CC BY
21
УДК 631.4
АКТИНОМИЦЕТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ПОЧВ ПРИЭЛЬТОНЬЯ
Г.М. Зенова, М.С. Дуброва, Т.А. Грачева, А.И. Кузнецова,
О.А. Степанова, И.Ю. Чернов, А.С. Манучаров
Представлена эколого-таксономическая характеристика актиномицетного комплекса солончаков и светло-каштановых почв Приэльтонья. Данные об обилии и таксономической структуре подтверждают экологическую значимость актиномицетов в почвах с выраженными признаками засоления.
Ключевые слова: мицелиальные актинобактерии, актиномицеты, соровые солончаки.
Введение
Приэльтонье входит в подзону светло--каштановых почв, для которой типично сочетание современных процессов осолонцевания, карбонати-зации и гумусообразования. Пестрота и засоленность почвообразующих пород, их неравномерное увлажнение предопределили на этой территории быструю и резкую изменчивость условий почвообразования и большую вариабельность сочетаний почвенных разновидностей [2]. Формирование почвенного покрова здесь тесно связано с историей развития озер, в частности оз. Эльтон, которое по всему периметру концентрически охвачено двумя поясами солончаков: внутренним — соровые и внешним — луговые [2]. Почвы формируются в условиях выпотного режима, когда грунтовые воды перемещают восходящим потоком соли из нижележащих горизонтов или породы на поверхность («эффект фитиля»), в результате чего на пляже озер часто образуется белоснежная солевая корка.
На низких террасах Эльтона и впадающих в него рек преобладают пылевато-иловатые солонцы и солончаки тяжелого механического состава. Почвы формируются в гидроморфных или полу-гидроморфных (лугово-каштановые) условиях при залегании грунтовых вод на глубине 5—6 м. По мере удаления от озера среди солонцов появляются пятна светло-каштановых почв, занимающих от 10 до 50% площади. Здесь преобладают солончаковатые солонцы (60—80% от площади) в сочетании со светло-каштановыми, часто солончаковатыми почвами. Это звено почвенно-ландшафтной катены занимает промежуточное положение между нижними (гидроморфные) и верхними (автоморфные) элементами рельефа и имеет явно выраженный па-леогидроморфный характер [2].
Среди работ, посвященных бактериальным сообществам засоленных почв, недостаточно сведений о структуре и таксономической принадлежности мицелиальных актинобактерий (актиномицетов). Цель нашей работы — получить эколого-таксоно-мическую характеристику актиномицетного комп-
лекса почв Приэльтонья — мало исследованного с микробиологической точки зрения региона.
Объекты и методы исследования
Обследовали приэльтонскую часть Хвалын-ской глинистой равнины, находящуюся в пределах Прикаспийской низменности и занимающую основное пространство левобережья Волги. Образцы 1 и 2 соровых солончаков хлоридного и суль-фатно-хлоридного засоления (от 0,9 до 1% легкорастворимых солей) отбирали в озерной лугово-солончаковатой и сорово-солончаковатой пойме с сочносолянковой галофитно-злаковой пустынной растительностью (дельта р. Хары, впающей в оз. Эльтон). Образцы 3, 4, 5 светло-каштановой почвы с хлоридным или хлоридно-сульфатным засолением (0,4% легкорастворимых солей) брали на некотором удалении от озера. В морфологическом профиле этих почв (А—АВ1—АВ2—Всасо3) на глубине 60—80 см хорошо выражен карбонатный горизонт. Содержание гумуса здесь в пределах 0,54—0,76, реже 1,88%, слабощелочная реакция среды, облегченный гранулометрический состав. Среди обменных катионов преобладает кальций.
Дифференцированный учет и выделение ак-тиномицетов проводили традиционным методом посева из разведений почвенных суспензий на ага-ризованные питательные среды [3]: Гаузе-1 [1], с пропионатом натрия [5], гумусово-витаминный агар [4]. Для ограничения роста одноклеточных бактерий добавляли налидиксовую кислоту (3 мкг/мл среды), микромицетов — нистатин (50 мкг/мл среды).
Предварительную идентификацию актиноми-цетов проводили при первичном микроскопиро-вании колоний на чашках с питательной средой с последующим выделением в чистую культуру на среде овсяный агар [5] представителей определенных доминирующих морфотипов. При этом учитывали морфологические признаки: наличие/ отсутствие фрагментации мицелия, образование спор на субстратном и/или воздушном мицелии,
число спор в цепочках, наличие одиночных спор, спорангиев [1,9]. Штаммы психротолерантных ак-тиномицетов определяли по фенотипическим (куль-туральные, морфологические, хемотаксономиче-ские, физиологические) [1, 10] и молекулярно-ге-нетическим (сиквенс 16S rRNA) признакам [6, 7]. Их филогенетическое положение устанавливали на основании секвенирования гена 16S rRNA. ДНК из бактериальной биомассы выделяли, используя набор реактивов Wizard Genomic DNA Purification Kit, согласно рекомендациям производителя «Pro-mega» (США), с незначительными модификациями [7]. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фраг-ментов гена 16S rRNA применяли универсальную праймерную систему [7, 10]. Полноразмерную копию гена получали на приборе Mastercycler personal (Eppendorf 11F, Германия) с помощью прай-меров: 11F 5,-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' 1492R5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', где М = С или A, Y = С или Т.
Амплификационная смесь (объем 50 мкл) имела следующий состав: 1 х буфер ДНК полимера-зы BioTaq (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8,2 мМ MgCl2); 12,5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; 5 пмоль соответствующих праймеров (11F и 1492R), 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq («Диалат ЛТД», Россия).
Температурно-временной профиль ПЦР следующий. Первый цикл: 94° — 9 мин, 55° — 1 мин, 72° — 2 мин; последующие 30 циклов: 94° — 1 мин, 55° — 1 мин, 72° — 2 мин; завершающий цикл: 72° — 7 мин.
Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S rRNA изучаемого штамма проведен с помощью программы BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Последовательности редактировали с помощью BioEdit (http://jwbrown. mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), а их множественное выравнивание — с использованием программы CLUSTAL W 1.75. Дендрограммы строили, применяя алгоритм «neighbor-joining» (NJ) в программе MEGA 4. Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали методом «Bootstrap» путем построения 1000 альтернативных деревьев. Нуклеотидные последовательности гена 16S rRNA выделенных штаммов депонированы в Gen Bank NCBI с присвоением культурам индивидуальных номеров доступа.
Наблюдения за развитием мицелия актиноми-цетов в образцах светло-каштановой почвы проводили в микрокосмах, инкубируемых при температурах 5° и 20°. Микробную сукцессию в микрокосме инициировали увлажнением почвы до 60% от полной влагоемкости (ПВ). Для подсчета длины ак-тиномицетного мицелия использовали люминесцентный микроскоп Axioskop 2+. В микрокосмах
подсчитывали длину мицелия и рассчитывали биомассу актиномицетов на 0, 3, 7, 17 и 31-е сутки после инициации сукцессии. Для окрашивания мицелия использовали водный раствор акридина оранжевого (разведение 1 х 10 000; 2—4 мин). Длину мицелия в 1 г почвы вычисляли по формуле: N = S\an/vS2c, где N — длина мицелия, м/г почвы; а — средняя его длина в поле зрения (усреднение проводили по всем препаратам); Sj — площадь препарата, мкм2; n — показатель разведения почвенной суспензии, мл; v — объем капли, наносимой на стекло, мл; S2 — площадь поля зрения микроскопа, мкм2; с — навеска почвы, г [8]. Биомассу актиномицетного мицелия рассчитывали по формуле: В = 3,9N• 10-5 , где N — длина мицелия, м/г почвы.
Результаты и их обсуждение
Численность актиномицетов в соровых солончаках, расположенных по внешнему периметру оз. Эльтон, относительно невелика. В обоих образцах (содержание растворимых солей — 0,9 и 1% соответственно), отобранных в нескольких десятках метров от уреза воды, количество выделенных актиномицетов определяется тысячами КОЕ/г почвы. По мере удаления от озера почвы сменяются светло-каштановыми с небольшим засолением (содержание растворимых солей — 0,4%), и этот показатель увеличивается на порядок, составляя десятки тысяч КОЕ/г почвы (рис. 1). Доля акти-номицетов от всего бактериального комплекса про-кариотного сообщества в этой почве составляет от 3 до 35% в разных образцах.
Актиномицетный комплекс, выделенный из солончака на среде Гаузе-1, представлен р. Strepto-myces. Наиболее распространены стрептомицеты с белым или серым воздушным мицелием, виды которых относятся к секциям и сериям Albus Albo-coloratus (доминируют), Albus Albus, Cinereus Qhro-mogenes (рис. 2, обр. 1 и 2) [1].
Сравнивая численность актиномицетов в образцах соровых солончаков из разных регионов, можно отметить несколько большее их количество в почвах Приэльтонья по сравнению с корко-
ig N
5 — 4 —
3 -2 -1 -о L
1 2 3 4 5
Рис. 1. Численность (lg N, N — КОЕ/г почвы) немицелиаль-ных бактерий и мицелиальных актинобактерий (актиноми-цеты): 1, 2 — соровый солончак, 3, 4, 5 — светло-каштановая засоленная почва (здесь и на рис. 2)
С)
4
□ а дб Щв г
Рис. 2. Доля видов стрептомицетов, принадлежащих к секциям и сериям в актиномицетных комплексах почв: а — А1-bus Albocoloratus, б — Albus Albus, в — Gnereus Chromogenes, г — Roseus Lavendulae-roseus
во-пухлым солончаком дельты Амударьи, корковым (соровым) — Прикаспийской низменности (северо-восточное побережье Каспийского моря (п-ов Бузачи) на территории России) и сопоставимое количество в засоленных бурой полупустынной и серо-бурой почвах Монголии [5].
В светло-каштановой почве (рис. 2, обр. 3,4,5) по сравнению с солончаком не только увеличивается на порядок численность стрептомицетов, но и расширяются родовой и видовой спектры выделенных культур. В актиномицетном комплексе светло-каштановой почвы (среда Гаузе-1) обнаружены представители родов Streptomyces и Micromonospora примерно в равных долях; среди представителей р. Streptomyces виды секций и серий Albus Albus, Cinereus Chromogenes, Roseus Lavendu-lae-roseus. Из обр. 4 выделены доминирующие здесь виды Streptomyces luridis штамм 4Э5 и S. lavendu-lae штамм 4Э9.
Для наблюдения за динамикой длины актино-мицетного мицелия и биомассой актиномицетов в светло-каштановой почве в ходе сукцессии, инициированной увлажнением почвы до 60% ПВ, нами был выбран образец, отобранный из ризосферной
О 3 7 17 31 Время, сут.
Рис. 3. Динамика длины мицелия и биомассы актиномице-тов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением светло-каштановой засоленной почвы
зоны под полынью на берегу Хары (обр. 3). Лю-минесцентно-микроскопические исследования показали, что длина мицелия увеличилась с 55 в начале опыта до 322 м/г на 7-е сут сукцессии); далее отмечено небольшое ее снижение и стабилизация мицелия на уровне 211 м/г почвы. Биомасса акти-номицетов в ходе микробной сукцессии возросла с 2,1 до 12,6 мкг/г почвы к 7-м сут опыта и далее стабилизировалась на уровне 8,2 мкг/г почвы (рис. 3). Таким образом, длина актиномицетного мицелия и, соответственно, биомасса в светло-каштановой засоленной почве Приэльтонья увеличивалась в ходе микробной сукцессии почти в шесть раз к седьмым суткам опыта.
В аналогичном опыте с инициированной увлажнением бурой пустынно-степной засоленной почвой Монголии в ходе микробной сукцессии в микрокосме длина актиномицетного мицелия и, соответственно, биомасса актиномицетов только удвоилась. Видимо, близость оз. Эльтон способствует поддержанию приемлемого для микробного роста уровня влажности в засоленной светло-каштановой почве с более выраженным развитием здесь актиномицетного мицелия по сравнению с пустынно-степной сухой почвой Монголии [5].
Полученные результаты подтверждают экологическую значимость актиномицетов в рассматриваемых природных местообитаниях с выраженными признаками засоления почв.
2 3
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А. и др. Определитель актиномицетов. М., 1983.
2. Засоленные почвы России / Под ред. Л.Л. Ши-шова, Е.И. Панковой. М., 2006.
3. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Экология актиномицетов. М., 2001.
4. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Актиномицеты засоленных и щелочных почв. М., 2007.
5. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Манучарова Н.А. Экстремофильные и экстремотолерантные актиномицеты в наземных экосистемах. М., 2011.
6. Манучарова Н.А. Идентификация метаболити-чески активных клеток прокариот в почвах с применением молекулярно-биологического флюоресцентно-микроскопического метода анализа Fluorescence in sity hybridization (FISH). М., 2008.
7. Манучарова Н.А. Молекулярно-биологические аспекты исследований в экологии и микробиологии. М., 2010.
8. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М., 1991.
9. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Ed. S.T. Williams, M. Sharpe, J.A. Holt. Ninth Edition. Balto-more, 1989. Vol.4.
10. Ravenschlag K, Sahm K, Amann R. Quantitative molecular analysis of the microbial community in marine arctic Sediments (Svalbard) // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol.67, N 1. P. 387—395.
Поступила в редакцию 26.10.2015
ECOLOGICAL AND TAXONOMIC FEATURES OF ACTINOMYCETE COMPLEXES OF PRIELTONYA SOILS
G.M. Zenova, M.S. Dubrova, T.A. Gracheva, A.I. Kuznetsova, O.A. Stepanova, I.Yu. Chernov, A.S. Manucharov
Data on the abundance and taxonomic structure confirmed the ecological importance of actinomycetes in soils in the area of Lake Elton with pronounced signs of chloride and sulfate-chloride salinity.
Key words: mycelial actinobacteria, salt-affected soils.
Сведения об авторах
Зенова Галина Михайловна, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. Е-mail: [email protected]. Дуброва Мария Сергеевна, канд. биол. наук, техник лаб. эксперимент. живот. биологического ф-та МГУ им. М.В.Ломоносова. Е-mail: [email protected]. Грачева Татьяна Александровна, канд. биол. наук, науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: [email protected]. Кузнецова Анна Игоревна, канд. биол. наук, науч. сотр. Ин-та микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. E-mail: [email protected]. Степанова Ольга Александровна, аспирант каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: [email protected]. Чернов Иван Юрьевич, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. Мануча-ров Александр Сергеевич, канд. биол. наук, доцент каф. физики и мелиорации почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. E-mail: [email protected].
