CC BY
40
УДК 616.24-006.6-036.4-091.8:615.28
О.П. Колестк1, А.1. Шевченко1,
1
ЗВ'ЯЗОК Р1ВНЯ АПОПТОЗУ В ПЕРВИНН1И ПУХЛИН1 ХВОРИХ НА РАНН1Х СТАД1ЯХ НЕДР1БНОКЛ1ТИННОГО РАКУ ЛЕГЕН1В З ЕФЕКТИВН1СТЮ АД'ЮВАНТНО!
В. О. Туманський2,
М.А. ШишкЫ2, А. В. Евсеев2
ПОЛ1ХШЮТЕРАПП
Запор1зький державний медичний утверситет
кафедра онкологИ1
(зав. - проф., А.1. Шевченко)
кафедра патологiчноl анатоми2
(зав. - проф., В. О. Туманський)
вул. Культурна, 177А, Запорiжжя, 69040, Украгна
Zaporozhye regional clinical oncology center
chair of oncology ZSMU
Kulturnaya str. 17A, Zaporozhye, 69040, Ukraine e-mail: [email protected]
Ключовi слова: апоптоз, ад'ювантна хiмiотерапiя, недрiбноклiтиний рак легетв, виживання Key words: apoptosis, adjuvant chemotherapy, non-small cell lung cancer, survival
Реферат. Связь уровня апоптоза в первичной опухоли больных на ранних стадиях немелкоклеточного рака легких с эффективностью адъювантной полихимиотерапии. Колесник А.П., Шевченко А.И., Туманский В.А., Шишкин М.А., Евсеев А.В. Лечение больных с ранними стадиями немелкоклеточного рака лёгкого (НМКРЛ) остается важным вопросом современной онкологии. Одним из методов лечения, позволяющих улучшить прогноз после операции, является адъювантная полихимиотерапия (АПХТ). В современной литературе нет единого мнения относительно того, кому необходимо назначать АПХТ. Однако в последнее время авторы все чаще указывают на необходимость использования молекулярных маркеров для индивидуализации назначения АПХТ. Целью нашего исследования было изучение связи уровня апоптоза в первичной опухоли больных с ранними стадиями НМКРЛ с эффективностью АПХТ. В исследование, которое было проведено в Запорожском областном клиническом онкологическом диспансере с июня 2008 по декабрь 2012 года, включено 254 больных с I-II стадиями НМКРЛ. Экспрессию протеина р53 выражали как процент позитивно окрашенных ядер опухолевых клеток в общей популяции. Высокой считали экспрессию при наличии >25% позитивно окрашенных клеток. Результаты: Определение уровня апоптоза в опухоли лёгкого на основании экспрессии маркера р53 выполнено у 220 пациентов. Не выявлено прогностического значения уровня экспрессии р53 у больных с ранними стадиями НМКРЛ (р=0,65). Отмечена значимая связь между возрастом (р=0,039), полом (р=0,009) и уровнем апоптоза в первичной опухоли у больных с ранними стадиями НМКРЛ. В группе больных с низкой экспрессией р53 в опухоли отмечена худшая выживаемость при проведении АПХТ (р=0,009). А у больных с высоким уровнем экспрессии р53 проведение АПХТ значимо улучшило выживаемость (p<0,001). Таким образом, проведение АПХТ у больных с I-II стадиями НМКРЛ необходимо при высоком уровне апоптоза (>25%).
Abstract. Link of apoptosis level in the primary tumor at early stages of non-small cell lung cancer with efficacy of adjuvant polychemotherapy. Kolesnik O.P., Shevchenko A.I., Tumansky V.O., Shyshkin M.A., Yevseyev A.V.
One of the important questions in modern oncology is treatment of patients with early stages of non-small cell lung cancer (NSCLC). Adjuvant polychemotherapy (APCT) can help to improve prognosis after operation. In modern literature there is no unified opinion as for patients in need of adjuvant chemotherapy. However, now investigators indicate to necessity to use molecular markers for individualization of APCT. The aim of our study was to assess correlation between apoptos level in primary tumor in patients with early stages of NSCLC with effectiveness of APCT. Study was conducted by the chair of oncology of Zaporozhye state medical university since June 2008 to Dec 2012. 254 patients with I-II stages of non-small cell lung cancer were included in the study. Expression of p53 was evaluated as percent of positively stained nucleus tumor cells in general population. More than 25% of positively stained nucleus tumor cells meant high p53 expression. Results: We performed assessment of apoptosis level with the help of p53 expression in 220 patients. No prognostic significance ofp53 level expression in patients with early stages of non-small cell lung cancer (р=0,65) was revealed. There was significant correlation between age (р=0,039), sex (р=0,009) and apoptosis level in primary tumor in patients with early stages of NSCLC. Worse survival was noted in group of patients with low p53 expressions after adjuvant chemotherapy (р=0,009). But in patients with high level of p53 expression adjuvant chemotherapy significantly increased survival (p<0,001). So, adjuvant chemotherapy in patients with I-II stages of NSCLC is necessary to be carried out in cases of high p53 expression level.
13/ Том XVIII/ 4
61
Лшування хворих з раншми стадiями недрiб-ноклiтинного раку легешв (НДКРЛ) залишаеться важливим питанням сучасно! онкологи. Це зу-мовлено тим, що навiть пiсля радикально виконаного хiрургiчного втручання у 50% хворих настае прогресування захворювання, що стае причиною загибелi пацiентiв. Одним i3 методiв лiкування, що дозволяють покращити прогноз пiсля операци, е ад'ювантна полiхiмiотерапiя (АПХТ). У сучаснш лiтературi не iснуе едино! думки вщносно того, кому необхiдно призначати АПХТ. Однак останнiм часом автори все часпше вказують на необхщнють використання мо-лекулярних маркерiв для iндивiдуалiзащl при-значення АПХТ [4, 5, 7, 8, 10].
Метою нашого дослщження було вивчення зв'язку рiвня апоптозу в первиннiй пухлиш хворих з раннiми стащями НДКРЛ з ефективнiстю АПХТ.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ
Дослiдження, до якого було включено 254 хворих з I-II стадею НДКРЛ, було проведене на кафедрi онкологи Запорiзького державного ме-дичного унiверситету з червня 2008 по грудень 2012 року. Середнш вiк пацiентiв становив 60,7 року (95% В1, 59,7-61,7). Усiм хворим проведено хiрургiчне лiкування в об'емi лобектоми або пневмонектоми з наступним патоморфолопчним дослiдженням видаленого препарату. Для iмуно-гiстохiмiчного дослiдження препарати фiксували в забуференому 10% формалм та заливали в парафiн. На прецизшному ротацiйному мшро-томi НМ 3600 ^рми «MICROM Laborgeräte GmbH», Шмеччина) виготовляли серiйнi зрiзи товщиною 3 ц, якi розмiщували на адгезивш предметнi скельця «Super Frost Plus» ^рми «Menzel Glaser», Шмеччина). Пiсля депара-фмзацп та репдратаци зрiзiв проводили висо-котемпературне демаскування антигенiв шляхом нагрiвання на водянш банi в Трис-ЭДТА буферi (рН=9,0) та iнгiбуванням ендогенно! пероксидази шляхом шкубаци протягом 10 хвилин у 3% розчиш перекису водню. Пюля 30-хвилинно1' ш-кубацп з первинними антитшами проводилась 1'х вiзуалiзацiя за допомогою системи детекци EnVision+ FLEX з хромогеном DAB+ ^рми «DAKO», США). Пiсля проявлення результатiв iмуногiстохiмiчноl реакци зрiзи дофарбовували гематоксилiном Майера та заключали в бальзам. Етапи обробки матерiалу, а також протоколи iмуногiстохiмiчного дослщження детально ви-кладеш у вiдповiдних монографiях [3, 6], осо-бливостi проведення iмуногiстохiмiчного забар-влення для виявлення тих чи шших антигенiв
деталiзованi в шструкщях фiрми-виробника вщ-повiдних антитiл.
Iмуногiстохiмiчне дослiдження проводили в парафiнових зрiзах легенi з використанням мо-ноклональних антитш: Mo a-Hu р53 Protein, Clone DO-7 проти бiлка p53, та системи в> зуалiзацil EnVision+ FLEX («DAKO», США) вiдповiдно до рекомендацш цих фiрм щодо 1'х використання.
Результати iмуногiстохiмiчноl реакци ощню-вали напiвкiлькiсним методом за допомогою мш-роскопа Axioplan 2 (фiрми «Carl Zeiss», №меч-чина). Експресiю проте!ну р53 виражали як вiдсоток позитивно забарвлених ядер пухлинних клiтин у загальнш популяци. Високою вважали експресда при наявностi >25% позитивно забарвлених кттин.
АПХТ проведена 80 хворим з I - II стадями НМКРЛ, котрим проводилось дослщження екс-преси р53. У 140 пащеипв додаткове лiкування не проводилось. АПХТ включала 2-3 курси пла-тиновмютно! хiмiотерапil (цисплатин 80мг/м2 1 день, етопозид 120 мг/м2 з 1-l по 3-ю добу, штер-вал мiж курсами 21 день). Хiмiотерапевтичне лiкування починали не шзшше 21 дня пiсля оперативного лшування.
Нами простежено виживання усiх включених до дослщження хворих. Для цього використо-вували телефоннi дзвiнки та прямi контакти з хворими, зв'язок з районними онкологами, а також даш Запорiзького обласного канцер-репст-
ру.
Статистичну обробку матерiалу виконували в лiцензованiй верси програми Statistica 6,0. Для оцiнки зв'язку мiж рiзними клшко-морфоло-гiчними факторами використовували критерiй Х2 та тест Ирсона. Оцiнку виживання проводили за допомогою функци Kaplan-Meier. Рiзницю виживання окремих груп дослiджували за допомогою критерда log-rank. Рiвень значущостi визначали як р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
Визначення рiвня апоптозу в пухлинах легеш, засновуючись на експреси маркеру р53, вико-нано у 220 хворих. При цьому вщсутшсть за-барвлення вiдзначена у 54 хворих (24,5%), ще в 40 пащенпв у препаратах виявлено забарвлення до 25% клггин (18,2%). Таким чином, у 94 хворих з раншми стадями НДКРЛ (42,7%) вщ-значена низька експрешя р53 - низький рiвень апоптозу. На рисунку 1 представлений мшро-препарат пащента з низьким рiвнем апоптозу, на рисунку 2 - з високим рiвнем.
Рис. 1. Низький |лвеш> експреси р53
Як видно з представлено! таблищ, вiдмi- у жiнок виявлялась висока експрешя р53
чаеться значна вщмшшсть рiвня експреси р53 у (р=0,009). Не вiдзначено зв'язку мiж локатза-
хворих з рiзним вiком (р=0,039). У хворих се- цiею, пстолопчною формою, морфологiчним ди-
реднього вшу вiдмiчаеться значна перевага ви- ференщюванням пухлини, критерiями Т, К, ста-
сокого iндексу. Також констатована наявшсть дiею захворювання та рiвнем апоптозу. Також у
зв'язку мiж рiвнем апоптозу в пухлинi та статтю хворих з АПХТ та без додаткового лшування не
хворого. У пащенпв чоловiчоl статi частiше шж вiдзначено рiзницi за рiвнем експреси р53.
Рис. 2. Високий |лвеш> експреси p53
13/ Том XVIII/ 4
63
Порiвняльна характеристика пащент1в залежно в1д р1вня експресн р53
Характеристика Експрес1я р53
р
низька експрес1я n=94 висока експрес1я n=126
BiK
<59 34 67 0,039
60-74 58 56
75-89 2 3
Стать
Чолов1ки 70 111 0,009
Жшки 24 15
Гiстологiчний тип пухлини
Неплоскоклiтинний рак 42 50 0,46
Плоскоклiтинний рак 53 76
Морфологiчне диференцгавання пухлини
G1 24 28 0,59
G2 45 66
G3-4 25 31
рт
T1 14 15 0,81
T2 78 108
T3 2 3
pN
N0 70 92 0,81
N1 24 34
Стадая
I стадiя 68 89 0,78
II стадая 26 37
Локалзащя пухлини
Периферичний рак 64 72 0,98
Центральний рак 30 54
АПХТ
З АПХТ 38 42 0,28
Без АПХТ 56 84
Основним Kprn^pieM ефективностi проведе-ного лшування в онкологiчних хворих е виживання. У середньому, перюд спостереження за хворими в нашому дослщжеш становив 25,9 mî-сяця (95% В1, 23,9-27,9). Для оцiнки виживання хворих використовували метод Kaplan-Meier.
Так, при порiвняннi виживання хворих з високою та низькою експресiею р53 не вiдмiчено ста-тистично значущо! рiзницi (р=0,65). Однак iснуе тенденщя до покращення виживання хворих з низьким рiвнем апоптозу (рис. 3).
к
I I
та m s H s m
к 0,7
1,0
0,9
0,8
Œ О с о о. с го
X
m s
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
К £
I 0,1 0,0
Функщя виживання (Kaplan-Meier)
о Виконано Цензуровано
Чз-Г
10
20
30
40
М^ящ
-висока експресiя р53
— низька експресiя р53
50
60
70
80
Рис. 3. Виживання хворих залежно в1д р1вня експресн р53
Для дослiдження ефективност АПХТ залежно вiд рiвня апоптозу в пухлинi нами проведено порiвняння виживання хворих з експре-сiею р53>25% (висока експреая) i < 25% (низька експреая) (рис. 4, 5).
У груш хворих з низькою експресiею р53 у пухлинi, котрим проведено АПХТ, 75-й процен-тиль виживання становив 16 мюящв, медiана ви-
живання 24,8 мюяця. У хворих без додаткового лшування 75-й процентиль та медiана виживання не досягненi. Рiзниця у виживаннi двох груп хворих статистично вiрогiдна (достовiрна) (р=0,009). Таким чином, проведення пiсляоперацiйноï х> мiотерапiï у хворих з I-II стадiями НДКРЛ з низь-ким рiвнем експресiï р53 е недоцшьним.
Рис. 4. Виживання хворих з I-II стад1ями НДКРЛ з низьким р1внем апоптозу залежно в1д проведення АПХТ
0
13/ Том XVIII/ 4
65
На рисунку 3 представлене виживання хво-рих з високим рiвнем експреси р53 без АПХТ та з додатковим хiмiотерапевтичним лшуванням. Так, у хворих, якi не отримували АПХТ, 75-й процентиль виживання становив 17 мюящв, ме-дiана - 30,8 мiсяця. У хворих тсля АПХТ 75-й
процентиль виживання та медiана не досягненi. Рiзниця виживання двох груп статистично вiро-гiдна (р<0,001). Таким чином, проведення АПХТ у хворих з 1-11 стадшми НДКРЛ з високим рiвнем експреси р53 значно покращуе виживання.
Функщя виживання (Кар!ап-Ме1вг)
о Виконано Цензуровано
40 Мгсящ без АПХТ з АПХТ
Рис. 5. Виживання хворих з 1-11 сталями НДКРЛ з високим рiвнем апоптозу залежно ввд проведення АПХТ
Проведення АПХТ у хворих з раншми ста-дiями НДКРЛ е дискутабельним питанням су-часно! онкологи [1, 4, 8]. Деяю автори вважають, що для отримання 6шьшо! вигоди вщ АПХТ необхiдно вiдокремити групу хворих, у якш цей вид лшування буде максимально ефективним. Для шдивщуатзаци призначення АПХТ мож-ливо використання молекулярних маркерiв. У дослiдженiй лiтературi вiдмiчаються поодинокi працi, що стосуються визначення предиктивно! ролi рiзних молекулярних та генетичних мар-керiв у хворих з рiзними стадiями НДКРЛ, однак вказуеться на необхщнють продовження проведення дослiджень у цьому напрямку [5, 7, 10].
Нами проведено дослщження ефективностi АПХТ залежно вщ рiвня експреси р53 у пер-виннiй пухлинi - маркера апоптозу. Незважаючи на численнi дослщження, прогностична роль експреси р53 залишаеться суперечливою [12]. У де-кiлькох роботах показано, що експрешя р53 виявляеться у 39,4%-60,5% хворих на рак легешв [9, 11, 12, 13, 14]. У нашому дослщженш висока
експресiя р53 визначена у 57,3% хворих з раншми стащями НДКРЛ. Як i в шших дослщ-женнях, нами не виявлено зв'язку мiж експре-аею р53 та гiстологiчною формою, морфолопч-ним диференцiюванням, критерiями Т та К, ста-дiею захворювання [9, 12, 13].
У той же час, за даними нашого дослщження вщзначаеться, що експресiя р53 корелювала з ефективнiстю АПХТ. Хворi з високою експре-сiею р53 у пухлиш мали значний ефект вщ про-веденого лiкування. Подiбнi даш отриманi Т8ао зi спiвавторами та Суховершою зi спiваторами у хворих з III стадiею НДКРЛ [2, 11].
П1ДСУМОК
Таким чином, проведення АПХТ у хворих з раншми стадiями НДКРЛ е доцшьним при висо-кому рiвнi апоптозу пухлини. Необхщне подальше дослiдження прогностично! та предиктивно! ролi р53, що дозволить покращити лiкування у хворих з раншми стащями НДКРЛ.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Левченко Е.В. Адъювантная терапия рака лёгкого / Е.В.Левченко // Практическая онкология. -2007. - Т8, №3. - С 135-139.
2. Суховерша О.А. Патоморфолопчш фактори прогнозу як основа оптимiзащl лiкування 111А стади недрiбноклiтинного раку легень / О.А.Суховерша // Морфолопя. - 2007. - Т. 1, № 4. - С. 100-107.
3. Эллиниди В.Н. Практическая иммуногистоци-тохимия / В.Н. Эллиниди, Н.В. Аникеева, Н.А. Максимова - СПб. : ВЦЭРМ МЧС России, 2002. - 36 с.
4. A randomized trial of postoperative adjuvant therapy in patients with completely resected stage II or Ilia non-small-cell lung cancer / S.M. Keller, S. Adak, H. Wagner [et al.] // N. Engl. J. Med. - 2000. - Vol. 343.
- P. 1217-22.
5. Biologic risk model for recurrence in resected early-stage non-small cell lungcancer (ES NSCLC). / K.A. Gold, J.J. Lee, Y. Ping [et al.] // J. Clin. Oncol. -2011. - Vol. 29, N 15. - P. 7053.
6. Boenisch T. Immunohistochemical staining methods : handbook / T. Boenisch, A.J. Farmilo, R.H. Stead -3rd ed. - Carpinteria: Dako Cytomation Corporation, 2001. - 68 p.
7. Cell Cycle Regulators and Outcome of Adjuvant Cisplatin-Based Chemotherapy in Completely Resected Non-Small-Cell Lung Cancer: The International Adjuvant Lung Cancer Trial Biologic Program / M. Filipits, R. Pirker, A. Dunant [et al.] // J. Clin. Oncol. - 2007. - N 25.
- Р. 2735-2740.
8. Chemotherapy for patients with non-small cell lung cancer: the surgical setting of the Big Lung Trial / D. Waller, M.D. Peake, R.J. Stephens [et al.] // Eur. J. Cardiothorac Surg. - 2004. - Vol. 26. - P. 173-182.
9. Expression of the p53 Family in Lung Cancer / H. Uramoto, K. Sugio, T. Oyama [et al.] // Anticancer Research. - 2006. - Vol. 26. - P. 1785-1790.
10. Individualized adjuvant chemotherapy for surgically resected lung cancer and the roles of biomarkers / N. Ikeda, S. Nagase, T. Ohiro [et al.] // Ann. Thorac Cardio-vasc. Surg. - 2009. - Vol. 15, N 3. - P. 144-149.
11. Prognostic and Predictive Importance of p53 and RAS for Adjuvant Chemotherapy in Non-Small-Cell Lung Cancer / M.S. Tsao, S. Aviel-Ronen, K. Ding [et al.] // J. Clin. Oncol. - 2007. - Vol. 25. - P. 5240-5247.
12. Prognostic Evaluation of the Expression of p53 and bcl-2 Oncoproteins in Patients with Surgically Resected Non-small Cell Lung Cancer / R.Sh. Lai, J.S. Wang, H.K. Hsu [et al.] // Japan J. Clin. Oncol. -2002. - Vol. 32, N 10. - P. 393-397.
13. Prognostic factors in patients with resected pathologic (p-) T1-2N1M0 non-small cell lung cancer (NSCLC) / F. Tanaka, K. Yanagihara, Y. Otake [et al.] // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2001. - Vol. 19. -P. 555-561.
14. Prognostic Significance of p53 and Ki-67 Antigen Expression in Surgically Treated Non-Small Cell Lung Cancer / C. Maddau, M. Confortini, S. Bisanzi [et al.] // Am. J. Clin. Pathol. - 2006. - Vol. 125. - P. 425-431.
REFERENCES
1. Levchenko EV. Ad'yuvantnaya terapiya raka leg-kogo. Prakticheskaya onkologiya. 2007;8(3):135-9.
2. Sukhoversha OA. Patomorfologichni faktori pro-gnozu yak osnova optimizatsii' likuvannya IIIA stadii' ne-dribnoklitinnogo raku legen'. Morfologiya. 2007;1(4):100-7.
3. Ellinidi VN, Anikeeva NV, Maksimova NA. Pra-kticheskaya immunogistotsitokhimiya. SPb.: VTsERM MChS Rossii, 2002;36.
4. Keller SM, Adak S, Wagner H. A randomized trial of postoperative adjuvant therapy in patients with completely resected stage II or IIIa non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2000;343:1217-22.
5. Gold KA, Lee JJ, Ping Y. Biologic risk model for recurrence in resected early-stage non-small cell lung-cancer (ES NSCLC). Journal of Clinical Oncology. 2011;29(15):7053.
6. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Immunohistochemical staining methods: handbook 3rd ed. Carpinteria: Dako Cytomation Corporation, 2001;68.
7. Filipits M, Pirker R, Dunant A. Cell Cycle Regulators and Outcome of Adjuvant Cisplatin-Based Chemotherapy in Completely Resected Non-Small-Cell Lung Cancer: The International Adjuvant Lung Cancer Trial Biologic Program J. Clin. Oncol. 2007;25:2735-40.
8. Waller D, Peake MD, Stephens RJ. et al. Chemotherapy for patients with non-small cell lung cancer: the
surgical setting of the Big Lung Trial. Eur J Cardiothorac Surg. 2004;26:173-82.
9. Uramoto H, Sugio K, Oyama T. et al. Expression of the p53 Family in Lung Cancer. Anticancer research. 2006;26:1785-90.
10. Ikeda N, Nagase S, Ohiro T. Individualized adjuvant chemotherapy for surgically resected lung cancer and the roles of biomarkers. Ann thorac cardiovasc surg. 2009;15(3):144-9.
11. Tsao MS, Aviel-Ronen S, Ding K. et al. Prognostic and Predictive Importance of p53 and RAS for Adjuvant Chemotherapy in Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol. 2007;25:5240-7.
12. Lai RSh, Wang JS, Hsu HK et al. Prognostic Evaluation of the Expression of p53 and bcl-2 On-coproteins in Patients with Surgically Resected Non-small Cell Lung Cancer. Jpn J Clin Oncol. 2002;32(10):393-7.
13. Tanaka F, Yanagihara K, Otake Y. et al. Prognostic factors in patients with resected pathologic (p-) T1-2N1M0 non-small cell lung cancer (NSCLC). European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 2001;19:555-61.
14. Maddau C, Confortini M, Bisanzi S. et al. Prognostic Significance of p53 and Ki-67 Antigen Expression in Surgically Treated Non-Small Cell Lung Cancer. Am J Clin Pathol. 2006;125:425-31.
♦
13/ Том XVIII/ 4
67
