [10]. Зонды, меченные биотином и дигоксигенином, получали с помощью ПЦР. Смеси для мечения были получены коммерчески и содержали Bio-11d-UTP («Синтол», Москва). Гибридизационая смесь содержала 50% деионизированного формамида, 10% декстрансульфата, 2X SSC, 0.25% SDS и 2.5 нг/мкл метки. Для детекции биотина использовали систему стрептави-дин-антистрептавидин с красителем Cy3 (Vector Laboratories, Burlingame, Cal., U.S.A.). Дигоксигенин детектировали с помощью системы FITC-антидигоксигенин (Boehringer, Mannenheim, Germany). Хромосомы окрашивали с 6 мг/мл DAPI в Vectashield.
Анализ FISH-сигнала был проведен на флуоресцентном микроскопе «Axiophot» («Zeiss», Германия) с соответствующей системой фильтров. Для анализа изображений, производили фотосъемку на пленку Fuji 400. После проявки пленку сканировали и обрабатывали изображение на компьютере.
Результаты
1. Слот-блот анализ геномной ДНК A. fistulosum с теломерным повтором TTAGGG
Для анализа генома A. fistulosum на наличие теломерного повтора (TTAGGG)n, характерного для позвоночных и ранее обнаруженного у некоторых представителей порядка Аспараговых, таких как Aloe, Hyacinthella, Othocalis siberica [11, 12] был использован метод слот-блот гибридизации и флуоресцентной in situ гибридизации. ДНК A. fistulosum была перенесена на мембрану и гибридизо-вана с меченым повтором (TTAGGG)n. В качестве положительного контроля была использована ДНК курицы (Рис. 1).
Слот-блот анализ не выявил наличия этих последовательностей в геноме A. fistulosum, также как это было показано раннее для
A. cepa [8]. Флуоресцентная in situ гибридизация так же продемонстрировала отсутствие последовательностей повтора (TTAGGG) на хромосомах A. fistulosum (Рис. 2)
Таким образом, нами показано отсутствие у A. fistulosum протяженных участков, содержащих последовательно повторенный повтор TTAGGG, который был недавно обнаружены у высших растений филогенетической ветви Аспараговые.
2. ПЦР анализ геномной ДНК с праймерами на теломерный повтор TTAGGG и TTTAGGG
Данные, полученные в ходе сравнительно недавних исследований, проведенных на представителях филогенетической ветви Ас-параговых, позволяют сделать вывод о наличии в геноме целого ряда семейств, теломерного повтора TTAGGG и теломераз, добавляющих этот повтор на окончания хромосом [8, 13]. Однако, у Луковых, в отличии от филогенетически близких родов повтор TTAGGG не детектируется методами на основе ДНК-гибридизации. Нами был использован чувствительный метод одностороннего ПЦР с праймерами комплиментарными повтору TTTAGGG (PTelo 1 и PTelo2), и HTelo 1 и HTelo2, гибридизующиеся с повтором TTAGGG.
При использовании одностороннего ПЦР амплификация фрагментов ДНК определенного размера возможна в том случае, если участки с которыми гибридизуются праймеры находятся в инвертированном положении достаточно близко друг к другу. ПЦР с праймерами HTelo 1 и HTelo2, а также PTelo 1 и PTelo2 выявил наличие в геномах A. cepa и A. fistulosum последовательностей ДНК, гибридизующихся с праймерами. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР показал наличие в продуктах амплификации несколько четких фрагментов и протяженные «шмеры» (фрагменты ДНК, варьирующей длины) (Рис. 3).
При этом размеры амплифицированных фрагментов ДНК различались у обоих видов и обнаруживали схожесть только при ПЦР с праймером НTelo 2 (Рис. 3, дорожки 2 и 4). При повышении температуры отжига
Вверху - контроль (куриная ДНК); внизу - ДНК A. fistulosum
Рисунок 1. Слот-блот гибридизация с меченым повтором TTAGGG
Рисунок 2. Флюоресцентная in situ гибридизация с меченной пробой повтора TTAGGG на хромосомы A. fistulosum.
1 2 3 t 5 М 6 7 а ¥ 10 М
I I
А. п'|чі A. flsLufcusinn
дорожки 1 и 6 с праймером НТеїоІ, дорожки 2 и 7 с праймером НТе1о2, дорожки 3 и 8 с праймером РТеїоІ, дорожки 4 и 9 с праймером РТе1о2, дорожки 5 и 10 отрицательный контроль, М-маркер размеров.
Рисунок 3. Результаты ПЦР с теломерными праймерами на ДНК А. сера (дорожки 1, 2, 3, 4) и А. fistulosum (дорожки 6, 7, 8, 9).
до 70° С не происходило изменение размеров продуктов амплификации, что указывает на высокую степень гомологии между праймерами и сайтами посадки праймеров (данные не представлены).
Такие результаты могут указывать на то, что короткие участки теломерных повторов обоих типов в прямой и обратной ориентации присутствуют в геноме. Однако, отсутствие сигнала при гибридизации меченного повтора TTAGGG с ДНК A. fistulosum указывает на небольшое их количество. Более детальную информацию возможно получить при сиквенировании амплифицируемых продуктов и локализации их на хромосомах A. fistulosum.
3. Локализация продуктов амплификации праймеров HTelo1 и HTleo2 на хромосомах A. fistulosum.
Для изучения локализации продуктов ПЦР с теломерными праймерами HTelo 1 и HTelo2 была использована флюоресцентная in situ гибридизация. Продукты амплификации с этими праймерами были помечены и гибридизованы на хромосомы A. fistulousum. Продукты амплификации праймера HTelo 1 показали теломерную локализацию на некоторых, но не всех хромосомах A. fistulousum (рис. 4).
Слабый сигнал указывает на небольшое количество в продуктах амплификации последовательностей, гибридизующихся с окон-
Рисунок 4. Результаты флуоресцентной in situ гибридизации продуктов ПЦР праймера HTelol на хромосомы A. fistulousum.
чаниями хромосом A. fistulousum, по этой причине сигнал мог не наблюдаться на окончаниях всех хромосом. Возможно, при ПЦР с праймером HTelo 1 амплифицируются единицы сателлитного повтора, присутствующего на концах хромосом A. fistulousum.
Однако при использовании в качестве метки единиц сателлитного повтора и продуктов односторонней амплификации с са-теллитными праймерами, всегда обнаруживали сигнал в интерстициальном гетерохроматине, а продукты ПЦР с праймером HTelo 1 всегда показывали только теломерную локализацию.
При проведении флуоресцентной in situ гибридизации с продуктами ПЦР праймера HTelo2 на хромосомы A. fistulosum сигнал не детектировался ни в теломерном, ни в интерстициальном положении (данные не представлены). Это указывает на разнородную природу последовательностей в продуктах ПЦР теломерных праймеров HTelo 1 и HTelo2.
Поскольку, по результатам слот-блот-гибридизации и флуоресцентной in situ гибридизации окончания хромосом A. fistulosum не содержат теломерные повторы TTAGGG, характерные для позвоночных, можно говорить о присутствии в теломерной области хромосом неизвестной повторяющейся ДНК.
4. Изучение продуктов амплификации с праймерами HTelo 1 и HTelo2
Для анализа нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, амплифициру-емых теломерными праймерами HTelo 1 и HTelo2 продукты ПЦР были клонированы. Несколько клонов были отобраны для сик-венирования, так как их размер соответствовал наиболее выраженному фрагменту в продуктах ПЦР.
Как и ожидалось, сиквенированные фрагменты не содержали длинных трактов теломерного повтора TTAGGG (данные не представлены). Кроме того, анализ сиквени-рованных последовательностей выявил полное отсутствие гомологии не только между продуктами разных праймеров, но и между продуктами амплификации одного праймера. Такие данные указывают на различное
расположение сайтов посадки праймеров и разнородность продуктов амплификации. Для поиска гомологий в базах данных к сик-венированным последовательностям использовали программу BLAST. Однако, последовательностей, гомологичных к сиквени-рованным, обнаружено не было. Сиквениро-ванные фрагменты показали отсутствие гомологии и с последовательностями, локализующимися в теломерной части хромосом A. fistulosum. Например, не было обнаружено гомологии к сателлитному повтору. Такие данные подтверждают наличие в теломерной области хромосом несателлитной ДНК.
Мы предположили, что при ПЦР с праймером HTelo 1 происходит амплификация фрагментов терминального сателлитного повтора 378 п.н. На это может указывать сигнал на окончаниях хромосом при выполнении флуоресцентной in situ гибридизации с мечеными продуктами амплификации этого праймера. Для подтверждения этой гипотезы была использована Саузерн-гибридизация с сателлитным повтором, меченым праймерами 34902 и 34903. Матрицей служила геномная ДНК A. fistulousum. Однако, мы не получили достоверный сигнал ни от одной из дорожек, содержащих продукты амплификации, кроме положительного контроля (рис. 5).
Такие результаты могут указывать на амплификацию праймером HTelo 1 неизвестного терминального повтора.
Поскольку последовательности, гибри-дизующиеся с окончаниями хромосом A. fistulousum представлены малым числом копий в продуктах амплификации, их идентификация представляет непростую задачу.
Обсуждение
Используя флуоресцентную in situ гибридизацию, Саузерн-гибридизацию, асси-метричный ПЦР было показано, что некоторые представители филогенетической ветви Аспараговые, к которым относятся и Луковые, потеряли растительный теломерный повтор TTTAGGG и взамен, на концах хромосом, содержат теломерный повтор, характерный для позвоночных - TTAGGG [7]. У некоторых представителей семейства Луковых, Iphenion uniflorum, Tulbaghia violacea, также
был обнаружен теломерный повтор TTAGGG, характерный для позвоночных [8].
Для обнаружения теломерного повтора TTAGGG на концах хромосом A. fistulosum мы использовали флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) и слот-блот-гибридизацию. При проведении FISH анализа с меченой последовательностью повтора TTAGGG сигнал не был обнаружен. Учитывая то, что чувствительность FISH метода составляет > 10 тыс.п.н., возможно, что мы не смогли детектировать сигнал из-за того, что протяженность повтора была меньше порога чувствительности метода. Слот-блот-гибридизации также показала отсутствие в геноме A. fistulosum теломерного повтора TTAGGG, характерного для позвоночных и некоторых высших растений. Такие данные соответствуют результатам, которые получила Sykorova и др. [8] при изучении A. cepa, в геноме которого не было обнаружено теломерных повторов TTAGGG (характерного для позвоночных), а также TTAGG (характерного для насекомых), TTTTAGGG (характерного для водорослей), TTTTGGGG и TTGGGG (характерных для простейших).
Однако при проведении ПЦР реакций с использованием праймеров, гомологичным к теломерным повторам арабидопсис-типа
І 2 Э А =5 t f rt ■ ■.. p •
É
>■
Р-Е ,
m —
Bl
В - результаты гибридизации 1 - продукт ПЦР с праймером НТе1о1; 2 - продукт ПЦР с праймером НТе1о2; 3 - продукт ПЦР с праймером НТе1о1 (А.сера); 4 - продукт ПЦР с праймером НТе1о2 (А.сера); 5 - продукт ПЦР продукт праймера НТе1о1 (ДНК курицы);
6 - ПЦР продукт праймера НТе1о2 (ДНК курицы); 7 - положительный контроль, продукт ПЦР с праймерами 34902 и 34903.
Рисунок 5. Результаты Саузерн-гибридизации меченного ПЦР терминального сателлитного повтора с продуктами амплификации праймеров НТе1о1 и НТе1о2. А - результаты электрофореза.
PTelo 1,2 (TTTAGGG) и повтору, характерному для позвоночных HTelo 1,2 (TTAGGG) нами были выявлены четкие фрагменты ДНК и большое количество фрагментов варьирующей длины. Такие данные могут говорить о наличии в геноме коротких участков теломерных повторов обоих типов в прямой и инвертированной ориентации. Однако даже если такие короткие теломерные повторы позвоночных и арабидопсис-типа присутствуют на концах хромосом, они не способны формировать функциональные теломеры. Поскольку, как было показано ранее, мутантные растения арабидопсиса, утратившие теломеразу, и терявшие по 250-500 п.н. за поколение, при длине тело-мер около 900 п.н. утрачивали жизнеспособность [14].
При клонировании и секвенировании некоторых продуктов ПЦР нами было установлено, что они состоят из разнородных последовательностей, не содержащих повтор TTAGGG. Анализ таких последовательностей показал, что они являются уникальными последовательностями не гомологичными друг другу. Подобные результаты были получены при анализе рода Cestrum [15, 16].
При сравнении сиквенированных последовательностей с сателлитным повтором нами не обнаружено гомологии. FISH c использованием в качестве пробы смеси продуктов ПЦР с праймером HTelo 1 показала строго теломерную локализацию сигнала. Такой результат позволяет выдвинуть две гипотезы: 1) наличие ПЦР продуктов с гомологией к сателлитной ДНК, которые были получены в результате посадки праймеров в теломерной области и амплификации единиц сателлитного повтора или 2) наличие на концах хромосом неизвестного повтора, возможно выполняющего функцию теломерного. Так как сигнал локализовался только в терминальном гетерохроматине, в то время
HTdfcll
ф-
..I' I А
Рисунок 6. Модель амплификации повтора, заместившего теломерный повтор ТТЛООО.
как при гибридизации сателлитного повтора сигнал обнаруживался и в интерстициальном гетерохроматине, то первая гипотеза отвергается.
Такие данные позволяют сделать предположение, что на окончаниях хромосом присутствуют остатки теломерного повтора TTAGGG. Таким образом, у Луковых могло произойти замещение предкового повтора арабадопсис-типа на повтор, характерный для позвоночных. Однако в процессе эволюции произошла утрата и этого повтора. Остатки этого повтора могли послужить сайтами посадки для праймеров и амплифици-ровать последовательность, заместившую теломерный повтор TTAGGG (рис. 6).
Подтверждением этой гипотезы может служить отсутствие сигнала при гибридизации продуктов ПЦР праймера HTelo2. Связано это с тем, что праймер HTelo 1 удлиняется по направлению к теломере, таким образом, позволяя амплифицировать тот повтор, который, возможно, заместил теломерный повтор TTAGGG.
Предполагается, что в результате единственного эволюционного события около 80 млн. лет назад в предковом виде большинства семейств Аспараговых, произошла потеря теломерного повтора, характерного для высших растений. Таким образом, около 6 300 видов (примерно 2,5% покрытосеменных) потеряли повтор TTTAGGG [17]. Однако, у представителей всех семейств, потерявших этот повтор, взамен был обнаружена теломерная последовательность, характерная для позвоночных и показано наличие тело-меразы, добавляющей этот повтор на окончания хромосом.
Следует отметить, что не у всех представителей рода Allium отсутствуют теломерные повторы известных типов. Так, по результатам слот-блот-анализа у Allium dregeanum показано наличие в геноме повтора TTTAGGG, характерного для высших растений [8]. Тем не менее, ни для одного из представителей семейства Луковых не показано наличие теломеразы, восстанавливающей теломерный повтор.
Возможно, в процессе эволюции у Луковых произошла потеря теломерного повто-
ра и функцию защиты теломер стал выпол- [9]. Также, возможно, что произошло заменять сателлитный повтор, обогащенный рет- щение этого повтора на другой, неизвестный
ротранспозонными последовательностями для других групп организмов.
Список использованной литературы:
1. Zakian V.A. Telomeres: beginning to understand the end // Science. -1995. - Vol. 270. - P. 1601-1607.
2. Heslop-Harrison J.S., Leitch A.R., Schwarzacher T. The physical organization of interphase nuclei // Heslop-Harrison J. S. and Flavell R. B. In The Chromosome - Oxford: BIOS Scientific Publisher, 1993 - P. 221.
3. de Lange T. Human telomeres are attached to the nuclear matrix // EMBO J. - 1992. -Vol. 11. - P. 717.
4. Егоров Е.Е. Теломеры, теломерная ДНК, хромосомы. // Биологичесие мембраны. -2001.- №3. - C. 249.
5. Fuchs J., Brandes A., Schubert I. Telomere sequences localization and karyotype evolution in higher plants // Plant Syst. Evol. - 1995. - Vol. 196. - P. 227.
6. Richards E.J. and Ausubel F.M. Isolation of a higher eucariotic telomere from Arabidopsis thaliana // Cell. -1988. -Vol. 53. -P. 127.
7. Adams S.P., Hartman T.P.V., Lim K.Y., Chase M.W., Bennett M.D., Leitch I.J. and Leitch A.R. Loss and recovery of Arabidopsis-type telomere repeat sequences 5’-(TTTAGGG) -3’ in the evolution of a major radiation of flowering plants // Proc. R. Soc. Lond. -2001. -Vol. B268. - P. 1541.
8. Sykorova E., Lim K.Y., Kunicka Z., Chase M.W., Bennett M.D., Fajkus J. and Leitch A.R. Telomere variability in the monocotyledonous plant order Asparagales // Proc. R. Soc. Lond. -2003. - Vol. B270. - P. 1893.
9. Фесенко И.А., Хрусталева Л .И. и Карлов Г.И. Изучение организации сателлитного повтора 378 п.н. в терминальном гетерохроматине Allium fistulosum. Генетика. -2001. - N 38: 7.C. 893-903.
10. Karlov G.I., Khrustaleva L.I., Lim K.B., Van Tuyl J.M. Homoeologous recombination in 2n-gametes producing interspecific hybrids of Lilium (Liliaceae) studied by genomic in situ hybridization (GISH). // Genome. -1999. - Vol. 42. - P. 681.
11. Weiss-Schneeweiss H., Riha K., Jang C.G., Puizina J., Scherthan H., Schweizer D. Chromosome termini of the monocot plant Othocallis siberica are maintained by telomerase, which specifically synthesizes vertebrate-type telomere sequences. // The Plant Journal. -2004. - Vol. 37. - P. 484.
12. Weiss H. & Scherthan H. Aloe sp. - plant with vertebrate-like telomeric sequence. // Chromos. Res. - 2002. - Vol. 10. - P. 155.
13. Sykorova E., Leitch A.R. and Fajkus J. Asparagales telmerases which synthesize the human type of telomeres. // Plant Mol. Biol. -2006. - Vol. 60, N5. - P. 633-646.
14. Riha K. and Shippen D.E. Ku is required for telomeric C-rich strand maintenance but not for end-to-end chromosome fusion in Arabidopsis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003. - Vol. 100. - P. 611.
15. Sykorova E., Lim K.Y., Chase M.W., Knapp S., Leitch I.J., Leitch A.R. and Fajkus J. The absence of Arabidopsis-type telomeres in Cestrum and closely related genera Vestia and Sessea (Solanaceae): first evidence from eudicots. // The Plant Journal. -2003. Vol.- 34. - P. 283.
16. Sykorova E., Lim K.Y., Fajkus J., Leitch A.R. The signature of the Cestrum genome suggests an evolutionary response to the loss of (TTTAGGG)n telomeres. // Chromosome. - Vol. 112. - P. 164.
17. Fay M.F. et. al. Phylogenetic studies of Asparagales based on four plastid DNA regions. // Wilson K.L. & Morrison D.A. (ed.) In Monocots: systematic and evolution. - Melbourne: CSIRO, 2000. - P. 360.
