CC BY
81
УДК 616.314.17 - 008.1 - 003.93:612.014 Брашшн А.П.
АКТИВАЦ1Я МЕХАН1ЗМ1В РЕГЕНЕРАЦП ТКАНИН ПАРОДОНТУ З ВИКОРИСТАННЯМ КЛ1ТИННИХ ТЕХНОЛОГ1Й
Донецький нацiональний медичний уыверситет
У статтi наведен результати вивчення властивостей плину запального процесу пародонту та оцнка ефективностi регуляторного впливу мезенх!'мальних стовбурових клтин (МСК) у регенераци щелепноУ к'ютки. Дослiдження проведен на 195 щурах-самцях породи Wistar, масою 270±58 грам i вком 11-12 мсяцв 3i спонтанним пародонтитом, яким у к'юткову рану вкладався остеотропний матер'ал у ком&нацИ з МСК та Ух культуральною рiдиною. Для з'ясування механ1'зм1в участi мСк при запальному процес вивчали морфологiчнi показники загоення та запалення експериментальноУ рани. Регуляторний вплив вивчали за динамкою рiвня IL-1& IL-4, IL-8, IL-6, IL-10 та TNFa. Встановлено, що застосування культури МСК веде до прискорення репаративного процесу та зниження запальноУ реакцИ в ранi, завдяки участi культури у паракриннй регуляцУ регенерацУ щелепноУ кстки.
Ключов1 слова: кюткова тканина, пародонт, мехажзми регенерацп кюток, цитоши, мезенх1мальн1 стовбуров1 кл1тини. Робота е фрагментом плановоУ НДР ДУ «1нститут невiдкладноУ i вiдновноУ х'фург'УУ» iм. В. К. Гусака НАМН УкраУни за темою: «Розробка клтинно-тканинних технологiй для лкування потерплих ie переломами юсток юнц/'вок» (№ ГР 0107U000282).
Одыею з актуальних проблем сучасноТ стоматологи е захворювання пародонту та травма кюток щелепно-лицьовоТ дтянщ як ускладнюються розвитком запально-деструктивного процесу (ЗДП). У структурi стоматолопчних захворювань вони складають вщ 39,2 % до 46 %, що висувае проблему Тхнього лкування в ряд основних [2, 3, 6, 11].
Основними патогенетичними факторами ЗДП кютковоТ тканини е бактерп i Тх токсини, що не ттьки руйнують тканини, порушують тканинний метаболiзм, а й частково або цтком блокують мiсцевi регуляторы фактори i, як наслщок, призводять до уповтьнення процеав регенерацп [1, 2, 5, 10].
На сьогодн вщомо про розвиток нових медичних технологш, що впливають на процеси регенерацп, заснованих на застосуванн живих клггинних i тканинних культур, та використанн Тх композицп з остеопластичним матерiалом (ОП-матерiалом) у якост носiя, у рiзних галузях медицини [4, 7, 13, 14]. Висока ефективнють цих методiв, з використанням мезенхiмальних стовбурових кл^ин (МСК), пов'язана iз спорiдненням Тх з процесами регенерацп [9, 14, 15].
Однак, мехаызми впливу МСК на процеси регенерацп ушкодженоТ кютковоТ тканини та ефективност Тх використання в лкуванш хворих iз ЗДП кюток належним чином не вивчеш.
Мета дослщження
Вивчення властивостей плину запального процесу пародонту та оцшка ефективност регуляторного впливу мезенхiмальних стовбурових кл^ин у регенерацiТ щелепноТ кютки.
Матерiали i методи дослiджень
Дослщження проведенi на 195 щурах-самцях породи Wistar, масою 270±58 грам i вiком 11-12 мiсяцiв зi спонтанним пародонтитом. Наявнють пародонтиту у щурiв дала можливiсть моделювання остеорегенерацiю при хрошчному запального процесi в кютковш тканинi.
Регенераторний процес моделювали шляхом нанесення фрезевого отвору на дтянц паростку нижньоТ щелепи пiд штрапертонеальним наркозом. У кiсткову рану в област рани вкладався остеотропний матерiал (вiдповiдно групi дослiдження), пiсля чого рана пошарово вшивалася. Пiсля виведення тварин з експерименту, по 10 з кожноТ групи (у груш контролю — по 5) на 10-у, 20-у i 30-у добу, виготовляли препарат з дтянки нижньоТ щелепи для подальшого гютолопчного дослщження. Протокол експерименту схвалений Комiсiею з питань бюетики ДУ 1НВХ iм. В.К.Гусака НАМНУ (протокол № 1/2 вщ 15.02.2010 р.).
Тварин розподтяли по групах: група контролю - тварини, яким загоення проводили без пщсадки матерiалу; I група — тварини, яким в рану вносили остеопластичний матерiал; II група - тварини, яким вносили ОП-матерiал, шдукований кондицшованим культуральним середовищем (ККС) клiтинноТ культури МСК; III група — тварини, яким вносили ОП-композит з культурою МСК. За винятком групи контролю, у залежност вщ ОП-матерiалу, групи розподтили на пщгрупи «А» — Колапан-Л (групи порiвняння IA, IIA й IIIA) i пiдгрупи «В» - Hypro-sorb F (групи порiвняння IB, 11В i 111 В).
В робот використовували некомтовану лiнiю МСК кiсткового мозку одного дорослого щура породи Wistar в якост кл^инного субстрату, який культивували на носп в процесi масштабного культивування в CO2-iнкубаторi у стандартних умовах, а також кондицшоване культуральне середовище (ККС) в якост шдукуючоТ речовини, одержаний при культивуваннi цих кл^ин за тих самих умов.
Для з'ясування мехаызмлв участ МСК при запальному процес вивчали властивостi загоення модельованоТ рани у експериментальних тварин з використанням рiзних методик - показники гыйного запалення, очищення рани, ступеы регенерацiТ м'якоТ i кютковоТ тканини по питомому об'ему (пит./об.) мiкрогематоциркуляторного русла (МГЦР), кiсткових осколках у просвт кiстковоТ рани, сполучнотканинноТ i кiстковоТ грануляцiйноТ тканини (СТ^ГТ), кiсткових балок (КБ) i кютково-мозкових порожнин (КМп), полiморфно-ядерних лейкоци^в (ПМЯЛ), лiмфоцитiв, макрофагiв, плазмоцитiв. Також вивчалась динамка рiвня ^-1р, ^-4, !Ь8, lL-6, ^-10 та Т^а сироватки кровi щурiв, що проводили в контрольы строки фотометричним методом.
Достовiрнiсть мiжгрупових вiдмiнностей оцiнювали за загальноприйнятими методикам з використання ^критер^ Стьюдента i U-критерiю iнверсiТ Уткоксона -Манна-Уiтнi.
Результати та Тх обговорен ня
Аналiз особливостей кiстковоТ регенерацiТ групи контролю, групи 1А (Колапан-Л); 1В (Hypro-sorb F), !!!А (Колапан-Л з МСК), 111В (Нурго^огЬ F з МСК) (рис. 1) показав наступи закономiрностi: на 10 добу у 111А групi спостерiгалося зменшення шфтьтрацп круглоядерними клiтинами в 1,7 рази (р<0,05) i ПМЯЛ в 2,1 рази (р<0,05)), i прискорення утворення кютковоТ тканини на краю дефекту (пит./об. КБ був бтьше в 3,2 рази (р<0,05), а КМп - у 1,9 раза (р<0,05)).
Рис. 1. Порiвняльний аналiз морфометричних noKa3HUKie регенерацп груп з застосуванням клimuHHux технологiй на 30
добу.
На 20 добу в 1А й 111А групах збер^алися таю ж тенденцп, як i на 10 добу: у rpyni IIIA спостер^алося зменшення шфтьтрацп круглоядерними кттинами в 2,0 рази (p<0,05) i ПМЯЛ в 2,8 рази (p<0,05)) i прискорення утворення кютковоТ тканини по краю дефекту (пит./об. КБ був бтьше в 1,6 рази (p<0,05), а КМп - у 1,9 рази (p<0,05)).
У групi 111А на 30-у добу спостер^алася менш виразна запальна реак^я (iнфiльтрацiя круглоядерними клiтинами була в 3,3 раза (p<0,05) менше, полiморфноядерними - у 1,3 раза (p>0,05) менше). Пит./об. КБ у грут IIIA була бтьше в 1,3 рази (p<0,05), а КМп - у 2,0 рази (p<0,05)).
У тварин 111В групи на 10 добу спостер^али зменшення шфтьтрацп круглоядерними кттинами в 2,1 рази (p<0,05)), зниження пит./об. кюткових уламюв у 1,6 рази (p<0,05) i прискорення утворення кiстковоТ тканини по краю дефекту (пит./об. КБ була бтьше в 2,2 раза (p<0,05), а КМп - у 2,3 рази (p<0,05)). На 20 добу при порiвняннi мiж групами IB i 111В пит./об. КБ у грут 111В була бтьше в 2,0 рази (p<0,05), а КМп - у 1,9 рази (p<0,05)). Також були виражеы розходження в ступеы шфтьтрацп круглоядерними лейкоцитами - даний показник був менше в IIIB грут в 2,9 рази (p<0,05).
У групах IB i IIIB на 30-у добу спостер^али змши, як i в IA й IIIA. У грут IIIB спостер^алася менш виражена запальна реак^я (в 1,8 рази (p<0,05)). Пит./об. КБ у грут IIIB був бтьше - в 1,1 рази (p>0,05), а КМп - у 1,2 рази (p>0,05)).
Таким чином, порiвняння даних в IA й IIIA пщгрупах виявило достовiрнi розходження в збтьшены питомого об'ему МГЦР, КБ i КМп, ПМЯЛ i лiмфоцитiв, макрофагiв i плазмоцитiв на 10-у i 20-у добу, показниюв МГЦР, СТiКГТ, КБ i КМп, лiмфоцитiв, макрофагiв i плазмоцитiв - на 30-у добу. Розходження в ктькост кюткових осколкiв у раы, СТiКГТ на 10-у i 20-у добу, а також кюткових осколюв i ПМЯЛ на 30-у добу мiж IA i IIIA пщгрупами виявилося статистично недостовiрне.
Порiвняння морфометричних даних груп контролю, IIA (Колапан-Л iз ККС) i IIB (Hypro-sorb F iз ККС) показують, що пит./об. МГЦР у групп IIA склав 2,64±0,04, що в 3,08 рази достовiрно (р<0.05) нижча, ыж у контролi. У IIB грут вш склав усього 0,12±0,01, що в 42,2 рази нижча контролю (розходження достовiрнi - р<0.05). Розходження показника МГЦР мiж IIA й IIB групами були достовiрнi (р<0.05) i були вище в IIA грут в 13,6 раза, ыж в IIB грут. Ктькють ПМЯЛ був найменшим в IIB грут в 92,6 рази й у 7,5 раза, а ктькють макрофапв - у 11,7 i 6,53 рази нижче, ыж у групах контролю й IIA грут (p<0,05).
Пит./об. СТКГТ в IIB грут був нижче(р<0.05), ыж в IIA грут i грут контролю (у 2,08 i 2,32 раза).
Розходження СТ^ГТ млж 11А i групою контролю недостовiрнi (р>0.05). Кiлькiсть КБ найбтьша в 11В грут (р<0,05), i перевищуе такий показник в 11А i грут контролю в 1,54 i 1,97 рази вщповщно, розходження достовiрнi (р<0.05). При цьому ктьюсть КБ у препаратах 11А групи була вище в 1,28 рази (р<0,05), чим у грут контролю.
Вивчення ЦК-профтю кровi щурiв пiсля введення клiтинного субстрату (культури МСК) та при застосування продуцен^в МСК (супернатанту) показав нерiвномiрний розподт рiвня ЦК у групах дослщження (рис. 2).
Рис. 2. Динамка р1вня ЦК по групах спостереження
Так, найвищi показники були в грут контролю на 10-у добу. При цьому динамка Тхых змш була недостовiрною (р>0,05). Аналогiчна ситуацiя спостерiгалася в Гр.1А i Гр.1В на 10-у добу. Рiвень в на 20-у добу в цих групах знизився в 1,3 рази i далi практично не змшився (розходження не достовiрнi, р>0,05). Самi низки показники рiвня IL-1 в на 10-у добу були в Гр.11А i Гр.11В - в 1,5 рази нижча в порiвняннi з контролем (р<0,05). Однак, динамiка даного ЦК у наступи строки виявилася недостовiрною (р>0,05). Найбiльша динамiка рiвня ^-1 в у кровi спостерiгалася в Гр.ША i Гр.ШВ, IL-1 в на 10 добу був в 1,2 рази нижча (р<0,05), ыж у контроле та знижувалася у 20-у i 30-у добу в 1,3 рази (р<0,05).
Показники ^-8 на 10-у добу виявлен в Гр.11А i Гр.11В групах, де вони знижувалися до 20-у доби в 1,6 разiв, вщмшнють вiрогiдна (р<0,05), розходження мiж 20-ю i 30-ю добою були не достовiрнi (р>0,05). Найбiльшим IL-8 спостерiгався на 10-у добу в Гр.111А i Гр.ШВ i перевищував такi в iнших групах в 1,8 раза, i знижувалися на 20-у i 30-у добу в 1,2 рази (р<0,05).
В групах контролю, Гр.1А, Гр.1В, Гр.11А i Гр.11В спостерiгалося зростання рiвня IL-4 до 20 доби в 1,2 рази (група контролю - в 1,4 раза), вс розходження достовiрнi (р<0,05). На 30 добу змши в цих групах були не достовiрнi (р>0,05). Зворотна залежысть спостерiгалася в Гр.111А i Гр.111В, де на 10-у добу рiвень ^-4 перевищував такий в шших групах в 1, 2 рази (р<0,05), i знижувався на 20 i 30 добу в 1,2 рази (р<0,05).
Рiвень IL-6 знижувався у всiх групах. При цьому в грут контролю, Гр.1А i Гр.1В на 20 добу було виявлене зниження в 1,2 раза, (р<0,05). У Гр.11А i Гр. 11В на 20-у добу ^-6 знижувався в 1,6 разiв, що (р<0,05). У Гр.111А i Гр.ШВ показники знижувалися в 1,5 рази на 20-у добу i в 1,7 разiв - на 30-у, (р<0,05).
Найбiльший рiвень IL-10 вiдзначався на 10-у добу в грут контролю, Гр.1А i Гр.1В, i мав тенденцiю до росту наступи строки ( р>0,05). При цьому рiвень IL-10 у Гр.11А, Гр. 11В, Гр.111А й Гр. 111В на 10-у добу були в 1,6 рази нижча контролю (р<0,05). Змши в наступний термш були не достовiрнi (р>0,05).
Зниження рiвня TNF-a у кровi вiдзначено у вах групах дослiдження. Однак, у грут контролю, Гр.1А, Гр.1В, Гр.11А i Гр.11В ц змiни були виражен на 30-у добу - знижувалися в 1,3 раза, (р<0,05). У Гр.111А i Гр. 11|В цi змiни були найбiльш вираженi на 10-у добу i знижувалися в 1,6 разiв (р<0,05). Найвищi середнi показники отриман в групi контролю, Гр.1А, Гр.1В, Гр.11А i Гр.11В, розходження не вiрогiднi, низькi середнi показники вщзначалися в Гр.111А i Гр.||1В.
Отже, основним патофiзiологiчним механiзмом впливу МСК на регенера^ю кiстковоТ тканини щелепи е участь культури клiтин, внесених на носи, у ланцюгу взаемноТ паракршноТ регуляцiТ системи остеобласт-остеокласт, як потрапляють у стан дисрегуляцiТ в умовах запально-деструктивного процесу, шляхом видтення стовбуровими клiтинами регуляторних факторiв.
Висновки
Таким чином встановлено, що застосування культури МСК на ноаях веде до прискорення
репаративного процесу в 2,1 - 2,6 рази та зниження запальноТ реакци в ран в 6,7 - 14,3 раза. 1ндук^я ОП-матерiалiв регуляторними факторами культуральноТ рiдини МСК продемонструвала Тх високу ефективнiсть регенерацп кютковоТ рани (зниження запальноТ реакцiТ в 12,3 раза, прискореному вщновленш кютковоТ тканини в 1,3- 2,1 раза).
На пiдставi регуляторного впливу мюцевих патогенетичних факторiв обфунтовано спосiб регенерацп кютковоТ тканини щелепи при запально-деструктивному процес за рахунок використання аутолопчних мезенхiмальних стовбурових клiтин.
Лiтература
1. Баринов Э. Ф. Патогенетические механизмы развития хронического пародонтита / Э. Ф. Баринов, О. Н. Сулаева // Арх. клинич. и эксперим. медицины. - 2006. - Т. 15, №. - С. 84-92.
2. Белоклицкая Г. Ф. Этиотропное лечение при генерализованных заболеваниях тканей пародонта (фаза I) / Г. Ф. Белоклицкая // 3-й Пан-Европейский стоматологический конгресс (9-11 дек. 2009 г.). - К., 2009. - С. 12-13.
3. Болезни пародонта. Патогенез, диагностика, лечение / А. С. Григорьян, А. И. Грудянов, Н. А. Рабухина, О. А. Фролова. - М. : МИА, 2004. - 320 с.
4. Вивчення властивостей матерiалiв, як застосовуються в iмплантолопТ / В. С. Астахова, В. О. Маланчук, Л. М. Панченко, О. Л. Цтенко // Стоматолопчна iмплантологiя. Остеоштегра^я : матерiали другого укр. мiжнар. конгр. - К., 2006. - С. 28-30.
5. Грудянов А. И. Состав парадонтогенной микрофлоры при парадонтите разной степени тяжести по данным полимеразной цепной реакции / А. И. Грудянов, В. В. Овчинникова // Стоматология. - 2008. - Т. 78, № 3. - С. 21.
6. Грудянов А. И. Хирургические методы лечения заболеваний пародонта / А. И. Грудянов, А. И. Ерохин. - М. : ООО "Медицинское информационное агентство", 2006. - 128 с.
7. Использование мезенхимальных стволовых клеток для активизации репаративных процессов костной ткани челюсти в эксперименте / А. И. Воложин, А. Ю. Васильев, Н. Н. Мальгинов [и др.] // Стоматология. - 2010. - № 1. - С. 10-14.
8. Композиционные биоматрицы с желатиновым матриксом и мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани / В. Г. Богдан, М. М. Зафранская, Ю. М. Гаин , Ю.Е. Демидчик // Клеточ. трансплантация. - 2010. - Т. V, № 3. - С. 16.
9. Кухарчук А. Л. Стволовые клетки: эксперимент, теория, клиника. Эмбриональные, мезенхимальные, нейральные и гемопоэтические стволовые клетки / А. Л. Кухарчук, В. В. Радченко, В. М. Сирман. - Черновцы : Золот литаври, 2004. - 505 с.
10. Мазур I. П. Локальш фактори регуляцп' ремоделювання кютковоТ тканини / I. П. Мазур // 1мплантологпя. Парадонтолопя. Остеолопя. -2009. - № 2. - С. 20-27.
11. Мазур И. П. Костная система и заболевания пародонта / И. П. Мазур, В. В. Поворознюк // Соврем. стоматология. - 2002. - № 2. - С. 2732.
12. Маланчук В. О. Остеогенна активнють кюткового мозку рiзних донорських дтянок скелета людини / В. О. Маланчук, В. С. Астахова, О. Л. Цтенко // 1мплантолопя, парадонтолопя, остеолопя. - 2005. - № 1. - С. 9-11.
13. Применение костнопластического материала как носителя аутологичных стволовых клеток кролика для замещения костного дефекта челюсти / В. И. Куцевляк, В. Ф. Куцевляк, Ю. Е. Микулинский, Е.А. Щегельская // Стоматолопчна iмплантологiя. Остеоштегра^я : матерiали другого укр. мiжнар. конгр. - К., 2006. - С. 72-84.
14. Bone regeneration in the presence of a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute material / A. Kruse, R. E. Jung, F Nicholls [et al.] // Clinical Oral Implants Res. - 2011. - Vol. 22, № 5. - P. 506-511.
15. Normal bone marrow signal-transduction profiles: a requisite for enhanced detection of signaling dysregulations in AML / J. Marvin, S. Swaminathan, G. Kraker [et al.] // Blood. - 2011. - Vol. 117, № 15. - P. 120-130.
Реферат
АКТИВАЦИЯ МЕХАНИЗМОВ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНЕЙ ПАРОДОНТА С ПРИМЕНЕНИЕМ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ Брашкин А.П.
Ключевые слова: костная ткань, пародонт, механизмы регенерации кости, цитокины, мезенхимальные стволовые клетки.
В статье приведены результаты изучения свойств течения воспалительного процесса пародонта и оценка эффективности регуляторного влияния мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в регенерации челюстной кости. Исследования проведены на 195 крысах - самцах породы Wistar массой 270 ± 58 грамм и возрасте 11-12 месяцев со спонтанным пародонтитом , которым в костную рану вкладывался остеотропный материал в комбинации с МСК и их культуральной жидкостью. Для выяснения механизмов участия МСК при воспалительном процессе изучали морфологические показатели заживления и воспаления экспериментальной раны. Регуляторное влияние изучали по динамике уровня IL- 1р , IL -4 , IL -8 , IL- 6 , IL- 10 и TNFa. Установлено, что применение культуры МСК ведет к ускорению репаративного процесса и снижению воспалительной реакции в ране благодаря участию культуры в паракринной регуляции регенерации челюстной кости.
Summary
ACTIVATION OF MECHANISMS OF PERIODONTAL TISSUE REGENERATION BY APPLYING CELL TECHNOLOGIES Brashkin A.P.
Keywords: bone tissue, periodontium, bone regeneration mechanisms, cytokines, mesenchymal stem cells.
This research paper presents the results obtained by studying the peculiarities of the course of periodontal inflammation and the estimate of efficiency produced by regulatory impact of mesenchymal stem cells (MSC) on the regeneration of the jawbone. The investigations were carried out on 195 male Wistar rats weighing 270 ± 58g and aged 11-12 months with spontaneous periodontitis. Osteotrophic material in combination with MSCs and their culture supernatant fluid were applied onto the bone lesions of the rats. To clear up the mechanisms of MSCs role in inflammatory process we studied morphological parameters of healing and inflammation in modelled wounds. Regulatory effects were studied by the dynamics in changing of - 1p , IL -4 , IL -8 , IL- 6 , IL- 10 and TNFa. It was found out the applying MSC cultures led to the more rapid reparative process and reduced the inflammation in the wound due to the role of the culture in paracrine regulation of jawbone regeneration.
