CC BY
62
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 202-207
УДК 611.013.12
ВЗАИМОСВЯЗЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК СПЕРМАТОЗОИДОВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
ПРИ ДЕЙСТВИИ АРГОНИРОВАННОЙ ВОДЫ
© 2011 г. Я.С. Новикова 1, Т.Г. Щербатюк 1,2, Т.Е. Потёмина 2,
Е.С. Клинцова 2, В.В. Чернов 3
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
2 Нижегородская государственная медицинская академия
3 Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород
поуікоуа_ [email protected]
Поступила в редакцию 01.06.2011
Эксперименты выполнены на 24 нелинейных беспородных белых крысах-самцах. Модель неопла-зии создавали путём трансплантации опухолевого штамма лимфосаркомы Плисса. Установили, что аргонированная вода усиливает свободнорадикальную активность и угнетает сперматогенез у интакт-ных животных, а у животных-опухоленосителей увеличивает антиоксидантные ресурсы и стимулирует сперматогенез. Выявлена высокая корреляционная взаимосвязь между параметрами свободнорадикальной активности, количеством и подвижностью сперматозоидов.
Ключевые слова: сперматогенез, аргонированная вода, лимфосаркома Плисса, перекисное окисление липидов.
Введение
Известно, что наличие опухоли сопровождается нарушением про- и антиоксидантного баланса, которое проявляется на стационарных фазах роста усилением антиоксидантной активности в опухоли и интенсификацией перекисно-го окисления липидов в организме [1]. Состав липидов плазматической мембраны, покрывающей сперматозоиды млекопитающих, значительно отличается от состава липидов соматических клеток. Она содержит большое количество фосфолипидов, насыщенных и полинена-сыщенных жирных кислот и стеринов, поэтому сперматозоиды особенно чувствительны к повреждающему действию активных форм кислорода [2]. Кроме того, мужские половые клетки являются активнопролиферирующими, что также делает мужскую репродуктивную систему крайне чувствительной и уязвимой к малейшим изменениям в организме. Именно поэтому мы полагаем, что сперматозоиды будут наиболее чувствительны к изменениям свободнорадикальной активности среды.
В небольших количествах активные формы кислорода необходимы для нормальной регуляции функции сперматозоидов, их гиперактивации и акросомальной реакции [3], но гиперпродукция активированных форм кислорода при-
водит к повреждению мембраны сперматозоидов, снижению их подвижности и нарушению оплодотворяющей способности [4]. Кроме того, свободные радикалы непосредственно повреждают ДНК хромосом [3] и инициируют апоптоз сперматозоидов [5], что приводит, в конечном счете, к бесплодию [6].
Сообщается, что в присутствии аргона вода диссоциирует более интенсивно и увеличивается концентрация активированного кислорода [7]. Шулагин и др. выявили, что аргон может восстанавливать потребление кислорода при гипоксии [8]. Возможности медикаментозного лечения нарушений сперматогенеза, сопряженных с оксидативным стрессом, ограничены, поэтому поиск новых препаратов - актуальная задача андрологии.
Цель настоящего исследования - определение характера взаимосвязи свободнорадикальных процессов и морфофункциональных характеристик сперматозоидов интактных крыс и крыс с лимфосаркомой Плисса при действии аргонированной воды.
Для достижения данной цели решались следующие задачи:
1. Определить и сравнить интенсивность индуцированной хемилюминесценции и уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенатах семенников и плазме кро-
ви интактных крыс и крыс с лимфосаркомой Плисса на 11-е сутки роста опухоли.
2. Оценить общую антиоксидантную активность и активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в гомогенатах семенников и плазме крови экспериментальных животных.
3. Изучить функциональные показатели семенной жидкости экспериментальных животных и оценить их взаимосвязь с биохимическими параметрами.
Экспериментальная часть
Эксперимент был выполнен на 24 нелинейных беспородных белых крысах-самцах в возрасте 7 месяцев. Все животные содержались в стационарных условиях вивария. На первом этапе были выделены 2 группы животных: животные первой группы в неограниченном количестве получали аргонированную воду, второй - обычную водопроводную. Через 1.5 месяца после начала эксперимента 6-ти животным из первой группы и 6-ти из второй привили опухоль. В работе использована экспериментальная модель опухолевого роста - лимфосар-кома Плисса, приобретённая в ИЭДиТ РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина. Декапитация животных под эфирным наркозом проводилась на 11 -е сутки роста опухоли. Материалы для исследований: плазма крови, гомогенаты семенников и эякулят. Воду аргонировали путем барботации дистиллированной воды (ИПФ РАН, Н. Новгород).
В биологических образцах проводили следующие методы оценки свободнорадикальной активности.
1. Метод индуцированной хемилюминес-ценции, который косвенно отражает начальные стадии радикалообразования [9]. Информативными показателями считали максимальную интенсивность свечения исследуемой пробы, отражающую свободнорадикальную активность образца, и светосумму хемилюминесценции, которая обратно пропорциональна антиокси-дантной активности пробы.
2. Ультрафиолетовая спектроскопия продуктов ПОЛ, таких как диеновые и триеновые конъюгаты (ДК, ТК) и малоновый диальдегид (МДА) [10].
3. Определение активности СОД [11, 12] и каталазы [13-15].
Осуществляли подсчет количества сперматозоидов в камере Горяева и функциональное исследование половых клеток [16].
Среди сперматозоидов принято различать подвижные и неподвижные формы. Неподвижные сперматозоиды не способны к
оплодотворению. В свою очередь, среди подвижных половых клеток одни колеблются на месте - колеблющиеся, а другие активно передвигаются в пространстве; активные сперматозоиды обладают большей оплодотворяющей способностью, чем колеблющиеся. Учитывали клетки с активным поступательным движением, совершающие колебательные движения (гипокинезис) и неподвижные сперматозоиды (акинезис).
Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием программы Statistica 6.0, различия считали статистически значимыми при уровне значимости р < 0.05. Степень согласованности изменений исследуемых признаков определялась по ранговому коэффициенту корреляции Спирмена (выделялись положительные и отрицательные корреляции, свидетельствующие о наличии прямой или обратной связей соответственно; при r > |0.7| выделялись сильные типы связей; согласованность изменений считалась высоко значимой приp < 0.01).
Результаты и их обсуждение
Потребление аргонированной воды здоровыми животными в течение 1.5 месяцев приводит к увеличению показателя максимальной интенсивности хемилюминесценции в семенниках на 18% и концентрации продуктов ПОЛ: диеновых (на 50%) и триеновых конъюгатов (на 60%) по сравнению с интактными крысами, пившими водопроводную воду (рис. 1, 2).
Общая антиоксидантная активность и активность СОД и каталазы в семенниках здоровых животных, пивших аргонированную воду, статистически значимо не отличаются от показателей интактных животных (рис. 3). На клеточном уровне такие изменения в про- и антиоксидант-ной системе крыс, потреблявших аргонирован-ную воду, приводят к ухудшению морфофункциональных свойств половых клеток: снижению количества (на 12%), подвижности (на 12%) и активности (на 10%) сперматозоидов (рис. 4). Выявлена высокая корреляционная зависимость между показателями свободнорадикальной активности в семенниках и количественными и качественными параметрами половых клеток: максимальная интенсивность
хемилюминесценции / количество сперматозоидов (г = -0.71), подвижность сперматозоидов (г = -0.8); уровень продуктов ПОЛ - ДК, ТК и МДА / количество сперматозоидов (r1 = -0.75; r2 = -0.7; r3 = -0.74), подвижность сперматозоидов (ri = -0.73; r2 = -0.71; r3 = -0.75).
>
1.60 1.40 1.20 1.0 0 0.80 0.60 0.40 0.20
0.0 0
Интактные Интактные Лимфосаркома Лимфосаркома
(вода) (аргон) Плисса (вода) Плисса (аргон)
Г руппы животных
Рис. 1. Свободнорадикальная активность гомогенатов семенников экспериментальных животных
нт
о
§
С
р
рП
□ ДК
□ ТК
□ МДА
Интактные Интактные Лимфосаркома Лимфосаркома (вода) (аргон) Плисса (вода) Плисса (аргон)
Г руппы животных
Рис. 2. Концентрация продуктов перекисного окисления липидов в гомогенатах семенников экспериментальных животных
В плазме животных, пивших аргонирован-ную воду, наблюдается повышение максимальной интенсивности хемилюминесценции на 30%, однако среди продуктов ПОЛ статистически значимо повышается только уровень диеновых конъюгатов - первичных продуктов ПОЛ (на 52%). Интегральное значение водорастворимых антиоксидантов в плазме крови здоровых крыс, потреблявших аргонированную воду, ниже на 10% по сравнению с показателями общей антиоксидантной активности интактных животных. Значения активности СОД и катала-зы статистически значимо не отличаются от показателей группы интактных животных. Выявлена отрицательная корреляционная зависимость между количеством и подвижностью половых клеток животных, пивших аргонирован-ную воду, и максимальной интенсивностью хе-милюминесцентного свечения в плазме (г1 = = -0.43; г2 = -0.41). Возможно, аргонированная вода обладает биологическим действием: уси-
ливает выработку свободных радикалов в организме, что приводит к интенсификации свободнорадикального окисления в семенниках и плазме и, как следствие, к снижению количества и активности сперматозоидов.
Наличие опухоли интенсифицирует свободнорадикальные процессы и угнетает работу ан-тиоксидантных систем защиты в семенниках животных-опухоленосителей. Уровень максимальной интенсивности хемилюминесценции семенников крыс с лимфосаркомой на 11 -е сутки роста опухоли увеличился на 80% по сравнению с показателями интактных животных (рис. 1). Лимфосаркома Плисса привела к статистически значимому увеличению содержания продуктов ПОЛ в семенниках животных-опухоленосителей, пивших водопроводную воду, по сравнению со значениями интактных животных: ДК в 3.5 раза, ТК в 4 раза и МДА в 4 раза (рис. 2). Общая антиоксидантная активность семенников животных-опухоленосителей
(вода) (аргон) Плисса (вода) Плисса (аргон)
Г руппы животных
Рис. 3. Изменение активности СОД и каталазы в гомогенатах семенников экспериментальных животных
снизилась на 75% по сравнению с показателями здоровых крыс. Активность СОД и каталазы в семенниках животных с лимфосаркомой Плисса снизилась в 3 и 2 раза по сравнению с активностью ферментов интактных самцов соответственно (рис. 3).
Таким образом, лимфосаркома Плисса интенсифицирует свободнорадикальные процессы в семенниках животных-опухоленосителей. Интерес представляет то, как усиление свободнорадикальных процессов в семенниках отражается на подвижности самих сперматозоидов. На 11-е сутки после трансплантации лимфосарко-мы количество половых клеток в эякуляте снижается на 50%, подвижность половых клеток ниже на 20%, а активность - на 30% по сравнению с показателями здоровых крыс (рис. 4). Также выявлена высокая отрицательная корреляционная взаимосвязь между показателями свободнорадикальной активности в семенниках животных с лимфосаркомой Плисса и морфофункциональными параметрами половых клеток: максимальная интенсивность хемилюми-несценции / количество сперматозоидов (г = -0.9), подвижность сперматозоидов (г = = -0.75); уровень продуктов ПОЛ - ДК, ТК и МДА / количество сперматозоидов (г1 = -0.9; г2 = -0.91; г3 = -0.83), подвижность сперматозоидов (г1 = -0.9; г2 = -0.84; г3 = -0.8).
Лимфосаркома Плисса вызывает активацию процессов ПОЛ в организме-опухоленосителе. Статистически значимо повышаются интегральный показатель свободнорадикального окисления (на 20%) и уровень продуктов ПОЛ: ДК в 2.5 раза, ТК в 4.4 раза и МДА в 6.7 раза в
плазме крови животных-опухоленосителей по сравнению с показателями здоровых крыс. Общая антиоксидантная активность плазмы самцов белых крыс с лимфосаркомой выше на 19%, активность СОД статистически значимо не отличается, в то время как активность каталазы повышается на 30% по сравнению с интактны-ми животными. При этом выявлена отрицательная корреляционная зависимость между максимальной интенсивностью хемилюминесцентно-го свечения в плазме животных с неоплазией и количеством и подвижностью половых клеток (г1 = -0.38; г2 = -0.35). Таким образом, при сравнении изменений биохимических параметров плазмы и семенников крыс с лимфосаркомой Плисса можно сделать предположение, что при патологическом состоянии семенники являются более чувствительными к изменению свободнорадикальной активности, чем плазма, так как между параметрами свободнорадикальной активности семенников и морфо-функциональ-ными показателями сперматозоидов выявлена более сильная корреляционная взаимосвязь. Лимфосаркома Плисса - солидная соединительнотканная опухоль, которая напрямую не затрагивает репродуктивную систему, однако она оказывает сильное дистантное воздействие на сперматогенез, в том числе посредством раз-балансировки свободнорадикального баланса семенников в сторону прооксидантного.
Введение аргонированной воды животным с лимфосаркомой Плисса привело к стимуляции антиоксидантной системы защиты в семенниках. Интегральное значение водорастворимых антиоксидантов в семенниках крыс, потребляв-
Е?
8
ш
и
е
V
к
ч
Интактные
(вода)
Интактны1е
(аргон)
Лимфосаркома Плисса (вода)
Лимфосаркома Плисса (аргон)
Г руппы животных
Рис. 4. Изменение количества половых клеток под действием аргонированной воды на фоне роста лимфосарко-мы Плисса
ших аргонированную воду, на 11-е сутки роста опухоли выше в 3 раза по сравнению с показателями животных-опухоленосителей, пивших водопроводную воду. Также наблюдалось увеличение активности СОД на 40% и каталазы -на 50% (рис. 3). В семенниках крыс с лимфо-саркомой Плисса, пивших аргонированную воду, уровень максимальной интенсивности хе-милюминесценции статистически значимо ниже (на 20%) значений в группе крыс с неоплазией, потреблявших водопроводную воду (рис. 1). Уровень продуктов ПОЛ в семенниках - ДК, ТК и МДА - ниже на 20, 38 и 34% соответственно (рис. 2).
Потребление аргонированной воды животными с лимфосаркомой Плисса привело к увеличению количества сперматозоидов на 40% по сравнению с крысами-опухоленосителями, пившими обычную воду (рис. 4). Процент подвижных половых клеток оставался неизменным, однако количество активных сперматозоидов повысилось на 10%. Интенсивность хемилюми-несцентного свечения в семенниках животных с опухолью, пивших аргонированную воду, отрицательно коррелировала с количеством половых клеток (г1 = -0.85). Таким образом, потребление аргонированной воды крысами за 1.5 месяца до трансплантации лимфосаркомы Плисса привело к стимуляции антиоксидантныгс защитныгс систем и снижению свободнорадикального окисления в семенниках, что положительно отрази-
лось на морфофункциональных характеристиках сперматозоидов.
В плазме крови животных с опухолью, пивших аргонированную воду, на 11 -е сутки роста новообразования статистически значимых изменений параметра максимальной интенсивности хемилюминесценции по сравнению с крысами-опухоленосителями, пившими обычную воду, не выявлено. Уровень продуктов ПОЛ статистически значимо ниже: ДК в 1.3 раза, ТК в 3 раза и МДА в 4 раза. Интегральный показатель общей анти-оксидантной активности плазмы самцов крыс с опухолью, пивших аргонированную воду, повысился на 80%, однако активность каталазы, наоборот, оказалась ниже в 2 раза по сравнению с животными с лимфосаркомой, пившими водопроводную воду.
Выводы
На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы.
1. В физиологических условиях аргониро-ванная вода усиливает процессы пероксидации в организме, в том числе в семенниках, что проявляется в снижении количества и подвижности сперматозоидов.
2. Аргонированная вода стимулирует анти-оксидантные ресурсы семенников животных-опухоленосителей, в результате чего снижается
интенсивность процессов ПОЛ и увеличиваются количество и активность сперматозоидов.
3. Выявлена отрицательная корреляционная взаимосвязь между параметрами свободнорадикальной активности, такими как максимальная интенсивность хемилюминесценции и уровень продуктов ПОЛ (ДК, ТК и МДА), и количеством и подвижностью половых клеток. Высокая степень корреляции доказывает роль окислительного стресса в нарушении сперматогенеза.
4. Семенники являются более чувствительными к изменению свободнорадикальной активности, чем плазма крови.
Таким образом, аргонированная вода изменяет интенсивность свободнорадикальных процессов в организме интактных животных и модулирует их при патологическом состоянии, вызывая разные ответы, а именно: у интактных животных усиливает свободнорадикальную активность и угнетает сперматогенез, а у животных-опухоле-носителей увеличивает антиоксидантные ресурсы и стимулирует сперматогенез.
Список литературы
1. Козлов Ю.П. Перекисное окисление липидов и проблема канцерогенеза // Актуальные вопросы современной онкологии. М.: МГУ, 1979. Т. 5. С. 72-83.
2. Sanocka D., Kurpisz M. Reactive oxygen species and sperm cells // Reproductive Biology and Endocrinology. 2004. V. 2. № 12. P. 12-26.
3. Aitken R.J., Gordon E., Harkiss D. et al. Relative impact of oxidative stress on the functional competence and genomic integrity of human spermatozoa // Biol. Reprod. 1998. V. 59. P. 1037-1046.
4. Громенко Д.С. Применение наукоемких технологий для оценки фертильности мужчин // Вестник новых медицинских технологий. 2008. Т. 15. № 4. С. 118-120.
5. Villegas J., Schulz M., Soto L. et al. Influence of reactive oxygen species produced by activated leuko-
cytes at the level of apoptosis in mature human spermatozoa // Fertil. Steril. 2005. V. 83. P. 808-810.
6. Loft S., Kold-Jensen T., Hjollund N.H. et al. Oxidative DNA damage in human sperm influences time to pregnancy // Hum. Reprod. 2003. V. 18. № 6. P. 12651272.
7. Селивановский Д.А., Дьяченко А.И., Воейков В.Л. и др. Физико-химический механизм действия аргона при дыхании // Альманах клинической медицины. 2006. № 12. С. 158.
8. Шулагин Ю.А., Дьяченко А.И., Павлов Б.Н. Влияние аргона на потребление кислорода человеком при физической нагрузке в условиях гипоксии // Физиология человека. 2001. Т. 27. № 1. С. 95-101.
9. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной хемилюминис-ценции для оценки свободнорадикальных реакций в биологических субстратах // Межвуз. сб. биохимии и биофизики микроорганизмов. Горький, 1983. С. 179— 183.
10. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. Методические рекомендации. СПб.: Фолиант, 2000. 104 с.
11. Nishikimi M., Roo A., Xagi K., The occurrence of superoxide anion in the reactions of reduced phena-zine metasulfate and molecular oxygen // Biochem. Bio-phys. res. Commun. 1972. V. 146. № 2. Р. 849-854.
12. Дубинина Е.Е. Биологическая роль суперок-сидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма // Успехи современной биологии. 1989. Т. 108. № 4. С. 3-18.
13. Aebi H. Methoden der erymatiechen analyses // Biochemistry. 1970. V. 2. P. 636-647.
14. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токорева В.Е. Метод определения активности ката-лазы // Лабораторное дело. 1988. № 1. С. 16-19.
15. Чевари С. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте // Лабораторное дело. 1991. № 10. С. 9-13.
16. Артифексов С.Б. Морфо-функциональное исследование половых клеток самцов белых крыс при гипотермии. Автореферат дис. ... канд. мед. наук. Челябинск, 1981. 26 с.
THE RELATIONSHIP BETWEEN FREE RADICAL PROCESSES AND MORPHOFUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF LABORATORY ANIMAL SPERM UNDER
THE ACTION OF ARGONATED WATER
Ya.S. Novikova, T.G. Shcherbatyuk, T.E. Potemina, E.S. Klintsova, V.V. Chernov
The experiments were performed on 24 male outbred albino nonlinear rats. Neoplasia model was created by transplantation of the Pliss lymphosarcoma strain. It has been found that argonated water enhances free radical activity and inhibits spermatogenesis of intact animals, while in tumor-bearing animals it increases antioxidant resources and stimulates spermatogenesis. A high correlation has been revealed between the quantity and mobility of sperm and the parameters of free radical activity.
Keywords: spermatogenesis, argonated water, Pliss lymphosarcoma, lipid peroxidation.
