CC BY
19ГЕНЕТИКЛ
УДК 577.2:б33.15 http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.4(33).201б.88ббб
Aлeльний cтaн ключoвиx гeнíв кapoтинoгeнeзу зa ДHK-мapкepaми у л1*тй кукуpудзи тa ïxrnx гíбpидíв
Ю. О. Гoнчapoв, T. M. Caтapoвa, Б. В. Дзюбeцький, В. Ю. Чepчeль
ДУ 1нcmumym зepнoвux кулbmyp HAAHyKpaihu, вул. В. Bepнaдcькoгo, 14, м. Днinpo, 49Ü27, e-mail: [email protected]
Meïa. Анал1'з aлeльнoгo cтaнy ключoвиx гeнiв кapoтинoгeнeзy - гeнa лiкoпiн-e-циклaзи (lcys) та гeнa ß-кapoтингiдpoкcилaзи (crtRBl) за ДHК-мapкepaми lcys-3'INDL, lcye-SNP21б та crtRB1-3'TE y л1'н1'й кyкypyдзи вiтчизнянoï ceлeкцiï та ïxнix гiбpидiв. Meтoди. Bидiлeння ДНК, пoлiмepaзнa лaнцюгoвa pea^ifl, гeль-eлeктpoфopeз. Peзульïaïи. Дocлiджeнo aлeльний стан ключoвиx гeнiв кapoтинoгeнeзy за ДHК-мapкepaми y вocьми iнбpeдниx л1н1й ку^удзи та ïxнix пpocтиx гiбpидiв. Moлeкyляpнo-гeнeтичний пoлiмopфiзм у дocлiджeнiй дoбipцi л1н1й i гiбpидiв був виявлeний за гeнoм ß-кapoтингiдpoкcилaзи для мapкepa crtRBl-3'TE. Для цьoгo гeнa пiдтвepджeнo кoдoмiнaнтний xapaктep у^ад-кування aлeлeй бaтькiвcькиx л1н1й у пpocтиx гiбpидax. За мapкepaми гeнa лiкoпiн-e-циклaзи lcye-3'INDLта lcys-SNP21б cepeд дocлiджeниx л1н1й i п^ид!^ пoлiмopфiзмy нe виявлeнo, вивчeнi гeнoтипи мicтили лишe пo oднoмy вapiaнтy aлeлeй кoжнoгo мapкepa. Для л1н1й 'ДК253ЗCЗM', 'ДКб33/2ббзC,зM', 'ДК3ббзC,зM' та п^ид!^ 'ДК29бCxДК253ЗCЗM', 'ДК272CxДКб33/2ббзC,зM' i 'ДК231CxДК3ббзC,зM' cлiд oчiкyвaти знижeння aктивнocтi фepмeнтy ß-кapoтингiдpoкcилaзи внacлiдoк мyтaцiï гeнa crtRBl у paзi впливу тpaнcпoзoнoвoгo eлeмeнтa на 3'-к1нц1, а тaкoж ^пбування пepexoдy ß-кapoтинy в ß-кpиптoкcaнтин, ùo дае змoгy пpoгнoзyвaти нaкoпичeння ß-кapoтинy в зepнi. Bиcнoвки. Bнacлiдoк пpo-вeдeнoгo дocлiджeння aлeльнoгo cтaнy гетв кapoтинoгeнeзy в кyкypyдзи бyлo вcтaнoвлeнo вiдcyтнicть пoлiмopфiзмy за мapкepaми lcye-3'INDLта lcys-SNP21б гeнa лiкoпiн-e-циклaзи у вocьми iнбpeдниx л1н1й та ïxrnx пpocтиx гiбpидiв, пpи-чoмy за мapкepoм lcys-3'INDL у гeнoмax ycix дocлiджeниx зpaзкiв мicтитьcя cпpиятливий для нaкoпичeння ß-кapoтинy aлeль. За мapкepoм crtRBl-3'TE гeнa ß-кapoтингiдpoкcилaзи дocлiджeний ceлeкцiйний мaтepiaл виявивcя пoлiмopфним. Cпpиятливий для нaкoпичeння ß-кapoтинy aлeль гeнa crtRBl iдeнтифiкoвaнo в лiнiяx 'ДК253ЗCЗM', 'ДКб33/2ббзC,зM', 'ДК3ббзC,зM та гiбpидax 'ДК29бCxДК253ЗCЗM', 'ДК272CxДК633/266зC,зM' i 'ДК231CxДК3ббзC,зM'. Пpocтi гiбpиди кoдoмiнaнтнo ycпaдкoвyють aлeлi гeнa ß-кapoтингiдpoкcилaзи мaтepинcькoï та бaтькiвcькoï л1н1й. Ключов! слова: aлeль, мoлeкyляpнo-гeнemuчнi Mapêepu, кapomuнoгeнeз, êyêypydça, л!тя, гiбpuд.
Вступ
Kyкypyдзa - вaжливa кopмoвa, тexнiчнa тa xapчoвa кyльтypa, якa здaтнa зaбeзпeчи-ти кopмaми твapинництвo тa cиpoвинoю xi-мiчнy, бioтexнoлoгiчнy тa xapчoвy пpoмиc-лoвicть. Cepeдня вpoжaйнicть зepнa êyêypy-дзи в ciльcькoгocпoдapcькиx пiдпpиeмcтвax Укpaïни в 2014 p. cтaнoвилa 6,66 т/га, в 2015 p. - 6,11 т/га, тoдi як для ^é^aù^x гiбpидiв вич^нята! ceлeкцiï ^й пoкaзник
Yuriy Goncharov
http://orcid.org/0000-0001-8128-7098 Tatiana Satarova
http://orcid.org/0000-0002-5571-1139 Boris Dzubetsky
http://orcid.org/0000-0003-2955-232X Vladyslav Cherchel
http://orcid.org/0000-0002-0429-49б1
дocягae 7,92 тa 7,84 т/га вiдпoвiднo. Oraa^ нiми poкaми зepнo кyкypyдзи cтaлo пpoвiд-нйю cклaдoвoю eкcпopтнoгo пoтeнцiaлy Ук-païни [1, 2]. У зв'язку з цим ro^ae aктyaль-нe зaвдaння cтвopeння фopм кyкypyдзи з п^д^ищ^тою xapчoвoю цiннicтю, нoвими cпoживчими я^стями, якi зaбeзпeчaть вгг-чизняним гiбpидaм кoнкypeнтocпpoмoжнicть нa cвiтoвoмy pинкy.
Kyкypyдзa - oднa iз зepнoвиx кyльтyp, якa здaтнa нaкoпичyвaти в eндocпepмi м-ciння знaчнy кiлькicть кapoтинoïдiв [3]. Ka-poтинoïди - ^ клac pocлинниx пiгмeнтiв, чacтинa з якиx в opгaнiзмi людини тa твa-pин пepeтвopюeтьcя нa вгтамш А.
Bиxiдним пoпepeдникoм бiocинтeзy êapo-тита^дй y кyкypyдзи виcтyпae C ^голу^ - гepaнiлгepaнiлпipoфocфaт (ГГПФ). ГГПФ чepeз pяд пpoмiжниx пpoдyктiв пepeтвopю-ет^я нa пepшy зaбapвлeнy peчoвинy лiкoпiн
26
СОРТОВИВЧЕННЯ та охорона прав НЛ СОРТИ рослин, 2016, № 4 (33)
[3, 4], який на наступному еташ зазнае ре-акци цикл1зацй'. За асиметрично! цикл1за-ци лшошн п1д д1ею ферменту лшошн^-циклази, який кодуеться геном lcye, пере-творюеться на 5-каротин - попередник синтезу а-каротину, зеаксантину та лютешу. За симетрично! цикл1зацй' лшошну п1д д1ею ферменту лшошн-Р-циклази (кодуеться геном lcy[f) утворюеться у-каротин, який зда-тен поетапно переходити у Р-каротин, Р-криптоксантин та зеаксантин. Молекула Р-каротину, пор1вняно з шшими каротино!-дами, метить два Р-шльця, що забезпечуе синтез ввдразу двох молекул вгтамшу A i робить Р-каротин найефектившшим поперед-ником синтезу цього цшного вiтамiну в орга-нiзмi людини [5-9].
Для шдвищення вмiсту саме Р-каротину в зерш кукурудзи важливо, щоб утворений лшошн здебiльшого брав участь у симетрич-нiй, а не асиметричнiй циклiзацii. Таким чином, потенцiйно перспективним шляхом зб^ьшення вмiсту Р-каротину в зерш кукурудзи е iнгiбування експреси генiв, якi за-безпечують перетворення лшошну на а-ка-ротин, та активiзацiя експресй' генiв, в1дпо-ввдальних за перетворення лiкопiну на у- i Р-каротин. Разом з тим, стримування перетворення вже синтезованого Р-каротину на Р-криптоксантин також сприятиме його на-копиченню. З цього погляду визначальними для кукурудзи е дослвдження полiморфiзму гена лшошн-е-циклази (lcye) та гена Р-ка-ротинг1дроксилази 1 (crtRB1), розмщених вiдповiдно на хромосомах 8 i 10.
C. E. Harjes et al. [10] дослвдили полiмор-фiзм гена lcye та виявили три полiморфнi сайти, найб1льшою мiрою пов'язанi з варт-ванням вмгсту каротино'1дав, якi можна роз-глядати як молекулярнi маркери алельного стану цього гена: шдел на 5'-кшщ (маркер lcye-5'INDL), однонуклеотидна замша всере-динi цього гена (маркер lcys-SNP216) та ш-дел на 3'-кшщ (маркер lcye-3'INDL).
Ген crtRB1 е одним iз ключових гешв бiо-синтезу каротиноiдiв i пов'язаний з ¿х на-копиченням у ендоспермi кукурудзи [1114]. На цей час виявлено три полiморфнi д1лянки цього гена, якi впливають на варiю-вання концентрацй' каротино!дав у зернi i також розглядаються як маркери алельного стану цього гена: д^янка на 5'-кiнцi, поль морфiзм яко! зумовлений дieю транспозоно-вого елемента (маркер crtRB1 -5'ТЕ), д1лян-ка всерединi гена (маркер crtRB1 -IND14) та д1лянка на 3'-кшщ, полiморфiзм яко! також зумовлений дieю транспозонового елемента (маркер crtRB1-3'TE) [15]. Варто зазначити,
що сприятливий алель за маркером crtRB1-3'ТЕ здатен самостшно подво!ти вмiст Р-ка-ротину в зернi кукурудзи, незалежно в1д алельного стану маркера crtRB1 -5'TE та марке-рiв гена lcye [14, 16, 17].
У лiтературi немае iнформацii щодо по-ширеностi алелей генiв лшопш^-циклази та P-каротингiдроксилази серед вiтчизняних селекцшних зразкiв кукурудзи, а також особливостей !х успадкування у самозапиле-них лшш та iхнiх гiбридiв. У зв'язку з цим метою дослЬдження був аналiз алельного стану ключових гешв каротиногенезу - гена лшошн^-циклази та гена Р-каротинг1дро-ксилази за ДНК-маркерами lcys-3'INDL, lcys-SNP216 та crtRBl-3'ТЕ у лiнiй кукурудзи вггчизняно! селекцй' та iхнiх гiбридiв.
Материали та методика досл1*джень
Дослвджено 8 перспективних iнбредних лiнiй кукурудзи (Zea mays L.), створених у ДУ 1нститут зернових культур НААН (м. Днiпро), та iхнiх простих гiбридiв.
ДНК вид1ляли з п'яти-семи 7-добових про-росткiв кожного генотипу за модифшованим СТАВ-методом [18]. Алельний стан гешв, що беруть участь у детермшаци каротиногенезу, визначали за допомогою ДНК-маркерiв lcys-3'INDL, lcys-SNP216 та crtRBl -3'ТЕ - з використанням методiв полiмеразноi ланцю-гово'1 реакци (ПЛР) та гель-електрофорезу. Нуклеотиднi посл1довносп праймерiв для амплiфiкацii в1дпов1дних д1лянок ДНК-мар-керiв наведено в таблищ 1.
Оск1льки для маркера lcys-SNP216 очiку-еться поява нуль-алеля з в1дсутшстю будь-яко! смуги на електрофоретичнш дорiжцi, для пiдтвердження наявносп ДНК зразка проводили дуплексну ПЛР з додаванням у реакцiйну сумiш, крiм праймерiв до маркера lcys-SNP216, праймерiв до гена алкоголь-деидрогенази кукурудзи adhl (внутрiшнiй контроль): Adh-F3: cgtcgtttcccatctcttcctcc, Adh-R1: gacagaggagaaacaaggcg. У дуплекснш ПЛР для гена adhl очшували появу смуги розмiром 234 п.н.
Реакцшна сумiш для ПЛР одного зразка об'емом 20 мкл метила: DreamTaqTMGreen буфер, (6х) - 2 мкл; DreamTaq™ полiмеразу (ThermoScientific), (5 од./мкл) - 0,2 мкл; сум1ш дезоксирибонуклеотидiв - по 200 мкМ кожного dNTP; прямий праймер - 0,2 мкМ; зворотний праймер - 0,2 мкМ; зразок ДНК -30 нг.
ПЛР проводили згвдно з методикою T. Safawo et al. [5] за таких умов: початкова денатуращя - при температурi 94 °С протя-гом 5 хв; далi 40 циклiв, якi включали таш
issn 2518-1017 Pbñnt Varieties Studying ftnd Protection, 2016, no 4 (33)
27
íeHernuKa
Ta6fluu,n 1
XapaKTepucTMKa flHK-MapKepiB rem'B KapoTMHoreHe3y, BMKopucTaHux y floc^ifl^eHHÍ
Mo^eKy^flpHMé MapKep HyK.eoTMflHa noc.ifloBHi'cTb npaMoro (F) Ta 3BopoTHoro (R) npaéMepiB nocM.aHHA
no3HaneHHfl ^oKa.Í3a^'fl reHa (HoMep xpomocomm, HoMep 61'Ha)
Teí ,n"ÍKomH-s-^K.na3M KyKypyfl3M (icye)
/cye-3'INDL 8.05 F1: gtacgtcgttcatctccgtaccc R1: cttggtgaacgcatttctgttgg F2: ggaccggaacagccaactg R2: ggcgaaatgggtacggcc [10]
/cys-SNP216 8.05 F: gcggcagtgggcgtggat R: tgaagtacggctgcaggacaacg [10]
TeH P-KapoTMHriflpoKCM.a3M KyKypyfl3M (crtRBl)
crtRBl--3'TE 10.05 F: acaccacatggacaagttcg R1: acactctggcccatgaacac R2: acagcaatacaggggaccag [15]
cTaflii, aK fleHaTypa^a (npH 94 °C npoTaroM 1 xb), BÍflnaa npanMepÍB (npH 60 °C npoTaroM 1 xb) Ta eaoíra^a (npH 72 °C npoTaroM 1 xb). Kií^By eaoíra^ro 3flincHroBaaH npH 72 °C npoTaroM 5 xb, $a3a oxoaofl^eHHa npoxoflH-aa npn +10 °C.
BÍ3yaaÍ3yBaaH npoflyKTH aMnai^ÍKa^i nic-aa eaeKTpo^opeTH^Horo po3fliaeHHa y 2%-My arapo3HoMy reai 3a flonoMororo npHaafly GelDocTM (BioRad).
Pe3y^bTaTM floc^ifl^eHb
3a MapKepoM ícye-3'INDL reH ícys noTeH^n-ho Morne MaTH flBa aaeai, aKi Ha eaeKTpo^ope-rpaMax peecTpyroTtca aK CMyrn 144+502 n.H. (cnpnaTaHBHH aaeat) Ta 399+502 n.H. (íecnpH-aTaHBHM aaeat). 3a MapKepoM ícys-SNP216 Ta-ko® onHcaío flBa Mo^aHBÍ aaeatHÍ cTaHH: no-nepme, noaBa Ha eaeKTpo^operpaMax cMyrH po3MipoM 395 n.H., m;o BÍflnoBÍflae HaaBHocTi b ^oMy MapKepHoMy canTÍ HyKaeoTHfly 3 a3o-THcToro ocíoBoro thmíh (T, HecnpHaTaHBHH aaeat); no-flpyre, BÍflcyTHÍcTB cMyr Ha eaeK-Tpo^operpaMax, to6to Hyat-aaeat, m;o BÍflnoBÍflae HaaBHocTi b MapKepHoMy canTÍ HyKaeoTHfly 3 a3oTHcToro ochobok ryaHÍH (G, cnpHaT-aHBHH aaeat) [10].
noaiMop^i3M reía crtRBl 3a MapKepoM crtRBl-3'TE npoaBaaeTtca b noaBi Tptox aae-aen, aKi Ha eaercrpo^operpaMax ^opMyroTt cMyrH po3MipoM 543 n.H. (aaeat 1), 296+875 n.H. (aaeat 2) Ta 296 n.H. (aaeat 3). Aaeat 1 BÍflo-mhh aK cnpHaTaHBHH ^aa niflBHm;eHoro bmíc-Ty P-KapoTHHy [14, 19, 20], Tofli aK aaeai 2 Ta 3 MaroTü HecnpHaTaHBHH e$eKT [15].
Pe3yatTaTH eaeKTpo^opeTH^Horo po3nofli-ay npoflyKTÍB aMnai^ÍKa^i y aÍHÍH KyKypy-fl3H Ta íxhíx riópHflÍB Ha npHKaafli MapKepa crtRBl-3'TE HaBefleHo Ha pHcyHKy 1. Ó Taá-aнцi 2 BMim;eHo y3araatHeHÍ flaíi m;oflo aaeat-Horo cTaíy reHÍB KapoTHHoreHe3y 3a MapKepa-
mh ícye-3'INDL, ícys-SNP216 Ta crtRBl -3'TE flaa bcíx flocaifl^eHHX aiHin i riópHflÍB.
900 n.H,
500 n.H,
Pmc. 1. E^eKTpo$operpaMa npoflyKTiB aMn^i^irauií flHK ^iHi'é i riópMfliB KyKypyfl3M 3 MapKepoM crtRB1-3'TE: M - MapKep Mo^eKy^npHoí Macu 3 kpokom 100 n.H.;
1 - 'AK2533C3M'; 2 -'flK296C';
3 - 'flK296CHflK2533C3M'; 4 - 'flK272C';
5 - 'flK633/2663C,3M'; 6 - 'flK272CHflK633/2663C,3M'
yci npoaHaai3oBaíi aiHii 6yaH roMo3HroTHH-mh 3a BHKopHcTaHHMH MoaeKyaapHHMH Map-KepaMH.
3a MapKepoM ícye-3'INDL yci npoaHaaÍ3oBaHÍ aiHii Ta íxhí riápHflH MaaH aaeat 144+502 n.H., m;o, 3a aiTepaTypHHMH flaHHMH, cBÍfl^HTt npo HaaBíicTt MyTa^i, cnpHaTaHBoi flaa niflBH-^eHHa BMicTy P-KapoTHHy b 3epHÍ KyKypyfl3H ^epe3 áaoKyBaHHa nepexofly aÍKonÍHy b a-KapoTHH. 3a flaHHMH C. E. Harjes et al. [10], 3 280 aiHin KyKypyfl3H ceae^ii CIMMYT aaeat 144+502 n.H. MaaH 21,79%, a aaeat 399+502 n.H. - 78,21%.
Ó flynaeKcHin n^P flaa MapKepa ícye-SNP216 Ta reía adhl y bcíx 3pa3KiB áyao BHaBaeHo cMyry po3MÍpoM 234 n.H., m;o cbía^htb npo HaaBHÍcTt ^HK KyKypyfl3H b cyMÍmi flaa n^P. 3a MapKepoM ícye-SNP216 y bcíx npoaíaaÍ3o-BaHHX aÍHÍax Ta riápHflax ifleHTH^ÍKoBaHo aaeat T (thmíh), aKHH e HecnpHaTaHBHM flaa HaKonHieHHa P-KapoTHHy. AatTepHaTHBHHH aaeatHHH cTaH MapKepa ícye-SNP216 - G (ry-
28
Coptobhbmehhh Ta oxopoha npaB Ha copth pocahh, 2016, № 4 (33)
aHiH) y flocaifl^eHoMy ceae^iHioMy MaTepia-ai He SyB BHaBaeHHH. y flocaifl^eHHi C. E. Ha-rjes et al. [10] 3 277 aiHiH ceae^ii CIMMYT, npoaHaaisoBaHHX 3a MapKepoM ley8-SNP216, aaeaB T MaaH 38,63%, a aaeaB G - 61,37%. HaaBHicTt y npoaHaai3oBaHHX ceaeK^HHHX 3pa3Kax anme oflHoro Mo^aHBoro cTaHy reHa leys 3a MapKepaMH leys-3'INDL Ta ley8-SNP216
Morne SyTH noB'a3aHa 3 aiMiToBaHoro KiaBKic-Tro aiHiH, 3aay^eHHX flo eKcnepHMeHTy.
3a MapKepoM ertRBl-3'TE reHa P-KapoTHH-riflpoKcnaa3H b floSip^ flocaifl^eHHX aiHiH Ta riSpHfliB SyaH BHaBaeHi Bci TpH Mo^aHBi aae-ai: aaeaB 1 (cMyra y 543 n.H.), aaeaB 2 (cMyrH po3MipoM y 296 n.H. Ta 875 n.H. oflHo^acHo) Ta aaeaB 3 (cMyra y 296 n.H.). EaTBKiBcBKi aiHii riSpHfla 'AK296Cx^K2533C3M' SyaH KoHTpacTHHMH 3a aaeaBHHM cTaHoM MapKepa
ertRBl-3'TE: MaTepHHcBKa aiHia '^K296C' Hecaa aaeaB 2 (296+875 n.H.), SaTBKiBcBKa aiHia '^K2533C3M' - cnpHaTaHBHH aaeaB 1 (543 n.H.) y ^HK riSpHfla F1 цнx flBoX aiHiH Sy-aH HaaBHi oSHflBa aaeai: aaeaB 2 (296+875 n.H.) - Bifl MaTepi Ta aaeaB 1 (543 n.H.) - Bifl SaTBKa. TaKHM ^hhom, riSpHfl nepmoro noKoaiHHa '^K296Cx^K2533C3M' y reTepo3HroTi Hic cnpHaTaHBHH aaeaB reHa P-KapoTHHriflpo-KcHaa3H. HaBefleHi 3aKoHoMipHocTi po3nofliay aaeaeH niflTBepfl^yBaaHca i nifl ^ac aHaai3y ^HK n'aTH oKpeMHX pocaHH aiHii' '^K296C' Ta n'aTH oKpeMHX pocaHH riSpHfla '^K296Cx^K2533C3M'.
EaTBKiBcBKi aiHii HacTynHoro riSpHfla '^K272Cx^K633/2663C,3M' TaKo® SyaH koht-pacTHHMH 3a aaeaBHHM cTaHoM MapKepa ertRBl-3'TE. MaTepHHcBKa aiHia '^K272C' Hecaa HecnpHaTaHBHH aaeaB 3 y 296 n.H., SaTBKiBcBKa aiHia '^K633/2663C,3M' - cnpHaTaHBHH aaeaB 1 po3MipoM 543 n.H. riSpHfl '^K272Cx^K633/2663C,3M' MicTHB oSHflBa
aaeai цвoro MapKepa, 296 n.H. Ta 543 n.H., m;o e o^iKyBaHHM flaa KofloMiHaHTHoro MapKepa. AHaaori^Ha cнтyaцia 3a MapKepoM ertRBl-3'TE 3a$iKcoBaHa i flaa riSpHfla '^K231Cx^K3663C,3M' Ta Horo SaTBKiBcBKHX aiHiH. ^iHii 'AKB3262', 'PHT60' Ta iXHiH riS-pHfl '^KB3262xPHT60' 3a MapKepoM ertRBl -3'TE SyaH mohomop^hhmh i HecaH aHme HecnpHaT-aHBHH aaeaB 3 po3MipoM 296 n.H.
noaiMop^i3M 3a MapKepoM ertRBl-3'TE SyB BHaBaeHHH y pafli flocaifl^eHB. TaK, b po-SoTi [14] ^acToTa 3ycTpi^aaBHocTi cnpHaTaH-Boro aaeaa 543 n.H. cepefl 70 aiHiH KyKypy-fl3H, 3afliaHHX b ceae^iHHHX nporpaMaX b iHflii, cTaHoBHaa 5,71%. y flocaifl^eHHaX [8, 9] 3a цнм MapKepoM cepefl 385 aiHiH cnpHaTaHBHH aaeaB 1 (543 n.H.) MaaH 3,90%, a HecnpHaTaHBi aaeai 2 (296+875 n.H.) Ta 3 (296 n.H.) - 13,25% Ta 82,86% aiHiH Biflno-BiflHo. Cepefl 15 aiHiH 3i cnpHaTaHBHM aaeaeM n'aTB Haae^aaH flo ceaeK^HHoi nporpaMH CIMMYT, pemTa - flo iHfliHcBKoi ceaeK^HHoi nporpaMH.
TaKHM ^hhom, MoaeKyaapHo-reHeTH^HHH no-aiMop^i3M y flocaifl^eiiH floSipцi aiHiH i riS-pHfliB KyKypyfl3H SyB BHaBaeHHH 3a oflHHM 3 TpBoX MapKepiB - MapKepoM reHa P-KapoTHH-riflpoKcHaa3H ertRBl -3'TE. ^aa цвoro MapKepa niflTBepfl^eHo KofloMiHaHTHHH XapaKTep ycnaflKyBaHHa aaeaeH SaTBKiBcBKHX aiHiH y npocTHX riSpHflaX. 3a MapKepaMH reHa aiKoniH-8-цнкaaзн leys-3'INDL Ta leys-SNP216 cepefl flocaifl^eHHX aiHiH i riSpHfliB noaiMop$i3My He Syao BHaBaeHo, bohh MicTHaH aHme no oflHoMy BapiaHTy aaeaeH Ko^Horo MapKepa.
y aiHiH 'AK2533C3M', '^K633/2663C,3M', '^K3663C,3M' i riSpHfliB '^K296Cx^K2533C3M', 'AK272Cx0;K633/2663C,3M' i 'flK231Cx^K3663C,3M' caifl o^iKyBaTH 3HH®eHHa aKTHBHocTi ^epMeHTy
Ta6nuu,n 2
A^e^bHMM cthh reHiB KapoTMHoreHe3y 3a flHK-MapKepaMM b ^i'hi'm Ky«ypyfl3M
Ta IxHix ri6pMfliB
/lima a6o ri6pwfl A^e^bHMM CTaH reHiB
,n"iKomH-8^MK.na3a P-KapoTMHriflpoKCM^a3a
/cye-3'INDL, n.H. /cye-SNP216 crtRBl-3'TE, n.H.
'flK296C' 144+502 T 296+875
'AK2533C3M' 144+502 T 543
'flK296CxflK2533C3M' 144+502 T 296+543+875
'AK272C' 144+502 T 296
'flK633/2663C,3M' 144+502 T 543
'flK272CxflK633/2663C,3M' 144+502 T 296+543
'AK231C' 144+502 T 296
'flK3663C,3M' 144+502 T 543
'flK231CxflK3663C,3M' 144+502 T 296+543
'AKB3262' 144+502 T 296
'PHT60' 144+502 T 296
'flKB3261xPHT60' 144+502 T 296
npMMiTKa. T - a30TMCTa 0CH0Ba thmi'h.
issn 2518-1017 Piant Varieties Studying and Protection, 2016, no 4 (33)
29
Генетика
ß-KapoTHHriflpoKcnaa3H через мутащю гена crtRBl за впливу транспозонового елементу на 3'-кшщ, а також iнгiбувaння переходу ß-ка-ротину в ß-криптоксантин та накопичення ß-каротину в зеpнi.
Для г^брид^в F1 'ДК296СхДК2б3ЗСЗМ', 'ДК272СхДК633/266зС,зМ' i 'ДК231СхДК366зС,зМ' у раз1 використання фертильних форм доб1р у потомств1 в1д самозапилення на шдвищен-ня частоти алеля маркера crtRBl-3'TE, спри-ятливого для каротиногенезу, буде ефектив-ним i дасть можлив1сть у подальших циклах 1нбридингу та дoбopiв перевести ген ß-каро-тингiдpoкcилaзи на д^янщ crtRBl-3'TE в гомозиготний стан у paзi поеднання за раху-нок рекомбшаци з шшими корисними озна-ками. В той же час, дoбip на шдвищення частоти алелей генiв leys та crtRBl у потом-cтвi ибрида 'ДКВ3262ХРНТ60' вiд самозапи-лення буде неефективним.
Висновки
Проведене дocлiдження алельного стану ключових гешв каротиногенезу в кукурудзи cвiдчить про ввдсутшсть пoлiмopфiзму за маркерами lcys-3'INDL та lcys-SNP216 гена лiкoпiн-8-циклaзи у восьми шбредних лш^ ях та ¿хшх чотирьох простих гiбpидaх, при-чому за маркером lcys-3'INDL геноми досл^ джених зpaзкiв мicтять сприятливий для накопичення ß-каротину алель.
За маркером crtRBl-3'TE гена ß-каротин-идроксилази дослвджений cелекцiйний ма-теpiaл е пoлiмopфним. Сприятливий для накопичення ß-каротину алель виявлено в л^ шях 'ДК263ЗСЗМ', 'ДК633/266зС,зМ', 'ДК366зС,зМ' i гiбpидaх 'ДК296СхДК2б3ЗСЗМ', 'ДК272СхДК633/266зС,зМ' i 'ДК231СхДК366зС,зМ'. Пpocтi гiбpиди кoдoмiнaнтнo успадковують але-лi маркера crtRBl -3'TE материнсько'1 та бать-кiвcькoï лшш.
Використана литература
1. Сатарова Т. Н. Кукуруза: биотехнологические и селекционные аспекты гаплоидии : монография / Т. Н. Сатарова, В. Ю. Чер-чель, А. В. Черенков. - Днепропетровск : Новая идеология, 2013. - 552 с.
2. Рослинництво УкраУни. Статистичний зб1'рник за 2015 ртк / Державна служба статистики УкраУни. - К., 2016. - 180 с.
3. Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content / M. Aluru, Y. Xu, R. Guo [et al.] // J. Exp. Bot. - 2008.
- Vol. 59, Iss. 13. - P. 3551-3562. doi: 10.1093/jxb/ern212
4. Natural variation in the sequence of PSY' and frequency of favorable polymorphism among tropical and temperate maize germplasm / Z. Fu, Y. Chai, Y. Zhou [et al.] // Theor. Appl. Genet.
- 2013. - Vol. 126, Iss. 4. - P. 923-935. doi: 10.1007/s00122-012-2026-0
5. Exploitation of natural variability in maize for ß-carotene content using HPLC and gene specific markers / T. Safawo, N. Senthil, M. Raveendran [et al.] // Electron. J. Plant Breed. -2010. - Vol. 1, Iss. 4. - P. 548-555.
6. ZmcrtRB3 encodes a carotenoid hydroxylase that affects the accumulation of a-carotene in maize kernel / Y. Zhou, Y. Han, Z. Li [et al.] // J. Integr. Plant Biol. - 2012. - Vol. 54, No. 4. -P. 260-269. doi: 10.1111/j.1744-79 09.2012.01106.x
7. Marker-trait association analysis of functional gene markers for provitamin A level across diverse tropical yellow maize inbred lines / G. Azmach, M. Gedil, A. Menkir, C. Spillane // BMC Plant Biol. - 2013. - Vol. 13. - P. 227. doi: 10.1186/14712229-13-227
8. Development of P-carotene rich maize hybrids through marker-assisted introgression of p-carotene hydroxylase allele / V. Muthusamy, F. Hossain, N. Thirunavukkarasu [et al.] // PLoS ONE. - 2015. - Vol. 9, No. 12. - e113583. doi: 10.1371/journal. pone.0113583
9. Allelic variations for lycopene-e-cyclase and p-carotene hydroxylase genes in maize inbreds and their utilization in P-carotene enrichment programme / V. Muthusamy, F. Hossain, N. Thirunavukkarasu [et al.] // Cogent Food and Agriculture. -2015. - Vol. 1,Iss. 1.-1033141.doi:10.1080/23311932.2015.1033141
10. Natural genetic variation in lycopene epsilon cyclase tapped for maize biofortification / C. E. Harjes, T. R. Rocheford, L. Bai [et al.] // Science. - 2008. - Vol. 319. - P. 330-333. doi: 10.1126/science.1150255
11. Advances in maize genomics and their value for enhancing genetic gains from breeding / Y. Xu, D. J. Skinner, H. Wu [et al.] // Intl J Plant Genomics. - 2009. - Vol. 2009. - Article ID 957602. doi: 10.1155/2009/957602
12. Yan J. Association mapping for enhancing maize (Zea mays L.) genetic improvement / J. Yan, M. Warburton, J. Crouch // Crop Science. - 2011. - Vol. 51. - P. 433-449.
13. Introgression of the crtRBl gene into quality protein maize inbred lines using molecular markers / L. Liu, D. Jeffers, Y. Zhang [et al.] // Mol. Breeding. - 2015. - Vol. 35, Iss. 8. -P. 154. doi: 10.1007/s11032-015-0349-7
14. Screening of maize (Zea mays L.) germplasm for crtRB1-3'TE allele enhancing provitamin A concentration in endosperm / D. B. Sagare, P. Shetti, S. S. Reddy [et al.] // Res. Environ. Life Sci. - 2015. - Vol. 8, No. 4. - P. 673-674.
15. Rare genetic variation at Zea mays crtRBl increases beta-carotene in maize grain / J. Yan, C. B. Kandianis, C. E. Harjes [et al.] // Nat. Genet. - 2010. - Vol. 42, Iss. 4. - P. 322-327. doi: 10.1038/ng.551.
16. Validation of the effects of molecular marker polymorphisms in LcyEand CrtRBl on provitamin A concentrations for 26 tropical maize populations / R. Babu, N. P. Rojas, S. Gao [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 2013. - Vol. 126, Iss. 2. - P. 389-399. doi: 10.1007/s00122-012-1987-3.
17. Identification of P-carotene rich maize inbreds using PCR-based assay for crtRBl-3'TE allele / D. B. Sagare, P. Shetti, S. S. Reddy [et. al.] // I. J. S. N. - 2015. - Vol. 6, No. 3. - P. 441-443.
18. Murray M. G. Rapid isolation of high-molecular weight plant DNA / M. G. Murray, W. F. Thompson // Nuc. Acids Res. - 1980.
- Vol. 8, No. 19. - P. 4321-4325.
19. Genetic variability for kernel P-carotene and utilization of crtRB13'TE gene for biofortification in maize (Zea mays L.) / M. Vignesh, F. Hossain, T. Nepolean [et al.] // Indian J Genet Pl Br. - 2012. - Vol. 72, Iss. 2. - P. 189-194.
20. Sequence variation in 3'UTR region of crtRBl gene and its effect on P-carotene accumulation in maize kernel / M. Vignesh, T. Nepolean, F. Hossain [et al.] // J. Plant Biochem. Biotechnol.
- 2013. - Vol. 22, Iss. 4. - P. 401-408. doi: 10.1007/s13562-012-0168-4
References
1. Satarova, T. N., Cherchel, V. Yu., & Cherenkov, A. V. (2013). Kukuruza: biotehnologicheskie i selekcionnye aspekty gaploidii [Maize: biotechnological and breeding aspects of haploidy]. Dnepropetrovsk: Novaya ideologiya. [in Russian]
30
СОРТОВИВЧЕННЯ ТА OXOPOHfl ПРЯВ Hfl СОРТИ РОСЛИН, 2016, № 4 (33)
2. Roslynnytstvo Ukrainy. Statystychnyi zbirnyk za 2015 rik [Crop production of Ukraine. Statistical yearbook 2015]. (2015). Kyiv: N.p. [in Ukranian]
3. Aluru, M., Xu, Y., Guo, R., Wang, Z., Li, S., White, W., Wang, K., & Rodermel, S. (2008). Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content. J. Exp. Bot., 59(13), 35513562. doi: 10.1093/jxb/ern212
4. Fu, Z., Chai, Y., Zhou, Y., Yang, X., Warburton, M. L., Xu, S.....
Yan, J. (2012). Natural variation in the sequence of PSY" and frequency of favorable polymorphism among tropical and temperate maize germplasm. Theor. Appl. Genet., 126(4), 923935. doi: 10.1007/s00122-012-2026-0
5. Safawo, T., Senthil, N., Raveendran, M., Vellaikumar, S., Ganesan, K. N., Nallathambi, G., ... Gowri, E. V. (2010). Exploitation of natural variability in maize for P-carotene content using HPLC and gene specific markers. Electron. J. Plant Breed, 1(4), 548-555.
6. Zhou, Y., Han, Y., Li, Z., Fu, Z., Xu, S., Li, J., Yan, J., & Yang, X. (2012). ZmcrtRB3 encodes a carotenoid hydroxylase that affects the accumulation of a-carotene in maize kernel. J. Integr. Plant Biol., 54(4), 260-269. doi: 10.1111/j.1744-79 09.2012.01106.x
7. Azmach, G., Gedil, M., Menkir, A., & Spillane, C. (2013). Marker-trait association analysis of functional gene markers for provitamin A level across diverse tropical yellow maize inbred lines. BMC Plant Biol., 13, 227. doi: 10.1186/1471-2229-13-227
8. Muthusamy, V., Hossain, F., Thiruvukkarasu, N., Choudhary, M., Saha, S., Bhat, J. S., Prasanna, B. M., & Gupta, H. S. (2015). Development of P-carotene rich maize hybrids through marker-assisted introgression of P-carotene hydroxylase allele. PLoS ONE, 9(12), e113583. doi: 10.1371/journal.pone.0113583
9. Muthusamy, V., Hossain, F., Thirunavukkarasu, N., Saha, S., & Gupta, H. S. (2015). Allelic variations for lycopene-e-cyclase and P-carotene hydroxylase genes in maize inbreds and their utilization in P-carotene enrichment programme. Cogen Food and Agriculture, 1(1), 1033141. doi: 10.1080/23311932.2015.1033141
10. Harjes, C. E., Rocheford, T. R., Bai, L., Brutnell, T. P., Kandianis, C. B., Sowinski, S. G., ... Buckler, E. S. (2008). Natural genetic variation in lycopene epsilon cyclase tapped for maize biofortification. Science, 319, 330-333. doi: 10.1126/science.1150255
11. Xu, Y., Skinner, D. J., Wu, H., Palacios-Rojas, N., Araus, J. L., Yan, J., ... Crouch, J. H. (2009). Advances in maize genomics and their
value for enhancing genetic gains from breeding. Intl J Plant Genomics., 2009, Article ID 957602. doi:10.1155/2009/957602
12. Yan, J., Warburton, M., & Crouch, J. (2011). Association mapping for enhancing maize (Zea mays L.) genetic improvement. Crop Science, 51, 433-449.
13. Liu, L., Jeffers, D., Zhang, Y., Ding, M., Chen, W., Kang, M.S., & Fan, X. (2015). Introgression of the crtRBl gene into quality protein maize inbred lines using molecular markers. Mol. Breeding, 35(8). - P. 154. doi: 10.1007/s11032-015-0349-7.
14. Sagare, D. B., Shetti, P., Reddy, S. S., Surender, M., & Pradeep, T. (2015). Screening of maize (Zea mays L.) germplasm for crtRB1-3'TE allele enhancing provitamin A concentration in endosperm. Res. Environ. Life Sci., 8(4), 673-674.
15. Yan, J., Kondionis, B. C., Harjes, E. C., Boi, L., Kim, H. E., Yang, X., ... Rocheford, T. (2010). Rare genetic variation at Zea mays crtRBl increases beta-carotene in maize grain. Nature Genet., 42(4), 322-327. doi: 10.1038/ng.551
16. Babu, R., Rojas, N. P., Gao, S., Yan, J., & Pixley, K. (2013). Validation of the effects of molecular marker polymorphisms in LcyE and CrtRBl on provitamin A concentrations for 26 tropical maize populations. Theor Appl Genet., 126(2), 389-399. doi: 10.1007/s00122-012-1987-3
17. Sagare, D. B., Shetti, P., Reddy, S.S., Surender, M., & Pradeep, T. (2015). Identification of P-carotene rich maize inbreds using PCR-based assay for crtRBl^E allele. I. J. S. N., 6(3), 441-443.
18. Murray, M. G., & Thompson, W. F. (1980). Rapid isolation of high-molecular weight plant DNA. Nuc. Acid. Res.,8(19), 4321-4325.
19. Vignesh, M., Hossain, F., Nepolean, T., Saha, S., Agrawal, P. K., Guleria, S. K., Prasanna, B. M., & Gupta, H. S. (2012). Genetic variability for kernel P-carotene and utilization of crtRBl3'TE gene for biofortification in maize (Zea mays L.). Indian J Genet Pl Br, 72(2), 189-194.
20. Vignesh, M., Nepolean, T., Hossain, F., Singh A. K., & Gupta, H. S. (2013). Sequence variation in 3'UTR region of crtRBl gene and its effect on P-carotene accumulation in maize kernel. J. Plant Biochem. Biotechnol., 22(4), 401-408. doi: 10.1007/s13562-012-0168-4
УДК 577.2:633.15
Гончаров Ю. А.*, Сатарова Т. H., Дзюбецкий Б. В., Черчель В. Ю. Аллельное состояние ключевых генов каротиногенеза по ДНК-маркерам у линий кукурузы и их гибридов // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. - 2016. - № 4. - С. 26-32. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.4(33).2016.88666
ГУ Институт зерновых культур НААНУкраины, ул. В. Вернадского, 14, г. Днепр, 49027, Украина, "e-mail: [email protected]
Цель. Анализ аллельного состояния ключевых ге- 'ДК231СхДК366зС,зМ' следует ожидать снижения активнос-нов каротиногенеза - гена ликопин-е-циклазы (lcye) и ти фермента p-каротингидроксилазы в результате мута-
гена р-каротингидроксилазы (crtRB1) по ДНК-маркерам у линий кукурузы отечественной селекции и их гибридов. Методы. Выделение ДНК, полимеразная цепная реакция, гель-электрофорез. Результаты. Исследовано аллельное состояние ключевых генов каротиногенеза у восьми инбредных линий кукурузы и их простых гибридов. Молекулярно-генетический полиморфизм в исследованной выборке линий и гибридов был выявлен по гену Р-каротингидроксилазы для маркера crtRB2-3'TE. Для этого гена подтвержден кодоминантный характер наследования аллелей родительских линий в простых гибридах. По маркерам гена ликопин-е-циклазы /суе-3'Ш01-и /суе-БМР216 среди исследованных линий и гибридов полиморфизма не было выявлено, изученные генотипы имели по одному варианту аллелей каждого маркера. Для линий 'ДК2533СЗМ', 'ДК633/266зС,зМ', 'ДК366зС,зМ' и гибридов 'ДК296СхДК2533СЗМ', 'ДК272СхДК633/266зС,зМ' и
ции гена crtRBl под воздействием транспозонового элемента на 3'-конце, ингибирования перехода р-каротина в p-криптоксантин, что позволяет прогнозировать накопление p-каротина в зерне. Выводы. В результате проведенного исследования аллельного состояния генов каротиногенеза у кукурузы было установлено отсутствие полиморфизма по маркерам /cye-3'INDL и /cye-SNP216 гена ликопин-е-циклазы у восьми инбредных линий и их простых гибридов, причем по маркеру /cye-3'INDL в геномах всех изученных образцов содержится благоприятный для накопления p-каротина аллель. По маркеру crtRBl-3'TE гена p-каротингидроксилазы изученный селекционный материал оказался полиморфным. Благоприятный для накопления p-каротина аллель гена crtRBl идентифицирован у линий 'ДК2533СЭМ', 'ДК633/266зС,зМ', 'ДК366зС,зМ' и гибридов 'ДК296СхДК2533С3М', 'ДК272СхДК633/266зС,зМ' и 'ДК231СхДК366зС,зМ'. Простые гибриды кодоминантно
issn 2518-1017 Plant Varieties Studying and Protection, 2016, no 4 (33)
31
reHemuKa
HacneflyoT annenH reHa p-KapoTMHrMApoKCM.na3bi MaTepHH-CKOM H OTUOBCKOM nMHMM.
Knweebie cnoea: annenb, MoneKynnpHO-zeHemuvecKue MapKepbi, KapomuHoaeHe3, KyKypy3a, nuHun, zu6pud.
UDC 577.2:633.15
Goncharov, Yu. O.*, Satarova, T. M., Dzubetsky, B. V., & Cherchel, V. Yu. (2016). Allelic status of key genes of carotenogenesis on DNA-markers in maize lines and their hybrids. Sortovivcenna ohor. prav sorti roslin [Plant Varieties Studying and Protection], 4, 26-32. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.4(33).2016.88666
Institute of Grain Crops of NAAS of Ukraine, 14 V. Vernadskoho Str., Dnipro, 49027, Ukraine, *e-mail: [email protected]
Purpose. The analysis of allelic status of such key genes at the 3'-end, the inhibition of p-carotene transition into
of carotenogenesis as gene of lycopene-e-cyclase (lcys) and gene of p-carotene hydroxylase (crtRBl) for DNA-markers in domestic maize lines and their hybrids. Methods. DNA isolation, PCR, gel electrophoresis. Results. Allelic status of key genes of carotenogenesis was investigated in eight maize inbred lines and their single crosses. Molecular genetic polymorphism in the studied sample of maize lines and hybrids has been detected in gene of p-carotene hydroxylase for marker crtRBl-3'TE. For this gene, codominant character of inheritance of alleles of parental lines in single crosses was confirmed. For markers of gene of lycopene-e-cyclase lcye-3'INDL and lcys-SNP216, polymorphism in the group of investigated lines and hybrids has not been identified, genotypes included only one variant of alleles for each marker. For lines 'DK253ZSZM', 'DK633/266zS,zM', 'DK366zS,zM' and hybrids 'DK296SxDK253ZSZM', 'DK272SxDK633/266zS,zM' and 'DK231SxDK366zS,zM', the decrease of the activity of p-carotene hydroxylase owing to the mutation of gene crtRBl under the influence of transposone element
p-cryptoxanthin can be expected, that allows to predict p-carotene accumulation in grain. Conclusions. The study of allelic status of carotenegenesis gene of lycopene-e-cyclase in maize showed no polymorphism for markers lcys-3'INDL and lcys-SNP216 in eight inbred lines and their single crosses, along with this, for marker lcys-3'INDL in genomes of all studied samples the allele was identified to be favorable for the accumulation of p-carotene. For marker crtRBl-3'TE of gene of p-carotene hydroxylase, the studied breeding material was polymorphic. Allele of crtRBl being favorable for the accumulation of p-carotene was identified in lines 'DK253ZSZM', 'DK633/266zS,zM', 'DK366zS,zM' and hybrids 'DK296SxDK253ZSZM', 'DK272SxDK633/266zS,zM' and 'DK231SxDK366zS,zM'. Single crosses inherit maternal and paternal alleles of gene of p-carotene hydroxylase co-dominantly.
Keywords: allele, molecular genetic markers, carotenogenesis, maize, line, hybrid.
Hadiuuixa l7.l0.20l6
32
COPTOBHBMEHHH Tfl OXOPOHrt nPflB Hfl COPTH POCAHH, 2016, № 4 (33)
