CC BY
75
2014
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 2
ОНКОЛОГИЯ
УДК 616
Г. А. Раскин1,2, А. Э. Протасова3, Р. В. Орлова4, С. В. Петров5
ЗНАЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ХЕМОКИНА CXCR4 В МЕТАСТАЗИРОВАНИИ АДЕНОКАРЦИНОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ
1 Российский научный центр радиологии и хирургических технологий, Российская Федерация, 197758, Санкт-Петербург, пос. Песочный, Ленинградская ул., 70
2 НИИ фтизиопульмонологии, Российская Федерация, 191036, Санкт-Петербург, Лиговский пр., 2-4
3 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова, Российская Федерация, 191015, Санкт-Петербург, Кирочная ул., 41
4 Санкт-Петербургский государственный университет, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9
5 Казанский государственный медицинский университет, Российская Федерация, Республика Татарстан, 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49
Метастазирование в злокачественных опухолях — это процесс, в котором селективность органов как объектов возникновения вторичных очагов главным образом связана с экспрессией определенных факторов. Важным в развитии метастазов в настоящее время считается взаимодействие хемокина SDF-1 и его рецептора CXCR4. Целью исследования было проанализировать экспрессию CXCR4 в аденокарциномах толстой кишки и сопоставить ее с метастатическим статусом. Было исследовано 53 образования колоректального рака. У 22 пациентов в течение 5 лет не было выявлено регионарных и отдаленных метастазов, у 31 пациента были либо отдаленные, либо региональные метастазы на момент выявления опухоли. Экспрессия CXCR4 в нормальной слизистой оболочке носила гранулярный цитоплазматический характер. При оценке экспрессии CXCR4 в аденокарциноме толстой кишки наблюдается аналогичный характер реакции с локализацией рецептора в цитоплазме над нуклеолеммой, негативная реакция в клетках, находящихся в М-фазе клеточного цикла. Экспрессия CXCR4 не выявлена в 41% случаев без метастазов. В группе пациентов с морфологически верифицированными метастазами в 28 случаях из 31 (90%) отмечена позитивная реакция на CXCR4. Таким образом, негативная реакция на CXCR4 статистически значимо коррелирует с отсутствием метастазов при аденокарциномах толстой кишки (р = 0,0196). Библиогр. 20 назв. Ил. 2. Табл. 1.
Ключевые слова: CXCR4, хемокины, аденокарцинома толстой кишки.
SIGNIFICANCE OF CXCR4 EXPRESSION IN DEVELOPMENT OF COLON CANCER METASTASES
G. A. Raskin1,2, A. E. Protasova3, R. V. Orlova4, S. V. Petrov5
1 Scientific Research Phtysiopulmonology Institute, 2-4, Ligovskii pr., St. Petersburg, 191036, Russian Federation
2 Russian Research Center for Radiology and Surgical Technologies, 70, ul. Leningradskaya, pos. Pesochnyi, St. Petersburg, 197758, Russian Federation
3 North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov, 41, Kirochnaia ul., St. Petersburg, 191015, Russian Federation
4 St. Petersburg State University, 7/9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russian Federation
5 Kazan State Medical University, 49, ul. Butlerova, Kazan', 420012, Respublika Tatarstan, Russian Federation
Metastases development in cancer isn't a casual process, but targets of metastases are determined by expression of specific molecules in lymph nodes and organs and their receptors in cancer cells. CXCR4-SDF-1 axis is one of the most important interactions which may lead to metastasis. The aim of investigation was analysis of CXCR4 expression in colon adenocarcinomas and its comparison with metastatic status of tumor. Expression of CXCR4 in normal colon mucosa was cytoplasmic and has granular pattern. The same stain with cytoplasmic localization of receptor over nucleolemma was revealed in colon adenocarcinoma. Moreover nor normal mucosa, nor adenocarcinoma cells with mitoses CXCR4 expression was seen. 53 patients with colon adenocarcinoma were studied. Among them 22 don't have recurrences and metastases during 5 years, 31 patients have metastases. Expression of CXCR4 was absent in 41% cases without metastasis and only in 10% patients with metastasis. Conclusion: expression of CXCR4 correlates with colon cancer metastatic status (р = 0,0196). Refs 20. Figs 2. Table 1.
Keywords: CXCR4, chemokines, colon cancer.
Метастазирование в злокачественных опухолях — это процесс, в котором селективность органов как объектов возникновения вторичных очагов главным образом связана с экспрессией определенных факторов. Эти факторы поддерживают основные этапы, необходимые для успешного метастазирования, включая адгезию опухолевых клеток к стенкам микрососудов, экстравазацию в таргетную ткань и миграцию [1]. Орган обеспечивает условия, которые оптимальны для роста строго специфичных опухолевых клеток. Такое распределение метастазов опухолей различных локализаций впервые было описано Педжетом в 1889 г. [2] и названо «семя и почва», имелось в виду, что различные органы обеспечивают оптимальные условия роста для метастазов определенных форм злокачественных опухолей. Возможность раковых клеток проникать в эти органы достигается через хемотоксичные факторы, специфичные для каждой из них [3]. Из разнообразных компонентов, регулирующих органо-селективность (органо-специфичность), главная роль в данном процессе была отнесена к хемокинам и их рецепторам [1].
Хемокины — это суперсемейство малых (8-10 kD) белков, которые играют стержневую роль в регулировании лейкоцитарного движения и экстравазации через люминальную поверхность эндотелиальных клеток в места воспаленных тканей [4, 5]. Суперсемейство хемокинов включает как минимум 20 рецепторов и 40 лигандов. Хемокиновые лиганды были разделены на 4 категории в зависимости от экспрессии C, CC, CXC или CX3C аминокислотных последовательностей в N домене. CXC хемокины связываются с семейством G белков Serpentine, которые были названы CXC хемокиновыми рецепторами (CXCR) [5]. В настоящее время идентифицировано 6 таких рецепторов [6]. CXCL12 (stromal cell-derived factor-1, SDF-1) — это член CXC хемокинового семейства, ответственен за хемотаксис CD34+ гематопоэтических стволовых клеток, мегакариоцитов, B-лимфоцитов и Т-лимфоцитов. CXCL12 связывается с CXC хемокиновым рецептором 4 (CXCR4). CXCR4 был изначально открыт как ко-рецептор для лимфотропизма ВИЧ, а CXCL12 — в качестве лиганда CXCR4 [7]. Несмотря на то, что изначально хемокины открыты как молекулы, отвечающие за активацию и миграцию клеток иммунного ответа, в настоящее время показано, что их функции простираются дальше, чем хемотаксис лейкоцитов [8]. В эндотелиаль-ных клетках CXC хемокины воздействуют на клеточную миграцию и, следовательно, могут функционировать как ангиогенные/ангиостатические факторы, оказывающие влияние на опухолевый рост и неоангиогенез [9]. Роль CXCR4 в нормальном толстокишечном эпителии не совсем ясна, но это функционирующий рецептор, так как его лиганд SDF-1a выявлялся в неизмененной ткани толстой кишки [10]. Интересно,
что эпителиальная линия аденокарциномы толстой кишки HT-29 не экспрессиру-ет SDF-1a, что может отражать ее злокачественную природу. K. Shibuta и соавторы показали, что экспрессия SDF-1a отсутствует в аденокарциноме толстой кишки, по сравнению с прилежащей неопухолевой тканью [11]. Таким образом, авторы предполагают, что SDF-1a может быть геном-супрессором в канцерогенезе аденокарциномы толстой кишки. Этот эффект может быть связан со способностью SDF-1 ин-гибировать неоангиогенез, необходимый для роста злокачественной опухоли [9]. В 2007 г. было показано, что CXCR4 является ключевой молекулой в формировании перитонеального канцероматоза рака желудка [12]. В настоящее время известно, что высокая экспрессия SDF-1 отмечается в легких, печени, костном мозге, головном мозге и лимфатических узлах [13]. В раковых клетках молочной железы сигналинг через CXCR4 или CCR7 индуцирует полимеризацию актина, формирование псевдоподий и индуцирует хемотаксис и инвазию. In vivo нейтрализация взаимодействия CXCL12/CXCR4 значительно нарушает метастазирование клеток рака молочной железы в регионарные лимфоузлы и легкие [14].
Таким образом, взаимодействие CXCR-4 — SDF-1 может быть критичным в развитии метастазов злокачественных опухолей различных локализаций. Однако доказательств необходимости экспрессии CXCR4 для развития вторичных очагов опухоли не получено. Кроме того, неясна возможность использования анализа экспрессии данного рецептора для оценки прогноза развития заболевания. Целью исследования было проанализировать экспрессию CXCR4 в нормальной слизистой оболочке толстой кишки, а также в аденокарциномах толстой кишки, оценить ее характер и сопоставить ее с метастатическим статусом.
Материал и методы. Было исследовано 53 образования колоректального рака. У 22 пациентов в течение 5 лет не было выявлено регионарных и отдаленных метастазов, у 31 пациента были либо отдаленные, либо региональные метастазы на момент выявления опухоли. Все пациенты получали хирургическое лечение в Городском клиническом онкологическом диспансере Санкт-Петербурга. Опухоль признавалась неметастатической, если клинически в течение 5 лет не наблюдалось ме-тастазирование и в представленном материале было не менее 16 лимфоузлов. При микроскопическом исследовании выбирался блок опухоли с прилежащей нормальной слизистой оболочкой. С данного блока нарезались срезы толщиной 4 микрон, которые помещали на стекла с поли^-лизиновым покрытием. Срезы подсушивали, депарафинировали. Каждый срез обводился парафиновым карандашом, после чего осуществлялось ингибирование эндогенной пероксидазы 3% перекисью водорода в течение 20 мин. Затем на каждый срез наносилось первое антитело к CXCR4 и инкубировалась в течение ночи при температуре +2 — +8оС (в условиях холодильной камеры), демаскировка антигенов на данном срезе не проводилась. Визуализация реакции комплекса антиген-антитело осуществлялась при помощи системы визуализации EnVision Real (DAKO) и диаминобензидином в качестве хромогена. Оценивалась ядерная и цитоплазматическая реакции. Реакция признавалась достоверной, если выявлялась цитоплазматическая гранулярная реакция в клетках крипт нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Экспрессия CXCR4 оценивалась при помощи подсчета процента позитивных клеток.
Результаты. Экспрессия CXCR4 в нормальной слизистой оболочке носила гранулярный цитоплазматический характер.
Рис. 1. Экспрессия CXCR4 в нормальной слизистой толстой кишки:
а — увеличение 1:100; б, в — увеличение 1:400. Ярко-позитивная гранулярная цито-плазматическая реакция выявляется по всей толщине слизистой толстой кишки, с ослаблением реакции в поверхностной части (б).
Коричневое окрашивание (хромоген-диаминобензидин) выявлялось в виде 1-5 гранул, расположенных над нуклеолеммой, обращенной в сторону просвета крипт кишки. Причем наиболее выраженная экспрессия отмечалась в средних отделах, и она ослабевала к поверхностной и глубокой частям крипт (рис. 1). Аналогичные наблюдения публикуют N. J. Jordan и соавторы [8], O. Delezay и соавторы [15], они показали, что дифференцировка клеток в криптах толстой кишки сопровождается снижением и исчезновением экспрессии CXCR4. Добавление экзогенных факторов (жирных кислот и других препаратов), способствующих дифференцировке
клеток, в толстокишечные клеточные линии также вызывает снижение экспрессии CXCR4. Однако в наших исследованиях часть дифференцированных клеток крипт (поверхностные отделы) экспрессировала CXCR4 с высокой интенсивностью, что показывает возможность сохранения данного рецептора и в дифференцированных клетках. Кроме того, нами выявлена более низкая экспрессия CXCR4 в глубоких отделах крипт, в частности, все клетки, находящиеся в митозе, имели отрицательную реакцию на CXCR4 (рис. 1).
N. J. Jordan и O. Delezay предполагают, что взаимодействие SDF1 и CXCR4 вовлечено в механизм нормального обновления слизистой оболочки толстой кишки [8, 15]. Нетрудно предположить, что раз экспрессия CXCR4 высокая в коммитиро-ванных стволовых клетках крипт и исчезает при их дифференцировке, то данная молекула также отвечает за стволовые клетки в раковой опухоли. Наше предположение подтверждается исследованиями, которые показали, что большинство раковых стволовых клеток имеют экспрессию CXCR4 [16].
При оценке экспрессии CXCR4 в аденокарциноме толстой кишки мы наблюдаем аналогичную модель: гранулярный характер реакции с локализацией рецептора в цитоплазме над нуклеолеммой, негативная реакция в клетках, находящихся в М-фазе клеточного цикла (рис. 2). Цитоплазматические гранулы с CXCR4 так же, как и в нормальной слизистой оболочке, направлены преимущественно в сторону просвета желез, однако при увеличении 1:400 отчетливо видно, что в части раковых клеток экспрессия CXCR4 выявляется в зонах клеток, обращенных друг к другу или в сторону стромы (рис. 26).
Экспрессия CXCR4 была негативной в 41% случаев без метастазов у пациентов с прослеженным периодом в течение 5 лет. В группе пациентов с морфологически верифицированными метастазами в 28 случаях из 31 (90%) отмечалась позитивная реакция на CXCR4. Процент позитивных клеток всегда был выше 10% и не превышал 90%. Таким образом, негативная экспрессия на CXCR4 статистически значимо коррелирует с отсутствием метастазов при аденокарциномах толстой кишки (р = 0,0196, табл.).
Таблица. Сопряженности 2x2 для метастатической и неметастатической аденокарциномы с позитивным и негативным статусами по СХСИ4
Метастатический рак Аденокарциномы без метастазов Хи-квадрат = 5,4944 р = 0,0196
CXCR4 позитив 28 (90%) 13 (41%)
CXCR4 негатив 3 (10%) 9 (59%)
Основываясь на полученных данных, мы можем говорить о следующем механизме метастазирования с вовлечением рецепторов СХСИ4.
Во-первых, нормальная слизистая оболочка толстой кишки имеет высокую концентрацию SDF-1 — лиганда для СХСИ4. В ткани аденокарциномы SDF-1 отсутствует. Таким образом, если раковая клетка имеет сохранную экспрессию СХСИ4, то возникает хемотаксис в сторону высокой концентрации SDF-1 (лимфоузлы, легкие, печень или кости) [13, 17]. На начальном этапе процесс может быть уравновешен нормальной слизистой толстой кишки, так как высокая концентрация SDF-1 в слизистом слое притягивает и удерживает прилежащие раковые клетки, которые так же, как и нормальные клетки, имеют высокую экспрессию СХСИ4.
Рис. 2. Иммуногистохимическое исследование СХСИ4 в аденокарциноме толстой кишки:
а — увеличение 1:100; б — увеличение 1:400. Выявляется яркая цитоплазматическая гранулярная реакция чуть выше нуклеолеммы. 95% клеток экспрессируют СХСВ.4.
Наоборот, если экспрессия СХСИ4 отсутствует в раковых клетках, то нет взаимодействия между раковыми клетками и SDF-1 нормальной слизистой, что должно обуславливать локально-агрессивное течение аденокарциномы с распространением по слоям толстой кишки и увеличением размера первичной опухоли. Вероятно, данное взаимодействие может объяснить, почему некоторые опухоли небольшого
размера уже имеют отдаленные метастазы, а некоторые аденокарциномы достигают гигантских размеров без возникновения метастазирования.
Во-вторых, в настоящее время признано, что обычная клетка не способна сформировать метастатический очаг, для этого необходима стволовая дедиффе-ренцированная раковая клетка [18]. Все больше накапливаются доказательства, что ткань-коммитированные стволовые клетки, представленные в различных органах, являются клетками, из которых развивается злокачественная опухоль. В поддержку данной точки зрения выступает высокая длительность жизни стволовой клетки, что является необходимым условием для накопления мутаций, что, в свою очередь, критично для инициации/прогрессирования злокачественного роста. В итоге мутации, которые встречаются в нормальной стволовой клетке, приводят к ее злокачественной трансформации и инициации опухолевого роста [19, 20].
Таким образом, экспрессия CXCR4 в аденокарциномах толстой кишки имеет негативное прогностическое значение вследствие более высокого риска возникновения метастазов.
Литература
1. Zoccoli A., Iuliani M., Pantano F. Premetastatic niche: ready for new therapeutic interventions? // Expert Opin Ther Targets. 2012. Vol. 16, Suppl. 2. P. S119-129.
2. Paget S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast // Lancet. 1889. Vol. 1. P. 99-101.
3. Sarvaiya P. J., Guo D., Ulasov I. et al. Chemokines in tumor progression and metastasis // Oncotarget. 2013. Vol. 4. P. 2171-2185.
4. Teijeira A., Rouzaut A., Melero I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes // Front Immunol. 2013. Vol. 4. P. 433-439.
5. Premack B. A., Schall T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection // Nat. Medicine. 1996. Vol. 2. P. 1174-1178.
6. Vinader V., Afarinkia K. A beginner's guide to chemokines // Future Med Chem. 2012. Vol. 4. P. 845852.
7. Luster A. D. Chemokines: chemotactic cytokines that mediate inflammation // New England Journal Medicine. 1998. Vol. 338. P. 436-445.
8. Jordan N. J., Kolios G., Abbot S. E. et al. Expression of functional CXCR4 chemokine receptors on human colonic epithelial cells // Journal Clinical Investigation. 1999. Vol. 104. P. 1061-1069.
9. Keane M. P., Arenberg D. A., Moore B. B. et al. CXC chemokines and angiogenesis/angiostasis // Proceding National Acadeny Sciense USA. 1998. Vol. 110. P. 288-296.
10. Reya T., Morrison T. J., Clarke M. F. et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells // Nature. 2001. Vol. 414. P. 105-111.
11. Shibuta K., Begum N. A., Mori M. et al. Reduced expression of the CXC chemokine hIRH/SDF-1 alpha mRNA in hepatoma and digestive tract cancer // Int Journal Cancer. 1997. Vol. 73. P. 656-662.
12. Koizumi К., Hojo S., Akashi N. et al. Chemokine receptors in cancer metastasis and cancer cell-derived chemokines in host immune response // Cancer Science. 2007. Vol. 98(11). P. 1652-1658.
13. Peguero J. S., Camacho L. H., Kemp B., Campos L. T. Chemokine expression in tumor-to-tumor metastasis // Oncol Lett. 2010. Vol. 1. P. 449-452.
14. Liu Y., Ji R., Li J. et al. Correlation effect of EGFR and CXCR4 and CCR7 chemokine receptors in predicting breast cancer metastasis and prognosis // Journal Experimental Clinical Cancer Research. 2010. Vol. 29(1). P. 16-23.
15. Delezay O., Koch N., Yahi N. et al. Co-expression of CXCR4/fusin and galactosylceramide in the human intestinal epithelial cell line HT-29 // AIDS. 1997. Vol. 11. P. 1311-1318.
16. Schecter A. D., Rollins B. J., Zhang Y. J. et al. Tissue factor is induced by monocyte chemoattractant protein-1 in human aortic smooth muscle and THP-1 cells // Journal Biology Chemistry. 1997. Vol. 272. P. 28568-28573.
17. Gelmini S., Mangoni M., Serio M. et al. The critical role of SDF-1/CXCR4 axis in cancer and cancer stem cells metastasis // Journal Endocrinol Investigation. 2008. Vol. 31. P. 809-819.
18. Diehn M., Majeti R. Metastatic cancer stem cells: an opportunity for improving cancer treatment? // Cell Stem Cell. 2010. Vol. 6. P. 502-503.
19. Tavor S., Petit I., Porozov S. et al. CXCR4 regulates migration and development of human acute myelogenous leukemia stem cells in transplanted NOD/SCID mice // Cancer Research. 2004. Vol. 64. P. 28172824.
20. Dontu G., Al-Hajj M., Abdallah W. M. et al. Stem cells in normal breast development and breast cancer // Cell Proliferation. 2003. Vol. 36. P. 59-72.
Статья поступила в редакцию 25 марта 2014 г.
Контактная информация
Раскин Григорий Александрович — кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, старший научный сотрудник; [email protected]
Протасова Анна Эдуардовна — доктор медицинских наук, профессор Орлова Рашида Вахидовна — доктор медицинских наук, профессор Петров Семен Венедиктович — доктор медицинских наук, профессор
Raskin Grigory A. — Candidate of Medicine, Chief researcher, Scientific Research; [email protected] Protasova Anna E. — Doctor of Medicine, Professor Orlova Rashida V. — Doctor of Medicine, Professor Petrov Semen V. — Doctor of Medicine, Professor
