CC BY
53
УДК. 616.71-018.46-08:57.032:611.018.4:[546.41+546.185]612.085.1
ЗНАЧЕНИЕ ФАЗОВОГО СОСТАВА КАЛЬЦИЙФОСФАТНЫХ ПОКРЫТИЙ ДЛЯ ОСТЕОГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СТРОМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК IN VIVO
Владимир Петрович ПОПОВ1, Марина Юрьевна ХЛУСОВА2, Константин Васильевич ЗАЙЦЕВ3, Марина Владимировна ДВОРНИЧЕНКО2, Елена Викторовна ЛЕГОСТАЕВА2, Игорь Альбертович ХЛУСОВ25, Юрий Петрович ШАРКЕЕВ2, Сергей Васильевич ГНЕДЕНКОВ4
1ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России 634050, г. Томск, Московский тракт, 2
2НОЦ «Биосовместимые материалы и биоинженерия» при Томском политехническом университете, Сибирском государственном медицинском университете и Институте физики прочности и материаловедения СО РАН 634050, г. Томск, Московский тракт, 2
3ФГБУН Томский НИИ курортологии и физиотерапии ФМБА России 634050, г. Томск, ул. Розы Люксембург, 1
4ФГБУН Институт химии ДВО РАН
690022, г. Владивосток, пр. 100-летия Владивостока, 159
5ООО "Биоконструктор-С" 634021, г. Томск, ул. Сибирская, 31
Цель: изучить влияния фазового состава искусственных кальцийфосфатных поверхностей на остеогенную дифференцировку стромальных стволовых клеток in vivo на имплантатах с фиксированным диапазоном шероховатости. Материал и методы. Состояние поверхности оценивалось с помощью измерительной системы Talysurf 5-120, фазовый состав - дифрактометром Shimadzu XRD-7000, элементный состав - на электронном микроскопе Hitachi S5500. 35 мышам-самцам линии CBA/CaLac подкожно вводили по 1 имплантату из титана марки ВТ1.0 (диаметр 12 мм, толщина 1 мм) с шероховатым кальцийфосфатным покрытием, нанесенным микродуговым оксидированием, со столбиком костного мозга. Гистологическое исследование проводили через 45 дней. Компьютерной морфометрией определяли количественные параметры выросших тканевых пластинок. Результаты. На пластинах с искусственными поверхностями отмечен рост грубоволокнистой костной ткани с полостями, заполненными красным костным мозгом. Воспроизводимость ее на 22 % выше на покрытиях, в состав которых входят трикальцийфосфат и/или гидроксилапатит, по сравнению с аморфными фосфатами кальция.
Ключевые слова: имплантаты, шероховатость, мыши, костный мозг, стволовые клетки.
Попов В.П. - к.м.н., ассистент кафедры травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии, e-mail: [email protected]
Хлусова М.Ю. - к.м.н., доцент кафедры патофизиологии, e-mail: [email protected] Зайцев К.В. - к.м.н., зав. лабораторией изучения механизмов действия физических факторов, e-mail: [email protected]
Дворниченко М.В. - к.м.н., докторант кафедры патофизиологии, e-mail: [email protected] Легостаева Е.В. - к.ф.-м.н., старший научный сотрудник НОЦ "БМБ" и лаборатории физики нанострук-турных биосовместимых композитов, e-mail: [email protected]
Хлусов И.А. - д.м.н., проф., проф. кафедры морфологии и общей патологии, научный руководитель НОЦ "БМБ", e-mail: [email protected]
Шаркеев Ю.П. - д.ф.-м.н., проф., зав. лабораторией физики наноструктурных биосовместимых композитов, член Совета НОЦ "БМБ", e-mail: [email protected] Гнеденков С.В. - д.х.н., зам. директора, e-mail: [email protected]
В настоящее время in vitro достигнуты значительные успехи в индустрии дифференци-ровки и созревания стромальных стволовых клеток (ССК) в различных направлениях. Тем не менее добиться реализации необходимого потенциала стромальных прекурсоров in vivo гораздо труднее. Направить потенциал ССК по остеогенному пути и создать специфическое микроокружение во многих случаях позволяет scaffold-технология, носителем которой для костной ткани являются кальцийфосфатные (КФ) материалы [4].
Различные образцы КФ материалов, в зависимости от физико-химических свойств (степень кристалличности и пористости, растворимость, шероховатость поверхности и т. д.), обладают разной способностью поддерживать костеобра-зование. Имплантаты с КФ покрытием активно используются при экспериментальном и клиническом остеосинтезе [3]. Однако до сих пор не удалось найти ключевое сочетание структуры, толщины и скорости растворения покрытия для реализации остеогенного потенциала ССК.
Предполагают, что для проявления остеоин-дуктивных свойств КФ поверхности необходимо, чтобы она имитировала структуру костной ткани, т. е. имела поры, диаметр которых должен быть сравним с диаметром остеонов. При меньшем или большем размере пор рост кости практически отменяется [6].
Другим свойством искусственных поверхностей, влияющим на адгезию, миграцию и ос-теогенную дифференцировку стромальных клеток, является шероховатость. Получены доказательства того, что КФ поверхность, даже без наличия макропор, способствует прилипанию ССК и поверхностному остеогенезу. На покрытиях, выполненных из оксида титана, кость из столбика костного мозга не образуется [7].
Не менее важным в этом процессе является содержание в КФ материалах таких компонентов, как гидроксилапатит (Ca5(PO4)3OH, ГАП) и трикальцийфосфат (Ca3(PO4)2, ТКФ) в соотношении 7:3. Если оно меняется, то процесс образования кости тормозится [5].
Целью проведенной работы явилось изучение влияния фазового состава искусственных кальцийфосфатных поверхностей, полученных по одной технологии, на остеогенную диффе-ренцировку стромальных стволовых клеток in vivo на имплантатах с фиксированным диапазоном шероховатости.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве модельных имплантатов применяли пластины из титана марки ВТ1.0 (диаметр
12 мм, толщина 1 мм), несущие двусторонние шероховатые КФ покрытия. Покрытия (показатель шероховатости Ra в области 2-3 мкм) наносили на металлическую подложку с помощью модификаций способа анодно-искрового (микродугового) оксидирования и состава электролита [2, 9].
Состояние поверхности оценивали по значениям параметров вертикальных неровностей профиля с помощью измерительной системы Talysurf 5-120 (разрешающая способность 10 нм). Определяли Ra (мкм) - показатель шероховатости в пределах нескольких длин участков измерений согласно ГОСТ 2789-73.
Оценку адгезии кальцийфосфатного покрытия к подложке проводили «методом отрыва» на испытательной машине Instron-1185. Толщина покрытий была измерена с помощью микрометра МК-25.
Для определения фазового состава покрытий применялся рентгенофазовый анализ, выполненный с помощью дифрактометра Shimad-zu XRD-7000 (Япония). Интерпретация дифрак-тограмм проводилась на основе базы данных International Center for Diffraction Data (ICDD). Элементный состав покрытий определяли методом энергодисперсионной спектроскопии на электронном микроскопе Hitachi S5500 (Япония).
В биологической части экспериментов использовали 35 мышей-самцов линии CBA/ CaLac из коллекционного фонда НИИ фармакологии СО РАМН (Томск). Имплантаты вводили 21 животному, 14 мышей служили источником столбика сингенного костного мозга, выделяемого из бедренной кости. Исследования выполняли с согласия локального этического комитета Сибирского государственного медицинского университета (заключение № 1923 от 28.03.2011), согласно нормам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации, приказу Минздрава СССР № 577 от 12.08.77 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Животным под эфирным наркозом подкожно вводили по одному имплантату с нанесенным в асептических условиях столбиком костного мозга (средняя площадь трансплантатов 7-7,5 мм2), взятого из бедренной кости сингенных мышей. Для адгезии клеток органную культуру костного мозга на подложке культивировали в течение 45 мин в культуральной среде, содер жащей 95 % среды RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург) и 5 % эмбриональной телячьей сыворотки (ICN Pharmaceuticals). Костный мозг служил
источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и ростовых факторов. При раздельном подкожном введении мышам подложек и фрагментов костного мозга образования тканевых пластинок не наблюдалось.
Через 45 дней имплантаты извлекали (рис. 1), фотографировали в отраженном свете с фиксированными параметрами. Снимали тканевые пластинки с поверхности дисков, декаль-цинировали, заливали парафином и выполняли тонкие (10 мкм) срезы перпендикулярно основанию тканевых пластинок, окрашивали гематоксилином-эозином для гистологических исследований. Позитивным результатом эктопического теста считали рост на поверхности пластин кости и костного мозга (рис. 2), негативным -развитие мышечной или соединительной ткани и ее производных (жировая ткань).
Методику компьютерной морфометрии применяли для выявления количественных параметров выросших тканевых пластинок и гистологических срезов посредством измерения их количественных характеристик. Площадь костной и кроветворной ткани на серийных срезах тканевых пластинок определяли с помощью программы ImageJ [1]. В связи с различным объемом трансплантатов на подложках площадь формирующихся тканевых пластинок выражали в процентах от исходной площади трансплантированного костного мозга. Группой сравнения служили имплантаты, несущие микродуговое покрытие, основные фазы которого составили диоксид титана (ТЮ2) и аморфные (примитивные) кальцийфосфаты. Данные
образцы способствуют воспроизводимому на 75-85 % росту костной ткани в тесте эктопического остеогенеза [2].
При проведении статистической обработки определяли среднее значение (Х) и ошибку среднего (m) с использованием гипотезы нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова), результаты представляли в виде X ± m. Для выявления статистической значимости различий выборок применяли критерий Манна-Уитни (^-тест). С целью выявления связи между исследуемыми показателями применяли определение коэффициентов ранговой корреляции по Спирмену (г). Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Эктопическая метаплазия костного мозга in vivo протекает через активацию пула донорских (в нашем случае костно-мозговых) ССК, дифференцирующихся в предшественники и потомки хондро/остеобластогенеза. Это является важнейшим условием развития кроветворного микроокружения для заселения кроветворных стволовых клеток реципиента и формирования эктопических очагов кость/костный мозг [7]. В связи с этим процессы, протекающие на пластинах с КФ покрытием, связанные с остеоген-ным созреванием и дифференцировкой ССК, можно считать остеоиндуктивными.
Исследование реакции биологических тканей, окружающих имплантаты, показало, что
Рис. 1. Вид тканевых пластинок, выросших в тесте эктопического костеобразования на мышах
2. Гистологическая картина срезов тканевых пластинок, выросших на кальцийфосфатных покрытиях в тесте эктопического остеогенеза. Окраска гематоксилином-эозином. Ув. х 100
Таблица 1
Физико-химические и биологические характеристики имплантатов с кальцийфосфатным микродуговым покрытием
Яа, мкм Вариант покрытия Основной фазовый состав покрытия Са/Р Вероятность образования тканевой пластинки, % Вероятность образования кости, %
2,15-2,86 Группа ТЮ2 с аморфными кальцийфосфатами ТЮ2-анатаз; Т1Р207; СаН2Р207; Са(Н2Р02)2 1,14 ± 0,19 100 п = 9 78
1,79-3,09 Группа фосфатов кальция и ТКФ Т1Р207; СаН2Р207; Са(Н2Р02)2; Са(Р03)2; Са3(Р04)2 1,65 ± 0,22 100 п = 6 100
2,85-3,58 Группа фосфатов кальция, ТКФ и ГАП Промежуточные формы КФ; Са5(Р04)30Н 2,19 ± 0,21* 100 п = 6 100
* Отличие от величины соответствующего показателя в группе аморфных кальцийфосфатов статистически значимо при р < 0,007.
Таблица 2
Морфометрические характеристики тканевых пластинок, выросших в тесте эктопического остеогенеза на имплантатах с различным фазовым составом кальцийфосфатных покрытий
Яа, мкм Вариант покрытия Основной фазовый состав покрытия Площадь тканевой пластинки, % от площади костного мозга Площадь кости в тканевой пластинке, %
2,15-2,86 Группа ТЮ2 с аморфными кальцийфосфатами ТЮ2-анатаз; Т1Р207; СаН2Р207; Са(Н2Р02)2 197,80 ± 27,20 48,12 ± 8,48 п = 72
1,79-3,09 Группа фосфатов кальция и ТКФ Т1Р207; СаН2Р207; Са(Н2Р02)2; Са(Р03)2; Са3(Р04)2 118,12 ± 26,68 41,35 ± 5,47 п = 48
2,85-3,58 Группа фосфатов кальция и ГАП Промежуточные формы КФ; Са5(Р04)30Н 244,19 ± 42,41# <0,05 64,79 ± 17,64 п = 50
* Отличие от величины соответствующего показателя в группе ТКФ статистически значимо при р < 0,05.
через 45 суток после подкожного введения подложек, несущих сингенный костный мозг, не отмечалось признаков воспалительной реакции ни в одной из групп наблюдения. Следует указать на высокую биосовместимость имплан-татов, вызывающих только слабую инкапсуляцию, говорящую о незначительной реакции подкожной клетчатки на их введение.
Способность тканевых пластинок формироваться из костного мозга для всех биосовместимых пластин с КФ покрытием составила 100 % (табл. 1). На гистологических срезах выявлялась в основном грубоволокнистая костная ткань с лакунами, заполненными красным костным мозгом (см. рис. 2).
Тем не менее в случае «примитивных» (аморфных) КФ покрытий (не содержащих ТКФ или ГАП) в 2 из 9 случаев вместо кости была обнаружена соединительная ткань. Полученные результаты во многом совпадают с ранее описанными данными для такого рода покрытий [4].
Таким образом, вероятность образования костной ткани из столбика костного мозга на 22 % выше в случае использования покрытий, включающих в свой состав ТКФ или ГАП (см. табл. 1), которые являются основными минералами костной ткани. При этом отмечена прямая зависимость вероятности формирования костной ткани от соотношения кальция к фосфору в составе КФ покрытия (г = 0,58; п = 13; р < 0,04). Данное соотношение отражает, как известно, не только элементный, но и, в определенной степени, фазовый состав КФ материалов.
Считается, что ГАП и ТКФ обладают остео-кондуктивными свойствами [3]. В связи с этим были определены площади тканевых пластинок и площади костной ткани на их гистологических срезах на имплантатах с различным фазовым составом КФ покрытий. Результаты показали, что площадь костной ткани коррелировала с площадью тканевых пластинок (г = 0,69; п = 11; р < 0,019). Другими словами, остеоин-дуктивность определяется гистокондуктивны-
ми свойствами КФ поверхностей. Однако нам не удалось установить, что фазовый состав фосфатов кальция имеет существенное значение для распространения (кондукции) ССК донора по шероховатой поверхности имплантатов с последующей остеогенной дифференциров-кой (табл. 2).
Расширяется применение имплантатов с КФ покрытиями в клинической практике, поскольку они улучшают параметры межфазной границы раздела искусственный материал/кость, во многом определяющей эффективность имплан-татов для остеосинтеза. Однако одновременно нарастает биомеханическая проблема, которая до сих пор не решена. Приближение свойств покрытия к характеристикам костной ткани (биомиметическое направление) приводит к ухудшению прочности межфазной границы подложка/покрытие [3]. Так, например, согласно нашим данным (рис. 3), увеличение толщины микродуговых КФ покрытий статистически значимо снижает их адгезию к металлической подложке.
В связи с этим стремление материаловедов получить «идеальный имплантат» для остео-синтеза за счет достижения в КФ покрытиях биологического соотношения фаз ГАП и ТКФ имеет неоднозначное значение для биомеханических свойств композитов подложка/покрытие и процессов остеокондукции и остеоиндукции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. В тесте эктопического костеобразования на пластинах, несущих искусственные шероховатые кальцийфосфатные покрытия с различным фазовым составом, путем остеоиндукции формируется грубоволокнистая костная ткань с полостями, заполненными красным костным мозгом.
2. Наличие трикальцийфосфата или гидро-ксилапатита в составе кальций-фосфатного покрытия, по сравнению с примитивными фосфатами кальция, увеличивает на 22 % воспроизводимость роста костной ткани в тесте эктопического остеогенеза, но не влияет на размеры формирующегося костного очага.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / Ред. В.В. Новицкий, В.П. Шахов, И.А. Хлусов. Томск: 8ТТ, 2004. 386 с.
2. Гнеденков С.В., Шаркеев Ю.П., Синебрю-хов С.Л. и др. Кальцийфосфатные биоактивные
G
5
«
0
1
в
М
I
6
о
р
30—I 282624222018161412-ю-8642
г = -0,96, р = 0,0025
~~1-1-1-1-1-1-1
20 40 60 80 100 120 140 Толщина покрытия, мкм
Рис. 3. Обратная регрессионная зависимость адгезии микродуговых кальцийфосфатных покрытий к титановой подложке при испытаниях «на отрыв»
покрытия на титане // Вестник ДВО РАН. 2010. (5). 47-57.
3. Карлов А.В., Саприна Т.В., Кириллова Н.А. и др. Некоторые клинические и патофизиологические вопросы и перспективы хирургической коррекции остеопении у пациентов с несовершенным ос-теогенезом // Гений ортопедии. 2008. (4). 84-88.
4. Хлусов И.А., Шевцова Н.М., Хлусова М.Ю. и др. Концепция «ниша-рельеф» для стволовых клеток как основа биомиметического подхода к инженерии костной и кроветворной тканей // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011. VI. (2). 55-64.
5. Ayers R.A., Simske S.J., Mumes C.R., Wol-ford L.M. Long-term bone ingrowth and residual microhardness of porous block hydroxyapatite implants in humans // J. Oral Maxillofac. Surg. 1998. 56. 1297-1301.
6. Bruijn J.D. Calcium phosphate biomaterials: Bone-bonding and biodegradation properties. Leiden, 1993. 170 p.
7. Chan C.K.F., Chen C.C., Luppen C.A. et. al. Endochondral ossification is required for hematopoietic stem cell niche formation // Nature. 2009. 457. 490-494.
8. Scadden D.T. The stem cell niche in health and leukemic disease // Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2007. 20. 19-27.
9. Sharkeev Yu.P., Legostaeva E. V., Eroshen-ko A. Yu. et. al. The structure and physical and mechanical properties of a novel biocomposite material, nanostructured titanium-calcium-phosphate coating // Composite Interfaces. 2009. 16. 535-46.
A SIGNIFICANCE OF PHASE COMPOSITION OF CALCIUM PHOSPHATE COATINGS FOR IN VIVO OSTEOGENIC DIFFERENTIATION OF STROMAL STEM CELLS
Vladimir Petrovich POPOV1, Marina Yur'yevna KHLUSOVA2, Konstantin Vasil'yevich ZAITSEV3, Marina Vladimirovna DVORNICHENKO2, Elena Viktorovna LEGOSTAEVA2, Igor' Al'bertovich KHLUSOV25, Yuriy Petrovich SHARKEEV2, Sergey Vasil'yevich GNEDENKOV4
1 Siberian State Medical University 634050, Tomsk, Moskovskiy trakt, 2
2 Scientific Educational Center "Biocompatible Materials andBioengineering", Tomsk Polytechnic University, Siberian State Medical University, Institute of Strength Physics and Materials Science SB RAS 634050, Tomsk, Moskovskiy trakt, 2
3 Tomsk Scientific Research Institute of Balneology and Physiotherapy 634021, Tomsk, Sibirskaya str., 31
4 Institute of Chemistry FEB RAS
690022, Vladivostok, Vladivostok centenary str., 159
5 "Bioconstructor-S" Ltd.
634050, Tomsk, Roza Luxemburg str., 1
Purpose: to study the effect of the phase structure artificial calcium - phosphatic surfaces on an osteogenic differentiation of stromal stem cells in vivo on implants with the fixed range of roughness. Materials and methods. The condition of the surface was estimated by means of the measuring system Talysurf 5-120, phase structure - by the diffractometer Shimadzu XRD-7000 (Japan), element structure - by the electron microscope of Hitachi S5500. An implant from the titan of the VT1.0 brand (diameter of 12 mm, thickness of 1 mm) with the rough calcium phosphate coating applied by microarc oxidation with a column of bone marrow has been hypodermically placed to 35 mice males of the CBA/CaLac line. Histological research was carried out in 45 days. The quantitative parameters of grown tissue plates were defined by the computer morphometry. Results. The growth of coarse-fibered bone tissue with the cavities filled by red marrow has been revealed on plates with artificial surfaces. Its reproducibility was 22 % higher on surfaces composed of tricalcium phosphate and hydroxylapatite compared with amorphous calcium phosphate.
Key words: implants, roughness, mice, bone marrow, stem cells.
Popov V.P. - candidate of medical sciences, assistant of the chair of traumatology, orthopedics and field surgery, e-mail: [email protected]
Khlusova M.Yu. - candidate of medical sciences, associate professor of the department of pathophysiology, e-mail: uchsovet @ ssmu.ru
Zaitsev K.V. - candidate of medical sciences, head of the laboratory for study of mechanisms of physical factors effect, e-mail: [email protected]
Dvornichenko M.V. - candidate of medical sciences, doctoral student of the chair for pathophysiology, e-mail: [email protected]
Legostaeva E.V. - candidate of physical mathematical sciences, senior researcher of the laboratory of physics of nanostructural biocompatible composites, e-mail: [email protected]
Khlusov I.A. - doctor of medical sciences, professor, scientific director, professor of the chair for morphology and general pathology, e-mail: [email protected]
Sharkeev Yu.P. - doctor of physical mathematical sciences, professor, head of the laboratory of physics of
nanostructural biocompatible composites, e-mail: [email protected]
Gnedenkov S.V. - doctor of chemical sciences, deputy director, e-mail: [email protected]
