CC BY
89
УДК 616.36-089.87:616.36-072.7
Х.П. Монголов, А.Н. Плеханов
взаимосвязь лпоптозл и регенерации печени при печеночной недостаточности после частичной гепатэктомии в эксперименте
ГП РБ «Бурят-Фармация» (Улан-Удэ) Бурятский филиал НЦРВХ СО РАМН (Улан-Удэ)
В статье указаны механизмы взаимодействия регенераторных и апоптотических процессов печеночных клеток при недостаточности, печени у экспериментальных животных. Доказано, что апоптоз, происходящий после резекции печени, является, одним, из механизмов гибели гепатоцитов при развитии, печеночной недостаточности.
Ключевые слова: печень, апоптоз, регенерация, эксперимент
iNTERRELATioN oF ApopTOSiS AND HEpATic REGENERATioN AT HEpATic iNSuFFiciENcY After pARTIAL HEpATEOTOMYA iN ExpERIMENT
H.P. Mongolov, A.N. Plekhanov
GP RB «Buryat-Pharmacy» (Ulan-Ude) Buryat Branch SCRRS SB RAMS (Ulan-Ude)
The article specifies the mechanism, of interaction of regenerative and apoptosis processes of hepatic cells at hepatic insufficiency in experimental animals. It is proved, that apoptosis, occurring after resection of a liver, is one of mechanisms of destruction, of hepatocytes at development of hepatic insufficiency.
Key words: liver, apoptosis, regeneration, experiment
Одним из свойств печени является ее способность регулировать свой собственный размер и рост [1, 3, 4]. Это свойство вытекает из основной роли печени в метаболической регуляции. Для реализации этих функций ткань печени отвечает на воздействие извне организма и на сигналы, и на метаболические команды, переданные посредством гормонов, цитокинов, факторов роста и нервной регуляции [5, 6].
Функциональный дефицит, обусловленный уменьшением количества ткани печени или гибелью клеток, вызывает пролиферативные процессы, которые в конечном счете приводят к восстановлению печеночных функций и архитектоники [2]. Это достигается только в условиях тонкой координации среди гепатоцитов, различных типов непаренхиматозных клеток и компонентов внеклеточного матрикса. Вместе эти элементы составляют то, что было названо Roijkind и GreenweП микроэкологией печени.
В эксперименте и клинике печень отвечает как на недостаточность, так и на избыточность ее объема. Свидетельством тому служит тот факт, что печень, пересаженная реципиенту в малом объеме, регенерирует, достигая оптимального для данного индивидуума объема [7]. Избыточное количество ткани печени вызывает адаптацию массы и функции органа. Печень, имеющая избыточный для реципиента объем, не будет увеличиваться и может даже уменьшиться в размерах вследствие апоптоза гепатоцитов.
Термин «апоптоз» (apoptosis) в переносном смысле означает «падение листьев». Это процесс, в результате которого поврежденные или старею-
щие клетки умирают [25]. Апоптоз был известен еще в прошлых десятилетиях, но его истинная значимость в физиологии и патологии человека стала широко признана только в последние годы [12].
Целью исследования явилось изучение патогенетических особенностей регенерации и апоптоза печени после ее обширной резекции в условиях печеночной недостаточности.
материал и методы
Эксперимент проведен на 223 крысах самцах породы «Вистар» с массой животных 200 — 250 г. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующего нормативам ГОСТа. Острую печеночную недостаточность индуцировали резекцией печени в объеме 70 — 90 %.
Исследовали морфостуктуру печени с помощью световой микроскопии и иммуноморфоло-гического исследования. Для исследования пролиферативной активности использовали готовое к применению моноклональное антитело Ki 67, клон ММ1 (Novocastra Laboratories Ltd.). Для исследования апоптоза — поликлональное антитело Anti-Bax (BD Biosciences) в разведении 1 : 1000.
результаты
При гистологическом исследовании структуры печени отмечали повреждения гепатоцитов: участки дискомплексации балочных структур и очаги некрозов. На 2 сутки определялись фокальные некрозы (гибель отдельных групп гепатоцитов внутри долек). На 5—11 сутки потеря клеточных элементов прогрессировала за счет присоедине-
ния ступенчатых некрозов (гибели гепатоцитов вокруг портальных трактов). В ходе эксперимента отмечались дистрофии гепатоцитов, расстройства кровообращения в виде кровенаполнения, как портальных трактов, так и собирательных вен.
Во все сроки на светооптическом уровне четко определялись апоптотические тельца. Были установлены признаки ишемического некроза гепатоцитов по линии резекции, полнокровие си-нусоидов. Наиболее выраженные изменения происходили при резекции 90 % объема печени.
Процесс апоптоза имеет свои характерные морфологические особенности. Так, клетки, подвергающиеся апоптозу, сокращаются и отсоединяются от общего пула клеток. При этом хроматин уплотняется вокруг мембраны ядра. В конечном счете, клетка распадается, формируются многократные мембранносвязанные апоптотические тела, которые быстро фагоцитируются [3].
Поскольку в основе апоптоза лежит физиологический механизм, который способствует «взаимозамене» клетки, некоторая часть клеток в печени постоянно подвергается этому процессу [3]. Его особенностью является то, что он редко верифицируется при обычных гистологических исследованиях. Так, эпителиальные клетки желчи редко визуализируются из-за их небольшого размера [21]. Ранее считалось, что любая гибель печеночной клетки — это некроз, но теперь очевидно ясно, что к гибели печеночной клетки приводит и другой патофизиологический процесс — апоптоз [17]. Основным морфологическим отличием некроза от апоптоза является то, что при некрозе разрушается мембрана ядра, а при апоптозе целостность мембраны сохраняется. Таким образом, повышение в сыворотке крови аминотрансфераз, как одного из факторов повреждения печени может отражать усиление апоптоза, так же как и некроза в печени.
Для верификации апоптоза в печени существует ряд методов. Самый простой из них заключается в подсчете апоптотических тел при морфологическом исследовании с окраской гематоксилином и эозином [21]. При этом эти тела находятся несколько обособленно от соседних клеток. Хотя их обнаружение утомительно, субъективно и трудоемко, выявление апоптотических тел таким методом остается допустимым для идентификации апоптоза в тканях [2].
Значимость этого сложного процесса при болезнях печени достаточно существенна. Так, ускоренный апоптоз может закончиться гибелью гепатоци-тов, что приводит к нарушению функции печеночной ткани и ее атрофии. Принимая во внимание тот факт, что торможение апоптоза, стимулируют онкогенез,
большинство болезней печени характеризуются чрезмерным торможением апоптоза [23].
Понимание роли апоптоза в патофизиологии болезней печени очень важно для клинициста. Так ускоренный апоптоз отмечается при алкогольном и вирусном гепатите (например, гепатит B, C и дельта), холестазе (например, первичный билиарный цирроз печени, первичный склерозирующий холангит), аутоиммунных заболеваниях (например, автоим-мунный гепатит), при использовании наркотиков и отравлениях токсинами, а также метаболических нарушениях (болезнь Вильсона-Коновалова) и гипоксии. Торможение апоптоза наблюдается при гепатоцеллюлярном и холангиоцеллюлярном раке.
Параллельно с гибелью гепатоцитов происходила регенерация печеночной паренхимы. При этом отмечалось увеличение массы печени к 11 суткам эксперимента, однако достоверных различий нами не отмечено. Более выраженные изменения были отмечены в изменении массы селезенки в ходе эксперимента. К 11 суткам ее вес увеличивался на 107 % по сравнению с исходной на 2 сутки. Имелись достоверные различия в приросте ее массы по суткам эксперимента.
Митотическая активность ядер гепатоцитов изменялась в различные сутки эксперимента. Митотическая активность ядер гепатоцитов изменялась в различные сутки эксперимента. В таблице 1 представлено количество митозов на 100 клеток в ходе эксперимента.
Митотическая активность достоверно увеличивалась между 2 сутками и 5 сутками после резекции печени. Митотический индекс на 2 сутки составил 0,375 ± 0,085 (ДИ 0,103 — 0,646) на 5 сутки
- 0,825 ± 0,025 (ДИ 0,745-0,904) (рр = 0,0181-3). Достоверные отличия митотического индекса были также отмечены между 3 и 5 сутками эксперимента. Так на 3 сутки МИ составил 0,625 ± 0,025 (ДИ
0,545-0,704), что имело различия с 5 сутками после резекции печени (рр = 0,0162-3).
При выполнении иммуноморфологического исследования отмечен дисбаланс между пролиферативной активностью гепатоцитов и их апоптозом.
При световой микроскопии нами наблюдались апоптотические тельца (рис. 1). C целью определения выраженности апоптоза в ходе эксперимента нами проведено иммуноморфологическое исследование. При этом были использованы моноклональное антитело — проапоптотический фактор Bax (ингибитор bcl-2).
При подсчете клеток отмечен дисбаланс между пролиферативной активностью гепатоцитов и их апоптозом (табл. 2).
Таблица 1
Митотическая активность гепатоцитов в ходе эксперимента
Сутки эксперимента Митотический индекс Достоверность различий
2 сутки 0,375 ± 0,085 Pf = 0,06i-2
3 сутки 0,625 ± 0,025 Pf = 0,0162-3
5 сутки 0,825 ± 0,025 Pf = 0,018i-3
рис. 1. Bax в цитоплазме гепатоцитов, х 630. DAB с докра-ской гематоксилином.
Так, на 2 сутки Ki-67 составлял 26,5 ± 2,5 клетки (ДИ 18,4 — 34,5), на 5 сутки — 37,7 ± 2,4 клетки (ДИ 29,9 — 45,5). Различия показателя Ki-67 достоверны (рР = 0,02). Кроме того, имелись достоверные различия этого показателя между 2, 5 сутками по отношению к норме (рР = 0,003 и рр = 0,0004 соответственно). Показатели Bax на 2 сутки составили 43,7 ± 1,4 клетки (ДИ 38,9-48,5) на 5-е 40,7 ± 1,2 (ДИ 36,7-44,7). Различия не статистически не достоверны (рр = 0,16). Однако имелись достоверные различия этого показателя между 2, 5 сутками эксперимента по отношению к норме (рр = 0,00006 и рР = 0,00008 соответственно). После обширной резекции печени отмечалось прогрессивное увеличение пролиферативной активности гепатоцитов на 2 и 5 сутки эксперимента. Кроме того, резекция печени стимулирует проапоптотический фактор. На 2 сутки эксперимента апоптоз преобладал над пролиферацией (рР = 0,02).
Аналогичные изменения были отмечены и на 5 сутки, однако пролиферативная активность на 5 сутки увеличивалась, а достоверные различия Bax между 2 и 5 сутками отсутствовали, в связи с чем различия соотношения Ki-67/Bax в эти сроки были недостоверны (рР = 0,3).
Наиболее выраженным примером регенерации печени является модель ее вырастания после резекции [6, 7, 9, 10, 16]. Отмечено, что после 60-70 % резекции печени имеет место компенсаторная регенерация печени с образованием новых клеточных элементов путем митотического деления оставшихся [7]. То есть регенерация печени — это процесс компенсаторного роста, в котором
резецированная доля не вырастает, а происходит увеличение массы оставшейся доли как следствие пролиферации клеток.
Уровень пролиферативной активности гепато-цитов в определенной степени зависит от объема резекции: чем большая часть печени удалена во время операции, тем выше пролиферативный пул клеток. Однако хирургам-гепатологам хорошо известен тот предел резекции массы паренхимы печени, превышение которого приводит к необратимым изменениям функционального состояния органа и затем гибели организма. В условиях 80 — 95 % резекции массы печени наблюдается десинхронизация вступления клеток в митоз, а при удалении 90 % массы органа большая часть гепатоцитов оставшейся части печени уже неспособна синтезировать ДНК и делиться митозом [18].
Существующие факторы, регулирующие процесс регенерации, в настоящее время до конца остаются неясными. S.P. Tzung et а1. (1997) доказали, что процесс апоптоза — это регулируемый процесс. На примере модели резекции печени они показали, что модуляция апоптоза очень важна в восстановлении как массы печени, так и ее функции [24]. Модуляция генов Ьс1-2, Ьс1-х, и Ьах были идентифицированы в процессе регенерации [13]. При этом было отмечено, что противоапоптотический фактор Ьс1-х и Ьс1-2 достигают максимума к 6 часам после резекции печени у экспериментальных животных, в то время как проапоптотический фактор Ьах достигают максимума значительно позже [13]. Дальнейшие же исследования показали, что фактор некроза опухоли включенный в процесс регенерации печени, может задерживать апоптоз гепатоцитов с помощью определенных внутриклеточных связей [22].
Кроме того, индукция гена NFeB может использоваться для предотвращения апоптоза, что и позволяет сохранить развитие печеночной клетки в процессе регенерации после резекции печени [11]. Таким образом, и быстрое увеличение печени, и апоптоз регулируются в процессе регенерации. Торможение же апоптоза способствует «переросту» ткани и усиленной регенерации в момент первичного ответа на повреждение, а его стимуляция позволяет удалить «лишние» клетки в ходе последующего процесса перемоделирования ткани.
Известно, что после 60 — 70 % резекции печени оставшаяся часть испытывает значительный энергетический недостаток, который сохраняется в течение 1-х суток. В дальнейшем происходит повышение энергетического статуса и приближение его
Таблица 2
Соотношение активности пролиферации и апоптоза
Сутки Ki-67 Bax
2 сутки 26,5 ± 2,5 клеток/1000* 43,7 ± 1,4 кпетки/1000
5 сутки 37,7 ± 2,4 клетки/1000** 40,7 ± 1,2 кпеток/1000**
Норма 6,5 ±0,6 клеток/1000*** 10,0 ± 0,9 клеток/1000***
примечание: * - р - достоверные различия между 2 и 5 сутками, нормой (рр < 0,05).
: - между 2 сутками и нормой, ** - между 5 сутками и
к исходным величинам через 5-7 суток. Изменение энергетического состояния оставшейся части печени коррелирует во времени с митотической активностью гепатоцитов, которая отсутствует в первые сутки и проявляется на 2 — 3 сутки после операции [19]. После 80 — 85 % резекции печени отмечается удлинение периода между моментом операции и максимальной митотической активностью гепатоцитов [1].
Говоря об оценке регенеративной активности с современных позиций, следует иметь в виду критерии, обнаруживаемые при микроскопии, электронной микроскопии, авторадиографии, гистохимических исследованиях.
Гомеостаз ткани печени зависит и от поддержания баланса между быстрым увеличением клетки и апоптозом. Разрушение гомеостатических механизмов равновесия между быстрым увеличением клетки и апоптозом может способствовать канцерогенному процессу [15]. В некоторых работах показано, что опухолевые клетки проявляются, как повышенной чувствительностью, так и сопротивлением процессу апоптоза, а эта изменчивость может стимулировать рост опухоли. Изменения регуляторов апоптоза, в частности гена Bcl-2 было отмечено как в гепатоцеллюлярном, так и холан-гиоцеллюлярном раке [5,8]. Многие из факторов, связанных с карциногенезом в печени, типа цито-кинов, факторов роста, окиси азота также могут смоделировать апоптоз. Так, например, активация TGF-I-фактора приводит к апоптозу и дисрегуляции в печени в течение экспериментального гепатокар-циногенеза [23]. Ряд химиотерапевтических препаратов, используемых в онкологической практике, могут стимулировать апоптоз в клетках опухоли. В этой связи терапевтические факторы, которые стимулируют апоптоз в злокачественных клетках, показали свою значимость в лечении рака печени.
Вирусный гепатит развивается в результате инфекционного поражения печени. Увеличенный апоптоз в печени пациентов с хроническим гепатитом B и C уже был описан в литературе [14]. Индукция апоптоза в инфицированных клетках может быть ведущим механизмом защиты, направленным на ограничение вирусного повреждения клеток печени и устранение инфицированных.
выводы
Таким образом, апоптоз, происходящий после резекции печени, является одним из механизмов гибели гепатоцитов при развитии печеночной недостаточности. Сложные механизмы регенеративных процессов в печени, в результате которых она самостоятельно поддерживает баланс между стимуляторами и ингибиторами указывают на необходимость контроля и управления за происходящими в ней процессами, что позволит улучшить результаты хирургического лечения, особенно, при резекции обширных объемных образований печени.
литература
1. Романова Л.К. Грушетская О.О. // Материалы симпозиума: способы регенерации и клеточного деления. - М., 1979. - C. 54-58.
2. Ashkenazi A., Dixit V.M. // Science. - 1998. -Vol. 281. - P. 1305-1308.
3. Bursch W., Paffe S., Putz B. // Carcinogenesis. - 1990. - № 11. - P. 847-853.
4. Chari R.S., Baker M.E., Sue S.R. // Liver Transpl. Surg. - 1996. - Vol. 2. - № 3. - Р. 233-234.
5. Charlotte F., L'Hermine A., Martin N. // Am. J. Pathol. - 1994. - Vol. 144. - P. 460-465.
6. Chen M.F., Hwang T.L. Hung C.F. // Ann. Surg. - 1991. - Vol. 213, N 3. - Р. 227-229.
7. De Jong K.P., Brouwers M.A., Huls G.A., Dam A. // Anal. Quant Cytol. Histol. - 1998. -Vol. 20, N 1. -Р. 59-68.
8. Harnois D.M., Que F.G., Celli A. // Hepatol-ogy. - 1997. - Vol. 26. - P. 884-890.
9. Hashimoto M., Kothary P.C., Eckhauser F.E. // Gastroenterol. Hepatol. - 1998. - Vol. 13. - N 12.
- Р. 1259-1265.
10. Jansen P.L., Chamuleau R.A., Van Leeu-wen D.J. // Scand J. Gastroenterol. - 1990. - Vol. 25, N 2. - Р. 112-118.
11. Jimuro Y., Nishiura T., Hellerbrand C. // J. Clin. Invest. - 1998. - Vol. 101. - P. 802-811.
12. Kerr J.F. // J. Pathol. - 1971. - Vol. 105. -P. 13-20.
13. Kren B.T., Trembley J.H., Krajewski S. // Cell Growth Differ. - 1996. - N 7. - P. 1633-1642.
14. Lau J.Y., Xie X., Lai M.M. // Semin Liver Dis.
- 1998. - Vol. 18. - P. 169-176.
15. Ledda-Columbano G.M., Coni P., Simbula G. // Environ Health Perspect. - 1993. - Vol. 101. -P. 163-168.
16. MacIntosh E.L., Gauthier T., Pettigrew N.M. // Hepatology. - 1993. - Vol. 17, N 2. - P. 307-309.
17. Patel T., Gores G.J. // Hepatology. - 1995. -Vol. 21. - P. 1725-1741.
18. Rabes H.M., Wirsching R., Tuczek H.V. // Ceel Tissue Kinet. - 1979. - N 6. - P. 123-127.
19. Sato K., Tanaka M., Tanikawa K. // Hepatogas-troenterology. - 1995. - Vol. 42, N 6. - P. 961 -965.
20. Sato Y., Tsukada K., Hatakeyama K. // Surg. Today. - 1999. - Vol. 29, N 1. - Р. 1-9.
21. Schulte-Hermann R., Bursch W., Kraupp-Grasl B. // Environ Health Perspect. - 1993. - Vol. 101. -P. 87-90.
22. Takehara T., Hayashi N., Mita E. // Hepatology. - 1998. - Vol. 27. - P. 1643-1651.
23. Thorgeirsson S.S., Teramoto T., Factor V.M. // Semin. Liver Dis. - 1998. - Vol. 18. - P. 115-122.
24. Tzung S.P., Fausto N., Hockenbery D.M. // Am. J. Pathol. - 1997. - Vol. 105. - P. 1985-1995.
25. Wyllie A.H., Kerr J.F., Currie A.H. // Int. Rev. Cytol. - 1980. - Vol. 68. - P. 251 -306.
Сведения об авторах:
Монголов Ханхай Пурбоевич - канд.фарм.наук, Генеральный директор ГП РБ «Бурят-Фармация». Тел. 8 (3012) 43-90-56. Плеханов Александр Николаевич - д.м.н., профессор, главный хирург МЗ РБ, г Улан-Удэ, Дом Правительства. Тел. 8(3012) 21-49-20
