CC BY
67
УДК 543.554.2:547.962.4 Проректор по инновации и образовательным технологиям Х.И. Тешаев,
(Технологический ун-т Таджикистана) , тел. (99237) 234-79-90
науч. сотрудник С.Р. Усманова, соискатель О. Шамсоро, профессор З.К. Мухидинов
(Институт химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан), тел. (992) 918-723-24-78
Взаимодействие низкометилированных пектинов с концентратом белков молочной сыворотки
Методом потенциометрического титрования растворимых комплексов продемонстрирован процесс образования комплекса между концентратом белков молочной сыворотки и НМ-пектином: показано, что образованию комплекса соответствует изгиб на кривых титрования, рНс; рНс не зависит от соотношения биополимеров; ионная сила уменьшает рНс и способствует образованию стабильных комплексов; при рН>р1 лактоглобулина взаимодействие происходит за счет отрицательного заряда сегментов цепи НМ-пектина и положительных зарядов локальных очажков молекул протеина.
Potentiometric titration method was used to study quality complex formation between low methylated pectin and proteins concentrated from whey. It’s shown that at рН>1ЕР of the lactoglobulin the interaction occurs between negatively charged chains of LM-pectin and positively charged patches of polypeptide chains. The biopolymers ratio had no significant effect on the initial pH of soluble complex formation (pHc); addition of sodium chloride decreased pHc and pK0 of complexes, which linked to electrostatic nature of complex formation between LM-pectin and whey proteins.
Ключевые слова: комплексообразование, НМ-пектин, концентрат белков молочной сыворотки, потенциометрическое титрование.
Белки и полисахариды играют ключевую роль в формировании структуры и стабилизации пищевой системы. В пищевых продуктах белки используются в качестве эмульгаторов, а полисахариды - в качестве стабилизаторов. Смеси обоих полимеров могут быть обнаружены в ингредиентах пищевых коллоидов широкого спектра, начиная с майонеза и заканчивая мороженным. По данным Дик-кенсона [1], устойчивость и текстура пищевых коллоидов, содержащих смеси биополимеров, зависят не только от функциональных свойств индивидуальных ингредиентов, но и от природы и силы взаимодействия протеин - полисахарид.
Вопросам комплексообразования в системе протеин-полисахарид посвящены многочисленные исследования [1-9]. Комплексы протеин - полисахарид могут быть растворимыми или коацерватами (явление, приводящее
© Тешаев Х.И., Усманова С.Р., Шамсоро О., Мухидинов З.К., 2012
к агрегированному разделению фаз из-за термодинамической несовместимости биополимеров, когда они несут одинаковый заряд). На природу этих комплексов влияют как энтропийные (структура и молекулярный вес), так и энтальпийные (соотношение биополимеров, природа и плотность заряда на них) факторы. Количественная оценка параметров связывания в данной системе чрезвычайно сложна, так как оба полимера имеют гетерогенную структуру. Поэтому данные по количественной оценке связывания протеин - полисахарид в литературе незначительны [9]. Указанные комплексы, или коацерваты, широко применяются в пищевой промышленности и биотехнологии, в частности как заменители жира [3], при выделении и концентрировании белков [5,8] и инкапсулировании лекарств [6]. Пектин представляет собой полимерную цепь, состоящую из звеньев галактуроновой кислоты, рКо которой колеблется от 2,9 до 3,3 [10].
В данной работе исследуется процесс образования комплексов низкометилированно-го пектина и концентрата белков молочной сыворотки (КБМС) c помощью метода потенциометрического титрования. КБМС был получен из творожной сыворотки методом ультрафильтрации [12]. Состав и степень чистоты КБМС анализировали на капиллярном электрофорезе (Agilent HPCE G1600AX), с использованием компьютерной программы Agilent ChemStation Software B.02.01 SR2. Для разделения лактоглобулинов молочной сыворотки (МС) применяли кварцевый капилляр (uSIL-WAX) размером 95см х 50 мкм с эффективной длиной 70,0 ем. В качестве контроля использовали стандартные белки фирмы Sigma (в-лактоглобулин B 18,0 kDa, альбумин 66,0 kDa и а-лактоальбумин 14,0 kDa). Растворы белков готовили в 5 мМ фосфатном буфере при рН = 2,9 с добавлением 1 М мочевины. Все растворы перед введением в капилляр фильтровались через мембранный фильтр с размерами пор 0,45 мкм. В качестве ведущего электролита использовали 10 mM фосфатный буфер с pH = 2,9. Количественный состав КБМС, полученный данным методом, представлял: 37,35 % P-Lg A; 52,9 % P-Lg B; и 9,7 % a-Lg.
Найденные значения рКо основных и концевых карбоксильных и имидазольных групп гистидинового остатка стандартного образца в-лактоглобулина (P-Lg) представлены в предыдущей работе [13] и хорошо согласуются с известными данными [14].
С помощью потенциометрического титрования можно наблюдать за процессом комплексообразования путем титрования ки-
слотных и основных групп протеина. Предполагается, что отрицательно заряженный НМ-пектин взаимодействует с P-Lg посредством карбоксильных, амино-, имидазольных- и гуа-ниновых групп в пептидной цепи белка. Для понимания механизма процесса комплексооб-разования двух полиэлектролитов в растворе необходимо создать модель полиионов в растворе [15]. Если достаточное количество нейтрального электролита, как хлорид натрия, добавить в раствор полиэлектролита, структура полииона будет окружена цилиндрической ионной сферой, и полимерная цепь приобретет более или менее спиральную конформацию.
С целью изучения взаимодействия сы-в о роточного белка молока с пектином мы использовали КБМС и НМ-пектин из подсолнечника (НМПП 2М 85-2, ГК 68,8; СЭ 45,2; Mw 142,4) при двух значениях pH 3,75 и 5,6 в растворе ацетатного буфера. Соответствующее количество раствора НМ-пектина (0,607 мг/мл) было добавлено к 5 мл раствора КБМС, содержащего 0,35 мг/мл белка, при температуре 24 оС для получения весового соотношения протеин/пектин 1:1, 2:1, 4:1 и 6:1. Титрование проводили на рН-метре 827 pH lab. Metrohom, электроды калибровались с помощью стандартных буферных растворов (Metrahom рН 4 ,00; 7,00; и 9,00). В кислом растворе pH (3,75), в системе протеин/пектин наблюдалось разделение фаз. Растворимая и нерастворимая фазы были разделены центрифугированием при 4500 g в течение 30 мин. Обе фазы были исследованы на содержание свободных фракций протеина и пектина, а также степень набухания нерастворимого комплекса. Полу-
ченные результаты приведены в таблице
Т а б л и ц а
Содержание фракций протеина и пектина в растворимых и нерастворимых комплексах, степень набухания
нерастворимого комплекса
Соотношение КБМС: пектин, моль/моль Нерастворимая фаза Растворимая фаза
Выход, % Фракция протеина, % Фракция пектина, % Степень набухания, Sq Фракция протеина, % Фракция пектина, %
0.43 18,9 3,30 97,33 7.0 86,70 2,67
0.86 36,9 9,92 95,04 3.0 90,08 4,96
1.73 23,1 18,05 83,26 3.0 81,95 16,74
2.60 21,4 24,84 78,53 4.0 75,16 21,47
Из таблицы следует, что с увеличением мольной доли протеина выход нерастворимого комплекса проходит через максимум. Максимальный выход комплекса обнаружен при соотношении КБМС/пектин 0,86. При низком соотношении КБМС/пектин комплексы имеют
высокую степень набухания, в то время как с увеличением содержания протеина в комплексе степень их набухания уменьшается, при дальнейшем увеличении содержания белка состав комплекса не изменяется. Если в нерастворимой части комплекса преобладают пек-
тиновые макромолекулы (78-97 %), то растворимая фракция содержит от 75 до 90 % протеина. Поскольку рК0 ПП находится ниже этой точки, то диссоциация карбоксильных групп подавляется положительно заряженными группами белков, что приводит к агрегатив-ному разделению пектина.
Процесс формирования нерастворимого комплекса КБМС с различными пектинами нами изучался методом турбидиметрического титрования как описано в работе [16]. Поэтому в данной работе мы приводим только результаты исследования растворимой части комплексов путем титрования кислых и основных групп протеина растворами щёлочи или кисло-
ты. Полученные супернатанты после осаждения нерастворимой части титровались 0,1 н №ОН (рис. 1).
Как видно из рис. 1, при равном соотношении КБМС/НМПП количество титруемых групп уменьшается, и с увеличением доли белков кривые вновь смещаются в сторону увеличения и приближаются к кривым КБМС. Авторами [11] было показано, что pH растворимого комплекса соответствует начальной точке перегиба кривых титрования и обозначен как рНс. Дальнейшее увеличение количества титранта (т.е. рН смеси) приводит к фазовому разделению в системе.
У(№ОН), мл
Рис. 1. Кривые потенциометрического титрования карбоксильных групп протеинов МС, P-Lg и комплекса КБМС с пектином
При увеличении соотношения КБМС/НМПП pHc соответствовал значению 5,3±0,1, а количество титранта, требующегося для нейтрализации свободных карбоксильных групп полученных комплексов, при этом возросло от 1,85 до 2,9 мл.
При pH 5,6 рН >PI (изоэлектрической точки) лактоглобулинов было изучено ком-плексообразование КБМС с НМПП в водном растворе и в растворе, содержащем NaCl. В дальнейшем проводили потенциометрическое и кондуктометрическое титрование рас-
творимой фракции, используя раствор NaOH для кислотных и HCl - для основных групп.
В результате в пределах исследованных экспериментальных условий не обнаружено фазового разделения как при pH 3,75. При смешивании двух полимеров образовывалась либо опаловая однофазовая система, либо чистая жидкая фаза с небольшим количеством осадка, зависящего от общей концентрации биополимера и их соотношения (рис. 2).
4 5 6 7 8 9 10 pH 11
Рис. 2. Кривые титрования КБМС и КБМС/НМПП комплекса с 0,1N NaOH без добавления электролита при I = 0,01 M, pHc = 6,28
Из рис. 2 видно, что рНс, независимо от соотношения биополимеров, находится в области рН 6,28. Такая закономерность в образовании была обнаружена в работе [17] при изучении процесса компексообразования в системе чистого P-Lg с НМ- и ВМ-пектинами. При pH 6,5 некоторые свободные карбоксильные группы пектина и протеина могут быть ионизированы или образовывать комплекс, на нейтрализацию которого требуется больше титранта, чем при pH 3,5. Данный факт свидетельствует о том, что пектин и протеин в первом случае существуют в свободной форме (раствор супернатанта), а во втором случае они формируют комплекс. На нейтрализацию комплекса с низким соотношением биополимеров расходуется меньше титранта, чем с большим. Известно [18,19], что комплексооб-разование между протеином и пектином происходит в 2 стадии: вначале образуется внутримолекулярный комплекс, где на молекулу пектина приходится до 8 молекул протеина, и
его размер сопоставим с размером молекулы пектина. На второй стадии образуется межмо-лекулярный комплекс (интерполиэлектролит-ный), через агрегацию первого.
При титровании основных (имидазоль-ных) групп КБМС/НМПП раствором 0,1 M HCl комплекс не образовывался, так как точка перегиба на кривых титрования (рис. 3) отсутствовала. Поэтому для обнаружения рНс предварительно рН растворов в смеси биополимеров установливали до значения 7,5 раствором NaOH, затем смесь титровали раствором HCl до значения 4,5, близкого к значению рКа пектина.
В качестве примера приведены кривые титрования аминогрупп (рис. 4) для образцов ß-Lg, КБМС и их комплексов с НМПП. Как видно, рНс на кривых потенциометрического титрования комплекса чистого ß-Lg с НМПП отличается от рНс кривых титрования КБМС с пектином.
3.00 2,50
2.00
Д 1,50
0
1 1,00
0,50 0,00
4 4,5 5 5,5 6 6,5 pH 7
Рис. 3. Кривые титрования основных (имидазольных) групп КБМС/НМПП комплексов с 0,1M HCl.
-КБМС КБМС:НМПП (8) КБМС:НМПП (16) КБМС:НМПП (32)
:Н :Н С: С: ММ ББ КК 1 _ ПП (48)
О
X
3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 pH 8,00
Рис. 4. Кривые титрования основных групп ß-Lg, КБМС и комплекса КБМС/НМПП (32) с 0,1M HCl
Данные рис. 4 указывают на то, что ком-плексообразование НМПП с P-Lg и КБМС отличается и происходит при различных рНс, хотя кривые титрования исходных образцов одинаковые. Такое отличие в профилях кривых может быть из-за вовлечения альбумина и лактоальбумина (а^а) в комплекс при использовании КБМС.
Для того чтобы оценить роль электростатического взаимодействия и водородных связей на рНс, было изучено влияние низкомолекулярного электролита на процесс ком-плексообразования путем добавления 100 тМ
хлорида натрия к водному раствору биополимера. Кривые титрования основных групп комплекса КБМС/НМПП (32) с 0,1M HCl, без добавления хлорида натрия (I = 0,07) и с добавлением (I = 0,17) представлены на рис. 5.
6,00
5,00
4,00
S 3,00
и I > 2,00
1,00
0,00
v4 Là.
рНс
4L.
3,00 4,00 5,00 6,00
рн
7,00 8,00
Рис. 5. Кривые титрования основных групп комплекса КБМС/НМПП (32) с 0,1M HCl при I = 0,07 угольники); I = 0,17 (квадраты)
(тре-
Ионная природа хлорида натрия экранирует электростатическое взаимодействие между биополимерами. Добавление электролита ослабляет удержание Н+ ионов комплексом, рНс уменьшается, и это означает, что ионы натрия уменьшают взаимодействие между
10,00
протеином и пектином. Это также подтверждается изменением кажущейся рКа аминокислотных остатков протеина (рис.6) в присутствии хлорида натрия (рК0 8,72) и в отсутствие (рК0 8,44) с высвобождением молекул противоиона и воды.
Lg стд
КБМС/НМПП
Lg стд в NaCl КБМС/НМПП в NaCl
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 а 1,00
Рис. 6. Зависимость рКа от степени ионизации основных групп в комплексе КБМС/НМПП (32) с 0,1 M HCl при I = 0,07 (треугольники); I = 0,17 (квадраты)
Поэтому комплексообразование P-Lg с LMP при pH = 6,5 может быть обнаружено методом потенциометрии, но не турбидимет-рически. Поскольку суммарный заряд P-Lg отрицательный при рН > р I, связывание P-Lg с НМПП при pH > 5,6 соответствует комплек-
сообразованию “на неправильной стороне” р1. Такое явление, т.е. когда оба биополимера отрицательно заряжены, было обнаружено между полисахаридами и белками в ряде других исследований [4, 8, 9, 11, 17].
Вестник,ВГУИТ, № 1, 2012
Электростатистическое взаимодействие приводит к потере гибкости и подвижности полимерной цепы, но при этом реакция протекает за счет выигрыша энтальпии и энтропии, вызванной суммарным отрицательным зарядом биополимеров, при которой создаются стабильные комплексы. В то же время с уменьшением рНс до рНф при рН 3,5 также образуются растворимые комплексы.
Таким образом, с использованием метода потенциометрического титрования растворимых комплексов продемонстрирован процесс образования комплекса между концентратом белков молочной сыворотки и НМ-пектином: показано, что при рН > р1 лактоглобулина взаимодействие происходит за счет отрицательного заряда сегментов цепи НМ-пектина и положительных зарядов локальных очажков молекул протеина. Образованию комплекса соответствует изгиб на кривых титрования (рНс), который не зависит от соотношения биополимеров, а при увеличении ионной силы происходит сдвиг рНс, что способствует образованию стабильных комплексов
ЛИТЕРАТУРА
1. Dickinson E. Emulsion stabilization by polysaccharides and protein-poly saccharide complexes. In S.E. Stephen // Food polysaccharides and their applications. New York: Dekker. 1995. P. 501-515.
2. Tolstoguzov V.B. Protein-
polysaccharide interactions // Food proteins and applications. Ed. Damodaran S., Paraf A. Dekker M. New York. 1997. P. 171-197.
3. Laneuville S.I., Paquin P., Turgeon S.L. Effect of preparation conditions on the characteristics of whey protein-xanthan gum complexes // Food Hydrocoll. 2000. V.14. P.305-314.
4. Mattison K.W., Dubin P.L., Brittain I.J. Complex formation between bovine serum albumin and 4strong polyelectrolytes: Effect of polymer chage density // J. Phys. Chem. B. 1998. V.102 (19). P.3830-3836
5. Dubin P.L., Gao J., Mattison K. Protein purification by selective phase separation with polyelectrolytes // Sep. Purif. Methods. 1994. V. 23. P. 1-16.
6. Burgess, D. J. Complex coacervation: micro-capsule formation. In Macromolecular Complexes in Chemistry and Biology/ Dubin P.L., Bock J., Davis R.M., Schultz D., Thies C., Eds.; Springer-Verlag: Berlin, Germany. 1994. P. 285-325.
7. De Kruif C.G., Tuinier R. Polysaccharide protein interactions // Food Hydrocolloids. 2001.V. 15. P. 555-563.
8. Tolstogulzov V.B. Thermodynamic aspects of biopolymer functionality in biological systems, foods, and beverages // Crit. Rev. Bio-technol. 2002. V. 22. P. 89-174.
9. Girard M., Turgeon S.L., Gauthier S.F. Quantification of the interactions between p-lactoglobulin and pectin through capillary electrophoresis analysis // J. Agric. and Food Chem. 2003.V. 51. P. 6043-6049.
10. Rinaudo M. Comparison between experimental results obtained with hydroxylated polyacids and some theoretical models // Polyelectrolytes. V.1. Selegny ed./ D.Reidel Publ. Co., Dordrecht Holland/ Boston - USA. 1974. P. 157-193.
11. Wen Y., Dubin P.L. Potentiometric studies of the interaction of bovine serum, albumin and poly (dimethyldiallylammonium chloride) // Macromolecules. 1997. V.30. P.7856-7861.
12. Мухидинов, З.К. Концентрат лактоглобулинов из молочной сыворотки и методы их выделения [Текст] / З.К. Мухидинов, А.С. Джонмуродов, Х.И. Тешаев [и др.] // Журн. здрав. Таджикистана. - 2009. - № 5. - С. 44-49.
13. Мухидинов, З.К. Потенциометрическое титрование Р-лактоглобулина молочной сыворотки [Текст] / З.К. Мухидинов, С.Р. Усманова, Х.И. Тешаев [и др.] // ДАН РТ. - Т.54. - № 2. - С.124-128.
14. Creighton T.E. Proteins: Structures und molecular properties. 2nd ed. New York: W.H. Freeman & Co. 1993.
15. Muhiddinov Z.K., Khalikov D.Kh., Asoev M.G., Avloev Ch.Ch.. Some anomalous phenomena in hydrodynamic properties of pectin / Proceeding of the International Seminar on Polymer Science and Technology. Tehran, Iran. 1997. V.1. P.213-220.
16. Мухидинов, З.К., Нерастворимые комплексы белков молочной сыворотки с различными пектинами [Текст] / З.К. Мухидинов, А.Ш. Штанчаев, А.С. Насриддинов [и др.] // ДАН РТ. - 2008. - Т. 51. - № 8. - C. 607-614.
17. Girard M., Turgeon S.L., Gauthier
S.F. Thermodynamic parameters of Plactoglobulin/pectin complexes assessed by isothermal titration calorimetry // J. Agric. Food Chem . 2003. V. 51. P. 4450-4455.
18. Girard M., Turgeon S.L., Gauthier S.F. Interbiopolymer complexing between P-lactoglobulin and low- and high-methylated pectin measured by potentiometric titration and ultrafiltration // Food Hydrocolloids. 2002. V. 16. P.585-591.
19. Tainaka K.I. Study of complex coacervation in low concentration by virial expansion method. I. Salt free systems // J. Phys.Soc. Jpn. 1979. V.46. P. 1899-1906.
