CC BY-ND
31
4
ЗНиСО ЯНВАРЬ №1 (226)
ЗНАЧЕНИЕ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ
Т.Н. Леонова1, Н.В. Крылова1, Е.В. Павленко1, С.И. Беликов2, И. Г. Кондратьев2
THE VALUE OF THE FAR EASTERN TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS STRAINS OF INFECTIOUS DISEASES
G.N.. Leonova, N.V. Krylova, E.V. Pavlenko, S.I. Belikov, I.G. Kondratyev
'Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, 2Лимнологический институт СО РАН
Показано, что на Дальнем Востоке России разные формы клещевого энцефалита вызывают штаммы вируса только дальневосточного субтипа. Определены иммунопатогенетические особенности разных форм инфекции от инаппарантной до очаговых с летальным исходом. Охарактеризованы штаммы вируса клещевого энцефалита по нейровирулентности и нейроинвазивности. Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, биологическая вариабельность, иммунопатогенез. It is shown that in the Russian Far East different forms of tick-borne encephalitis virus strains cause only the Far Eastern subtype. Are defined features of immunopathogenicity of different forms of inapparent infection to focal forms with a lethal outcome. Characterized strains of tick-borne encephalitis virus in neurovirulence and neuroinvazivnosti.
Keyword: tick-borne encephalitis. immunopathogenicity, neurovirulence, strains of virus.
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) впервые был открыт в 1937 г. Л.А. Зильбером на территории Дальнего Востока. В настоящее время эта нейроинфекция известна на Евразийском континенте от островов Тихоокеанского бассейна (Япония, Сахалин) до берегов Атлантического океана и имеет выраженную географическую неоднородность по эпидемической напряженно -сти и по тяжести клинического течения инфекции. На территории Приморского края в разные годы удельный вес лихорадочной формы клещевого энцефалита (КЭ) колебался от 20 до 50 %, менингеальной — до 20 % и очаговых форм — от 30 до 60 %.
Наши исследования были направлены на изучение биологической и молекулярной характеристики штаммов ВКЭ, попавших в организм человека при укусе клеща, а также выявление особенностей влияния их на иммунную систему пациента.
Для решения этих вопросов мы применили авторские способы экспресс-диагностики КЭ и изоляции вируса из крови лиц после укуса клеща. Выявление антигена ВКЭ в крови проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). За этот период обследовано несколько тысяч лиц с жалобами на укус клеща, а также больных КЭ. Установили, что в 70 % случаев происходила быстрая элиминация вирусного антигена из крови лиц, которые фактически оставались абсолютно здоровыми. У 30 % лиц регистрировали различные формы манифестного течения инфекции. Патологию при КЭ следует рассматривать с позиций единого механизма, лежащего в основе защитного и повреждающего действий имму-номорфологических реакций. Это обусловливает широкий диапазон проявлений инфекционного процесса — от инаппарантных и апаралитических форм до тяжелых очаговых форм острого КЭ с летальными исходами, а иногда с хронически-прогредиентным течением заболевания.
Представил интерес изучить начальный этап (на 2—4-е сутки после укуса клеща) иммунопа-тогенеза инфекции у лиц, в крови которых был выявлен антиген вируса КЭ, но эти люди не заболели. Повторное обследование их на наличие антигена проводили через месяц и при необходимости — через 6 и более месяцев.
При изучении гуморальных факторов иммунитета у таких лиц было отмечено, что в указанные сроки исследования не только клинические проявления заболевания, но и вирусспецифи-ческие антитела класса ^М к антигену ВКЭ не были зарегистрированы.
На ранней стадии инфицирования вирусом КЭ важно было определить иммунологические маркеры, характеризующие либо быструю элиминацию вируса из организма, либо его длительную персистенцию. При иммунофенотипи-ровании субпопуляций лимфоцитов на ранней стадии инфицирования ВКЭ отличительным признаком в группе лиц с кратковременной антигенемией являлось повышение относительного количества естественных киллеров ^К-клеток), Т-лимфоцитов-киллеров ^КТ-клеток) и активированных Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3+CD95+) по сравнению с показателями у здоровых доноров.
В то же время у лиц с длительной персистен-цией вируса на начальном этапе инфицирования ВКЭ выявляли сниженный уровень NKT-клеток и активированных Т-лимфоцитов, что можно считать прогностически неблагоприятным признаком. Кроме того, при анализе содержания про- и противовоспалительных цитокинов на ранней стадии инфицирования ВКЭ в крови этих пациентов не выявлена стимуляция продукции провоспалительных цитокинов (^-ф, 1КК-а). И только уровень TNF-а был выше в 1,6 раза, по сравнению с таковым у здоровых доноров, а концентрация №N-7 находилась на уровне контрольных значений. Эти данные, ка-
ЯНВАРЬ №1 (226)
5
сающиеся неактивной продукции ^-ф, IFN-a и №N-7, помогают понять причину задержки элиминации вируса у пациентов с длительной анти-генемией.
Следующим этапом наших исследований было выявление особенностей иммунопатогене-за манифестных форм КЭ. Обследовано 50 пациентов в возрасте от 18 до 55 лет, которые были разделены на 3 группы: 1-я группа — 28 пациентов с лихорадочной формой КЭ; 2-я группа — 16 пациентов с благоприятным исходом при очаговых формах КЭ; 3-я группа — 6 пациентов с летальным исходом при очаговых формах КЭ.
Установлено, что при лихорадочной форме КЭ изменения параметров клеточного иммунитета носили компенсаторный характер: снижение количества CD3+- и CD4+-клеток сопровождалось увеличением количества NK-клеток и усилением экспрессии активационных антигенов (CD25+, CD95+). У пациентов данной группы отмечался умеренный характер активации системы комплемента и системного цитокинового ответа ТЫ-типа. Результаты этих исследований показали, что иммунологическая реактивность при лихорадочной форме КЭ соответствует общеизвестным иммунологическим закономерностям и может рассматриваться как адекватный иммунный ответ на вирусную инфекцию.
При очаговых формах КЭ развивается параллельно как противовирусный, так и иммунопатологический ответ. Их суммарное действие влияет на течение и исход инфекции. У пациентов с благоприятным исходом при очаговых формах КЭ в начальной стадии заболевания наблюдался глубокий дефицит Т-клеточного звена иммунитета. Несмотря на активацию гуморального звена иммунной системы, у этих пациентов отмечалась диспропорция содержания подклассов IgG. Низкие концентрации одного или нескольких подклассов IgG служат индикаторами дисфункции Т- и В-клеток, и могут возникнуть в результате нарушения продукции цитокинов. Известно, что дефект в продукции 1Г№-у замедляет переключение синтеза антител с ^М на IgG1 и IgG3. У пациентов этой группы в остром периоде отмечалось повышение уровня противовоспалительных цитокинов, что, с одной стороны, свидетельствует о своевременной активации противовоспалительных механизмов защиты, а с другой стороны, характеризует недостаточность клеточного иммунного ответа на фоне низких значений ТЫ-цитокинов.
Особого внимания заслуживает группа пациентов с летальным исходом при очаговых формах КЭ. Изменения показателей клеточного иммунитета у них характеризовались дефицитом содержания зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) на фоне повышения количества незрелых активированных Т- и В-лимфоцитов. Отмечалась также депрессия киллерных механизмов цитотоксической активности (снижение количества CD8+-, NK-, NKT-клеток). В гуморальном звене иммунитета выявлена гиперактивация системы комплемента, в
цитокиновом — ранняя гиперпродукция про- и противовоспалительных цитокинов.
Таким образом, у пациентов этой группы наблюдалась дисфункция различных звеньев иммунной системы активационного типа как системного воспалительного избыточного ответа, характерного для острой фазы инфекционного процесса. Но неадекватность ответа в острой фазе является серьезной предпосылкой к формированию в патогенезе общей иммуно-депрессии, указывающей на тяжелое течение и неблагоприятный прогноз заболевания.
Разнообразие типов иммунного ответа у пациентов с разными формами КЭ обусловлено исходным уровнем иммунокомпетентности организма пациента, дозой антигена вируса, а также степенью вирулентности возбудителя.
В этой связи наши научные поиски были направлены на изоляцию и изучение характеристики вирусной популяции, попавшей в организм человека после укуса клеща и вызвавшей ту или иную форму инфекции. Получена полногеномная характеристика 36 штаммов ВКЭ, изолированных от больных с очаговыми формами в 11 случаях (30,5 %), лихорадочной — в 4 (11,1 %) и в 21 случае (58,3 %) — от лиц с инаппарантной формой инфекции. Показано, что все изученные штаммы принадлежали только к дальневосточному субтипу ВКЭ. На филогенетическом древе они расположились в двух крупных кластерах. Штаммы 1-го кластера заняли близкие позиции к штамму ОБЫша, 2-го кластера — к штамму Со-фьин. В кластере 1 доминировали штаммы, вызвавшие инаппарантную форму КЭ (82 %), здесь же по 9 % пришлось на штаммы с лихорадочной и очаговыми формами инфекции. Второй кластер в большинстве случаев состоял из штаммов, вызвавших манифестные формы. Из них 9 штаммов из группы очаговых форм и 2 — лихорадочной, здесь же расположились 3 штамма, вызвавших инаппарантную форму инфекции. Основная доля инаппарантных штаммов была изолирована на юге Приморского края. Штаммы ВКЭ, которые вызвали очаговые формы с летальным исходом, изолированы в отдаленных таежных районах среднего Сихотэ-Алиня.
Известно, что вирулентность возбудителей инфекционных болезней является одним из наиболее важных биологических свойств микроорганизма. Ведущим патогенетическим маркером, позволяющим дифференцировать штаммы ВКЭ, является, по нашему мнению, уровень периферической активности изолятов, отражающий способность возбудителя проникать в мозг. Причем, при периферической инокуляции вируса проявляется важный компонент нейровирулент-ности — нейроинвазивность.
На модели белых мышей разного возраста дана характеристика нейровирулентности и ней-роинвазивности штаммов ВКЭ, принадлежащих к разным группам. Показано, что вирусная активность всех штаммов для белых мышей при внутримозговом (в/м) заражении чаще имела
6
ЗНиСО ЯНВАРЬ №1 (226)
высокий уровень (7,7—11,0 ^ LD50/мл), что указывало на выраженную их вирулентность. При подкожном (п/к) заражении титр вируса у инап-парантных штаммов был ниже и колебался от 3,7 до 7,7 ^ LD50/мл. Все изученные штаммы ВКЭ проявили достаточно высокую инфекционную активность. Средняя продолжительность жизни (СПЖ) при в/м заражении мышей весом 18—20 г штаммами, вызвавшими очаговые формы, варьировала от 4,6 до 10,0 дней и в среднем составила 6,1 ± 0,5, а при п/к заражении — 8,9 ± 1,7. Для штаммов, вызвавших инаппарантное течение инфекции при в/м заражении белых мышей, СПЖ составила 14,4 ± 3,2, а при п/к заражении мышей для некоторых штаммов СПЖ резко увеличивалась до 28 дней, в среднем она составила (20,3 ± 3,9) дней. Штаммы, вызвавшие манифестные формы инфекции, как правило, более активно проявляли нейровирулентные и нейро-инвазивные свойства.
Проведено изучение гемагглютинирующей активности (ГА) штаммов при значениях рН 5,4; 6,2 и 6,8. Штаммы, вызвавшие очаговые формы увеличивали ГА активность от рН 5,4 к рН 6,8. Инаппарантные штаммы наоборот имели наибольшую активность при рН 5,4 и наименьшую — при рН 6,8.
Таким образом, показано, что на Дальнем Востоке России инфекционный процесс при КЭ с разной степенью тяжести вызывают штаммы только дальневосточного субтипа ВКЭ, которые вариабельны по параметрам как биоло-
гической (иммунопатогенетической, физико-химической, вирулентности), так и молекулярно-генетической характеристики.
Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ № 4006.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ерман Б.А. Патологическая анатомия современного клещевого энцефалита на Урале. Екатеринбург:1999. 80 с.
2. Леонова Г.Н., Борисевич В.Г. Патент № 2205652 «Способ выделения арбовирусов, в частности клещевого энцефалита», 10.06.2003.
3. Леонова Г.Н., Беликов С.И., Павленко Е.В., Кулакова Н.В., Крылова Н.В. Биологическая и молекулярно-генетическая характеристика дальневосточной популяции вируса клещевого энцефалита и ее патогенетическое значение //Вопр. вирусологии. 2007. № 6. С. 13—17.
4. Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Пакскина Н.Д. Организация надзора за клещевым вирусным энцефалитом и меры по его профилактике в Российской Федерации //Вопр. вирусол. 2007. № 5. С. 8—10.
5. Офицеров В.И. Подклассы иммуноглобулина G: возможности использования в диагностической практике. Кольцово, 2005. 35 с.
Контактная информация:
Леонова Галина Николаевна, тел.: 8-924-2396480
Contact information: Leonova Galina, phone: 8-924-2396480
