CC BY
34
УДК 577.112:575]:616.248(470.323)
АНАЛИЗ АССОЦИАЦИИ ДЕЛЕЦИОННЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ ГЛУТАТИОН S-ТРАНСФЕРАЗ GSTM1 И GSTT1 С ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ И ОСОБЕННОСТЯМИ ЕЕ КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ
В КУРСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ
© Иванов В.П., Полоников А.В., Солодилова М.А., Кожухов М.А., Панфилов В.И.
Кафедра медицинской биологии, генетики и экологии Курского государственного медицинского университета; Курская областная клиническая больница
В рамках настоящего исследования проведен анализ ассоциации делеционных полиморфизмов генов глутатион^-трансфераз GSTM1 и GSTT1 с предрасположенностью к бронхиальной астме и особенностями ее клинических проявлений в курской популяции. Установлена ассоциация гаплотипа GSTMldell^GSTTldell с предрасположенностью к бронхиальной астме. Полиморфизм гена GSTM1 оказывал влияние на возраст манифеста, частоту и длительность обострений заболевания. Полиморфизм гена GSTT1 оказывал влияние на степень прогрессирования астмы и частоту обострений заболевания. Полученные результаты свидетельствуют, что делеционные полиморфизмы GSTM1 и GSTT1 являются не только генетическими факторами риска бронхиальной астмы, но и оказывают существенное влияние на характер течения и особенности клинических проявлений заболевания.
Ключевые слова: бронхиальная астма, наследственная предрасположенность, кандидатные гены, клинические проявления, глутатион^-трансферазы, делеционный полиморфизм.
THE ASSOCIATION STUDY OF GLUTATHIONE S-TRANSFERASES GSTM1 AND GSTT1 NULL-POLYMORPHISMS WITH SUSCEPTIBILITY TO BRONCHIAL ASTHMA AND THEIR CONTRIBUTION TO CLINICAL MANIFESTATIONS OF THE DISEASE IN KURSK POPULATION Ivanov V.P., Polonikov A.A., Solodilova M.A., Kozhukhov M.A., Panfilov V.I.
Medical Biology, Genetics and Ecology Department of the Kursk State Medical University;
Kursk regional clinical hospital Association study of glutathione-S-transferases GSTM1 and GSTT1 null-polymorphisms with susceptibility to asthma and their contribution to clinical manifestations of the disease in Kursk population has been carried out. The significant association of GSTMldell^GSTTldell haplotype with susceptibility to asthma has been revealed. We found that both GSTM1 and GSTT1 null-polymorphisms were associated with the course and several clinical manifestations of the disease. These data show that null-polymorphisms of glutathione-S-transferases GSTM1 and GSTT1 can be considered both as candidate genes of susceptibility to asthma and factors modifying clinical manifestations of the disease in Kursk population.
Key words: bronchial asthma, genetic susceptibility, candidate genes, clinical manifestations, glutathione-S-transferases, null-polymorphism.
Бронхиальная астма (БА) представляет собой мультифакториальное заболевание, в развитии которого существенная роль принадлежит наследственной предрасположенности и сложной системе взаимодействий генотипа с окружающей средой. Несмотря на тот факт, что в большинстве случаев БА развивается посредством IgE-зависимых имму-ноаллергических механизмов, молекулярные и клеточные компоненты которых довольно подробно изучены [11, 12, 13, 14, 15], ключе-
вым патогенетическим звеном любой формы заболевания является состояние гиперреактивности бронхов, означающее повышенную бронхоконстрикторную реакцию на физико-химические факторы. Клиническое разнообразие астмы и зачастую сочетание аллергической компоненты с сенсибилизацией к различным химическим агентам требуют разностороннего исследования не только аллергической БА, но и других распространенных форм этой патологии. В связи с изложенным
становится очевидным, что при изучении генетической гетерогенности БА представляется актуальным анализ патогенетической вовлеченности генов-модификаторов, эффект которых во многом определяется влияниями экзогенных химических факторов. Последние способны оказывать как прямое токсическое и раздражающее действие на бронхиальное дерево, так и проявлять сенсибилизирующие свойства in vivo в результате активации ферментами биотрансформации ксенобиотиков (ФБК). Одним из наиболее важных этапов детоксикации чужеродных соединений - токсических веществ, канцерогенов, мутагенов, пестицидов, красителей, лекарств является их конъюгация с глутатионом, которая осуществляется посредством целого класса ферментов - глутатион^-трансфераз, широко представленных во всех тканях и органах, в том числе и в легких [1, 4, 5, 6]. Образующиеся при этом конъюгаты менее токсичны и легко выводятся из организма. Тесным взаимодействием глутатион^-трансфераз с другими ферментами детоксикации ксенобиотиков и антиоксидантной системы обеспечивается резистентность клеток и организма к токсическим веществам и продуктам перекисного окисления липидов, свободнорадикальному окислению [1, 4]. Глутатион^-трансферазы участвуют также в метаболизме некоторых эндогенных соединений: гормонов, липидов, простагландинов и лейкотриенов [1, 5]. Среди 5 классов глутатион^-трансфераз: микро-сомальной, а, ц, п и 9 наиболее частым объектом для исследования являются GSTM1 и GSTT1 формы, имеющие в структуре кодирующих их генов распространенные в популяциях европеоидов протяженные делеции, фактически блокирующие in vivo синтез соответствующих ферментов [1]. В настоящее время достаточно подробно исследованы де-леционные полиморфизмы генов GSTM1 и GSTT1 только при атопической БА у детей [3, 6]. Целью настоящего исследования явилось комплексное изучение вклада делецион-ных полиморфизмов генов глутатион-S-трансфераз GSTM1 и GSTT1 в предрасположенность аллергической и неаллергической форм бронхиальной астмы и их влияние на течение и особенности клинических проявлений заболевания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследования послужила выборка из 212 больных БА, находившихся на стационарном лечении в пульмонологическом отделении областной клинической больницы г. Курска за период с 2003 по 2004 гг. Диагностика бронхиальной астмы осуществлялась согласно критериям ВОЗ [2]. Контрольную группу составляли 238 практически здоровых добровольцев. Весь обследуемый контингент был представлен жителями Курской области русской национальности.
Выделение тотальной ДНК осуществляли из цельной венозной крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции [7]. Типирование делеционных полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 осуществлялось с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно протоколу, описанному M. Arand с соавторами [9], на программируемом термоциклере МС2 ("ДНК-технология"). В качестве положительного контроля амплификации использовали фрагмент Р-глобинового гена [10]. Продукты амплификации разделяли в 2%-агарозном геле с этидиумбромидом и визуализировали в проходящем УФ-свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе GDS-8000 (UVP, США). Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР гена представлено на рисунке 1.
Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программного пакета Statistica 5.5. Разницу в распределении частот генотипов и их сочетаний между группами рассчитывали с помощью критерия х c поправкой Йейтса. В случае малой численности каких-либо генотипов (n<5) для оценки достоверности различий между группами использовали двусторонний точный критерий Фишера [8]. Различия рассматривали как достоверные при уровнях значимости p<0.05 и p<0.10. Об ассоциации генотипов с предрасположенностью к бронхиальной астме судили по величине отношения шансов (odds ratio, OR) [16] -показателю, отражающему, во сколько раз
GSTT1del/del ? * ?
4 4
GSTMldel/del
Рис. 1. Разделение амплифицированных фрагментов генов GSTM1 и GSTT1 на 2%-агарозном геле. Обозначения: Фрагмент гена в8ТМ1 амплифицировался размером 215 п.н. (верхние фрагменты), гена в8ТТ1 - размером 480 п.н. (нижний фрагмент). Фрагмент р-глобина - размером 350 п.н. использовался в качестве положительного контроля амплификации (средний фрагмент). Гомозиготы в8ТТЫеШе1 обозначены тремя стрелками сверху. Гомозиготы в8ТМЫе1Ме1 обозначены двумя стрелками снизу.
вероятность оказаться в группе "случай" (больные) отличается от вероятности оказаться в группе "контроль" (здоровые) для носителя изучаемого генотипа: OR = (A/B) / (C/D), где A и B - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип соответственно, D и C- количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип соответственно. При OR=1 ассоциация отсутствовала, OR>1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с исследуемым генотипом ("фактор риска") и OR<1 - как отрицательную ассоциацию ("фактор устойчивости"). Границы 95%-го доверительного интервала (CI) для OR вычисляли по методу Woolf [8]. Проверку распределений количественных признаков (параметры, характеризующие клиническое течение заболевания) на нормальность проводили по критерию Колмогорова-Смирнова. Для оценки влияния генотипов на количественные признаки использовали однофактор-ный дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице 1 представлены данные по частотам генотипов GSTM1 и GSTT1 у здоровых лиц и больных БА. Соотношение частот генотипов по делеционным полиморфизмам генов GSTM1 и GSTT1 в обеих группах характеризовало генетическую общность популяции Курской области с другими европео-
идными популяциями Западной и Восточной Европы и Северной Америки.
Как видно из таблицы 1, частоты генотипов GSTM1 и GSTT1 больных БА не отличались от таковых в контрольной группе (р>0.05).
Сравнительный анализ распределений частот изучаемых генотипов больных аллергической и неаллергической формами БА со здоровыми людьми также не выявил различий между группами больных (р>0.05).
В связи с тем, что изучение распределений частот генотипов GSTM1 и GSTT1 раздельно для каждого из ферментов не дает полного представления о формировании фенотипа конъюгации ксенобиотиков с глута-тионом in vivo, нам представлялось важным оценить частоты гаплотипов (комбинаций генотипов) в группе больных БА и у здоровых. Нами оценивались четыре гаплотипа: GSTM1+/GSTT1+, GSTM1+/GSTT1dell, GSTM1dell/GSTT1+ и GSTM1dell/GSTT1dell. Наиболее распространенными были комбинации генотипов GSTM1+ и GSTT1+, а также GSTM1dell и GSTT1+, частоты которых составили 39-40% и 47-49% соответственно. Межгрупповое сравнение частот сочетаний генотипов позволило установить статистически достоверную ассоциацию гаплотипа GSTM1dellxGSTT1dell с предрасположенностью к бронхиальной астме (x2=3.15; p=0.05; OR=2.18; CI:1.02-5.25). При раздельном сравнении больных аллергической и неаллергической БА с контролем оказалось, что установленная ассоциация была характерна только
Таблица 1
Распределение частот генотипов GSTM1 и GSTT1 в контрольной группе и среди больных бронхиальной астмой
Исследуемые группы Распределение генотипов GSTM1, % Распределение генотипов GSTT1, %
del/del генотип + генотип del/del генотип + генотип
Контрольная группа (п=238) 53 47 11 89
Больные бронхиальной астмой (п=212) 54 46 14 86
х2 (Р) 0.05 (0.83) 1.68 (0.19)
для больных аллергической формой заболевания (х2=3.13; р=0.05; OR=2.44; С1:1.09-6.11). Выявленные особенности согласуются с данными, полученными при изучении ато-пической бронхиальной астмы у детей [3, 6].
В рамках настоящего исследования нам представлялось важным оценить влияние де-леционных полиморфизмов генов глутатион-S-трансфераз GSTM1 и GSTT1 на течение и особенности клинических проявлений бронхиальной астмы. Анализ параметров течения заболевания показал статистически достоверное их отклонение от нормального распреде-
ления (р<0.05). В этой связи для оценки влияния изучаемых генотипов на особенности течения заболевания был применен непараметрический однофакторный дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису, результаты которого представлены в таблице 2.
При 90% уровне значимости установлено влияние делеционных полиморфизмов GSTM1 и GSTT1 на течение бронхиальной астмы. Полиморфизм гена GSTM1 был ассоциирован с возрастом манифеста БА (х2=2.47; р=0.10), частотой (х2=1.89; р=0.10) и длитель-
Таблица 2
Анализ ассоциации делеционных полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 с особенностями течения бронхиальной астмы
Особенности течения БА Генотип GSTM1 Генотип GSTT1 Сочетание генотипов GSTM1 и GSTT1
Возраст манифеста Х2=2.47 (р=0.10)* - -
Тяжесть течения - - Х2=4.10 (р=0.09)*
Степень прогрессирования - Х2=1.96 (р=0.10)* Х2=3.75 (р=0.07)*
Частота обострений Х2=1.89 (р=0.10)* Х2=2.24 (р=0.08)* Х2=4.16 (р=0.09)*
Длительность обострений Х2=2.44 (р=0.09)* - -
Примечание: * - обозначены статистически значимые ассоциации при р<0.10
ностью (х2=2.44; р=0.09) обострений заболевания. В то время как полиморфизм гена GSTТ1 оказывал влияние на степень прогрес-сирования астмы (х2=1.96; р=0.10), а также частоту обострений заболевания (х =2.24; р=0.08). Кроме того, фенотип конъюгирова-ния, предсказанный по комбинации генотипов глутатион^-трансфераз GSTM1 и GSTT1, был ассоциирован со степенью тяжести (х2=4.10; р=0.09) и прогрессированием бронхиальной астмы (х2=3.75; р=0.07), а также оказывал влияние на частоту обострений заболевания (х2=4.16; р=0.09). Полученные данные могут свидетельствовать, что нарушение конъюгации с глутатионом, связанное с дефицитом глутатион^-трансфераз клинически проявляется более ранним развитием БА, тяжелым течением и прогрессированием
заболевания. По-видимому, участие глутати-он^-трансфераз GSTM1 и GSTT1 в метаболизме эндогенных медиаторов воспаления (простагландинов Н2, D2, Е2, F2a, лейкотриена С4), патогенетически связанных с астмой, предопределяет изменчивость характера течения и степени выраженности ее клинических проявлений. В этой связи представлялось важным изучить взаимосвязь полиморфизма GSTM1 и GSTT1 с особенностями клинических проявлений бронхиальной астмы. Данные по ассоциации генов GSTM1 и GSTT1 с клиническими особенностями бронхиальной астмы представлены в таблице 3.
Установлена статистически достоверная ассоциация генотипа GSTT1del/del с развитием у больных БА аллергического ринита (х2=4.66; р=0.03), полипозного этмоидита
Таблица 3
Анализ ассоциации делеционных полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 с особенностями клинических проявлений бронхиальной астмы
Распределение генотипов GSTM1 Распределение генотипов GSTT1
Клинические проявления бронхиальной астмы Частота больных БА, % х2 (Р) Частота больных БА, % х2 (Р)
del/del + гено- del/del + гено-
генотип тип генотип тип
Вторичная есть 55 45 0.16 13 88 0.65
эмфизема легких нет 52 58 (0.68) 16 84 (0.42)
Диффузный есть 54 46 0.18 18 82 3.01**
пневмосклероз нет 44 42 (0.67) 11 89 (0.05)
Полипозный есть 38 63 1.06 31 69 **
этмоидит нет 54 46 (0.30) 13 87 р=0.03
Аллергический есть 46 54 0.01 23 77 4.66*
ринит нет 54 46 (0.32) 11 89 (0.03)
Степень дыхательной 0-1 42 58 2.45 19 81 0.62
недостаточности 2-3 56 44 (0.12) 13 87 (0.43)
Стадия хронического легочного сердца 0-1 54 46 0.06 14 86 0.00
1-2 52 48 (0.80) 15 85 (0.98)
Примечание: * - обозначены статистически значимые различия, полученные при межгрупповом сравнении больных БА;
** - обозначены статистически значимые различия, полученные при сравнении больных БА и контрольной группы.
(р=0.03) и диффузного пневмосклероза (Х2=3.01; р=0.05). Генотипы GSTM1 не были ассоциированы ни с одним из изученных клинических показателей. Полученные данные свидетельствуют, что делеционный полиморфизм гена GSTT1 обладает плейотроп-ным (множественным) эффектом на формирование патогенетически связанных с БА фе-нотипических проявлений, таких как аллергический ринит и полипозный этмоидит.
В результате проведенного исследования установлена статистически значимая ассоциация делеционного гаплотипа GSTM1de1/de1xGSTT1de1/de1 с подверженностью БА и сочетанное влияние этих полиморфизмов на клинические проявления заболевания в курской популяции. Таким образом, делеционные полиморфизмы GSTM1 и GSTT1 с полным основанием могут быть отнесены к генетическим факторам риска развития преимущественно аллергической БА и рассматриваться в качестве кандидатных генов заболевания с умеренными, но в то же время синергичными фенотипическими эффектами. При этом, генотип GSTT1de1/de1 обладает большей рисковой значимостью, чем генотип GSTМ1de1/de1, что согласуется с результатами ранее проводимых исследований в популяции детей с атопической БА [3, 6]. Механизмы, посредством которых глутатион-S-трансферазы вовлекаются в иммунно-патологические звенья развития бронхиальной астмы, могут быть связаны с недостаточной инактивацией реактивных метаболитов, цитотоксические эффекты которых способствуют образованию аутоантигенов с индукцией клеточного и гуморального иммунного ответа. Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что выявленные ассоциации могут указывать на целесообразность доклинического выявления делеционных генотипов глутатион^-трансфераз GSTM1 и GSTT1 с целью прогнозирования особенностей клинического течения бронхиальной астмы и разработки патогенетически обоснованных индивидуализированных лечебно-профилактических мероприятий.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э. и др. Геном человека и гены предрасположен-
ности (Введение в предиктивную медицину). - СПб.: Интермедика, 2000. - 272 с.
2. Бронхиальная астма. Глобальная стратегия: Совместный доклад Национального института Сердце, Легкие, Кровь и Всемирной организации здравоохранения // Пульмонология. -1996 (Приложение).
3. Вавилин В.А., Макарова С.И., Ляхович В.В. и др. Ассоциация полиморфных генов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к бронхиальной астме у детей с наследственной отягощенностью и без таковой // Генетика. - 2002. - Т. 38. - № 4. -С. 539-545.
4. Кулинский В.И. Обезвреживание ксенобиотиков // Соросовский образовательный журнал. - 1999. - № 1. - С. 8-12.
5. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи современной биологии. - 1990. - Т. 110. - № 1(4). -20-33.
6. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Макарова С.И. и др. Роль ферментов биотрансформации ксенобиотиков в предрасположенности к бронхиальной астме и формировании особенностей ее клинического фенотипа // Вестник РАМН. - 2000. - № 12. - С. 36-41.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 480 с.
8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных (Применение пакета прикладных программ Statistica) // М.: Медиа Сфера, 2003. - 312 с.
9. ArandM., Muhlbauer R., Hengstler J., Jager E., Fuchs J., Winkler L., Oesch F. A multiplex polymerase chain reaction protocol for the simultaneous analysis of the glutathione S-transferase GSTM1 and GSTT1 polymorphisms. Anal. Bio-chem., 236: 184-186, 1996.
10. Bell D.A., Taylor J.A., Paulson D.F., Robertson C.N., Mohler J.L., Lucier G.W. Genetic risk and carcinogen exposure: a common inherited defect of the carcinogen-metabolism gene glutathione S-transferase M1 (GSTM1) that increases susceptibility to bladder cancer. J. Natl. Cancer Inst., 85: 1159-1164, 1993.
11. Cookson W.O.C.M. The alliance of genes and environment in asthma and allergy // Nature -1999. - V. 402 Suppl. - Р. 5-11.
12. Cookson W.O.C.M., Sharp P.A., Faux J.A., Hopkin J.M. Linkage between immunoglobulin E responses underlying asthma and rhinitis and chromosome 11q // Lancet - 1989. - 1. -P. 1292-1295.
13. Holgate S.T. The epidemic of allergy and asthma // Nature - 1999. - V. 402 Suppl. -P. 2-4.
14. Noguchi E., Arinami T. Candidate genes for atopic asthma: current results from genome screens // Am J Pharmacogenomics. - 2001. - Vol. 1. - № 4. - P. 251-261.
15. Palmer L.J., Cookson W. Genomic Approaches to Understanding Asthma // Genome research. -2000. - Vol. 10. - № 9. - P. 1280-1287.
16. Schlesselman J. Case-control studies. Design, conduct, analysis // New York, Oxford: Oxford University Press., 1982. - P. 58-96.
