CC BY
10
ФАУНА, ФЛОРА
УДК 581.144.2:581.151
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НИТРАТА И АБК В РЕГУЛЯЦИИ РОСТА БОКОВЫХ КОРНЕЙ ZEA MAYS L.
Е.С. Сидоренко, Е.В. Харитонашвили
(кафедра физиологии растений; e-mail: [email protected])
Скорость роста боковых корней (БК) 7-8-дневных проростков кукурузы зависит от присутствия в среде NO-, NO2 и АБК. Экспозиция в течение 4 ч на NO- в диапазоне концентраций 0,01—1,5 мМ увеличивает относительную скорость роста БК; в этом же диапазоне NO- стимулирует рост БК только при 0,01 мМ. Экзогенная 10-6 М АБК ингибирует рост БК. При совместном воздействии на корни нитрата и АБК либо нитрита и АБК характер ответной ростовой реакции различается. Предлагается гипотетическая схема участия NO в регуляции роста БК.
Ключевые слова: NO-, NO-, АБК, рост боковых корней, Zea mays L.
Изменения морфологии корневой системы в процессе роста и развития являются важной особенностью растений, поскольку такая пластичность позволяет им приспосабливаться к условиям среды, в частности к доступности минеральных элементов в почве [1]. Программы формирования корневой системы находятся в первую очередь под гормональным контролем. Хорошо известно, что основной регулятор морфогенеза корня — ауксин. В последние годы появились новые данные о роли "стрессового" гормона АБК в регуляции нормального развития корня растений [2], причем действие АБК проявляется независимо от ауксина [3].
Факторы минерального питания также выступают регуляторами роста и развития корня. Экспериментально хорошо обосновано, что низкие концентрации NO- в среде оказывают локальное стимулирующее действие на рост корней Arabidopsis, а высокие — приводят к системному ингибированию роста [4]. Ранее нами показано стимулирующее действие низких концентраций NO-3 на рост боковых корней (БК) кукурузы (Zea mays L.) [5].
С помощью молекулярно-генетического анализа установлено, что NO-3 , подобно другим сигнальным молекулам, индуцирует значительные изменения на уровне транскрипции генов [6]. Рецепция и пути передачи нитратного сигнала интенсивно изучаются [7—9]. Выявлены некоторые участники трансдукции NO-3 сигнала, в частности — транскрипционные факторы (ANR1 и NLP7) и белок NRT1.1 (CHL1), обладающий транспортной и рецепторной функциями [7—9]. С высокой степенью вероятности можно ожидать, что сигнальный каскад, запускаемый NO-3 , пересекается с каскадами гормональной природы. Появились сообщения о взаимодействии NO- и АБК
в регуляции роста корня [3, 10]. У растений араби-допсис (Arabidopsis thaliana L.), мутантных по генам биосинтеза АБК (генотипы aba1-1, aba2-3, aba2-4 и aba3-2), стимулирующее действие низких концентраций NO- на рост боковых корней проявлялось слабее по сравнению с диким типом. У нечувствительных к АБК растений (генотипы abi4 и abi5) наблюдали гиперэффект NO- на рост корней. На основании этих результатов было сделано заключение, что определенный уровень эндогенной АБК необходим для формирования ростового ответа БК при стимуляции низкими концентрациями NO- [10]. Высокие концентрации NO- не подавляли рост БК ни у мутантов с нарушениями биосинтеза АБК, ни у нечувствительных к гормону растений [11]. Таким образом, АБК участвовала в развитии ответной реакции корней арабидопсис как на низкие, так и на высокие концентрации нитрата.
После поступления в клетку NO- восстанавливается до NO-, потом до NH + и быстро включается в состав аминокислот. Теоретически продукты восстановления NO- также могут обладать сигнальными свойствами. Однако у двойных мутантов ара-бидопсис по нитратредуктазе nia1nia2 ответ на NO-сохранялся [7, 12], что исключает участие в ростовом ответе продуктов восстановления NO-. Тем не менее установлено, что NO- наряду с NO- влияет на уровень экспрессии многих генов корней арабидоп-сис [13, 14]. Молекулярно-генетический ответ на действие NO- шире, чем на действие NO - : NO2 активирует 384 гена, NO- — только 270; NO- ингибирует 497 генов, NO- — только 341 [13]. 80% индуцируемых NO- генов также проявляют чувствительность к NO2. Среди репрессируемых нитратом генов такой чувствительностью обладала половина. Однако in planta сигнальная роль NO2 не исследовалась.
В нашей работе было проведено сравнительное исследование сигнальной роли нитрата и нитрита для роста боковых корней растений кукурузы (Zea mays L.), а также их взаимодействие с АБК в регуляции роста боковых корней.
Методика исследования
Растения кукурузы (Zea mays L.) сорта Катарина выращивали при интенсивности света 100 Вт/м2, фотопериоде 16/8 ч и температуре 25/18°. Семена проращивали в темноте во влажной камере при 27° двое суток, проростки высаживали в сосуды, предварительно удалив придаточные корни. Были использованы питательные растворы модифицированной смеси Прянишникова 0,5 нормы, источник N — 0,75 мМ (NH4)2SÜ4 (NH++-вариант). рН среды поддерживали на уровне 6,0. В специальной серии опытов растения выращивали на растворе Прянишникова NH++-варианта с добавлением 0,01 мМ KNÜ3 (KNO2), 10-6 М АБК или с добавлением и АБК, и KNO3 (KNO2). Питательный раствор меняли ежедневно. В опытах с нитропруссидом натрия (SNP) проростки выращивали на растворе Прянишникова NH+f-ва-рианта с добавлением 1 или 10 мкМ SNP.
Эксперименты с кратковременным экспонированием: растения NH+f-варианта в возрасте 6 дней, когда появлялись видимые невооруженным глазом зачатки БК, переносили на раствор Прянишникова NH+ -варианта с добавлением KNO3 или KNO2 в концентрации 0,01, 0,1 или 1,5 мМ. Время экспозиции составляло 4 ч. После экспозиции корни промывали дистиллированной водой и проростки переносили на исходный питательный раствор. Измерение длины БК проводили через 24 и 48 ч после экспозиции.
Длину БК определяли с помощью фотографирования общего вида корня или участка корня с несколькими БК на установке с бинокуляром и последующей обработкой изображений в программе AxioVision 4.7. Для определения относительной скорости роста (ОСР) БК их фотографировали каждый час в течение 4—5 ч.
ОСР БК рассчитывали по стандартной формуле:
ОСР = 1/Ln х dL/dt,
(1)
3,0-| ■ нитрат ■ нитрит
tili
0,01 мМ
0,1 мМ
1,5 мМ
Рис. 1. Относительная скорость роста БК Zea mays L. в зависимости от концентрации нитрата и нитрита в среде Прянишникова NH+ -варианта через 48 ч после 4 ч экспозиции. Данные стандартизированы относительно растений NH+ -варианта, показатели которых приняты за отн. ед.
48 ч после 4 ч экспозиции на NO- было зафиксировано ускорение роста БК, причем ОСР БК в диапазоне 0,01—1,5 мМ была одинаковой и превышала показатели контрольных растений примерно в 2 раза (рис. 1). Действие NO 2 при экспонировании заметно отличалось от действия NO- и зависело от концентрации: 0,01 мМ стимулировала рост БК, 0,1 мМ не оказывала действия на ОСР, а присутствие в среде 1,5 мМ значительно снижало скорость роста БК по сравнению с контролем. Традиционно считается, что NO2 токсичен для клеток и не накапливается в тканях растений. Однако недавние исследования показали, что растения не проявляют признаков токсичности при выращивании на средах с содержанием NO2 в пределах 5 мкМ—5 мМ [13]. По нашим данным, наименьшая из исследованных концентраций 0,01 мМ KNO2 при кратковременном воздействии обладала выраженным стимулирующим эффектом, сравнимым с эффектом NO- (рис. 1).
При постоянном присутствии в растворе выращивания малых "эффективных" концентраций 0,01 мМ KNO3 и 0,01 мМ KNO2 длина БК у 7-дневных проростков NO2 -варианта была даже больше, чем у проростков NO--варианта (рис.2). При выращивании в присутствии 10-6 М АБК рост БК растений NH+-варианта значительно подавлялся. Это был ожида-
где Ln — длина БК в предыдущий момент времени [15]. ОСР рассчитывали для 5—6 БК на корне одного растения, для двух растений каждого варианта в опыте.
Все опыты проводили в трех биологических по-вторностях, количество растений в опыте составляло от 6 до 30. Бары на рисунках означают стандартную ошибку.
Результаты и их обсуждение
Ростовой ответ БК на кратковременное воздействие NO- и NO2 оценивали по ОСР БК. Спустя
Рис. 2. Длина БК Zea mays L. в зависимости от присутствия АБК, нитрата и нитрита в среде выращивания. Данные стандартизированы относительно растений NH4 -варианта, показатели которых приняты за отн. ед.
емый ингибирующий эффект АБК, который наблюдали ранее, в частности у арабидопсис [10]. При совместном действии NO- и АБК на проростки кукурузы стимулирующий эффект нитрата снимался и рост БК был сравним с вариантом, когда наблюдали ингибирование под действием только АБК (рис. 2). При совместном действии NO- и АБК стимулирующий эффект нитрита снимался, достигая контрольных значений, но ингибирования роста БК не проявлялось (рис. 2). Эти результаты позволяют заключить, что рост БК регулируется экзогенными нитратом, нитритом и АБК, но не позволяют сделать вывод об их взаимодействии в этой регуляции. Однако на основании литературных данных можно предположить, что оксид азота (NO) участвует в этой регуляции.
В настоящее время считается, что молекула NO является универсальным регулятором роста растений, участвующим во всех стадиях развития от прорастания до плодоношения [16, 17]. Оксид азота может образовываться эндогенно из нитрата и нитрита. В качестве продуцентов NO в растительной клетке рассматриваются нитратредуктаза (НР) [18], нитрит-NO-оксидоредуктаза (Ni-NOR) [19], а также NO-ас-социированные белки (AtNOA1) [20]. НР может генерировать оксид азота из нитрита в NAD^H-зави-симой реакции. Ni-NOR — белок, локализованный в плазмалемме клеток корня, также образует NO из нитрита. Многие исследователи справедливо, на наш взгляд, считают NO участником трансдукции NO-3 сигнала [16].
Однако существуют данные об участии NO в системе передачи гормонального сигнала АБК, например при закрывании устьиц [21]. Возможно, NO также действует на уровне белков рецепторов каскада раннего ответа на АБК [20]. Наконец, тройные мутанты арабидопсис nia1nia2noa1-2, имеющие очень низкий уровень эндогенного NO, демонстрировали нарушения развития корневой системы, а также повышенную чувствительность к АБК, которая снижалась при добавлении экзогенного оксида азота [17].
Распространенной тест-системой выявления участия NO в том или ином процессе является генератор NO — нитропруссид натрия (SNP) или пара SNP/PTIO (источник NO/нейтрализатор NO) [22, 23]. Мы использовали SNP в качестве источника экзогенного NO в питательном растворе. При выращивании растений в присутствии 1 мкМ SNP наблюдали возрастание длины БК в 1,6 раза по сравнению с контролем, что было сравнимо в количественном отношении с эффектами нитрата и нитрита. Высокая же концентрация SNP (10 мкМ) ингибировала рост БК в 2,2 раза относительно контрольных растений.
Парадоксальный эффект возник при кратковременной (4 ч) экспозиции растений Zea mays L. на 10 мкМ SNP (рис. 3): рост БК ускорялся при видимых нарушениях геотропизма. В работе с проростками кукурузы с помощью флуоресцентных антител были визуализированы реорганизационные перестрой-
Рис. 3. Внешний вид корней проростков Zea mays L. в контроле (NHÍ -вариант) и через 24 ч после 4 ч экспозиции на среду Прянишникова NHÍ -варианта с 10 мкМ SNP. 4.8* увеличение
ки акгинового цитоскелета в результате обработки корней экзогенным [24]. Возможно, наблюдаемый нами эффект — тоже результат изменения активности цитоскелета в клетках кончика БК (рис. 3).
Для объяснения наблюдаемых эффектов N0-, N02 и абсцизовой кислоты на рост боковых корней мы предлагаем следующую гипотезу (рис. 4). Предположительно, в присутствии N0- уровень эндогенного оксида азота повышается, поскольку он образуется из нитрита — продукта восстановления нитрата, и наблюдается стимулирование роста боковых корней. N02, являясь непосредственным предшественником N0, также стимулирует рост боковых корней, но лишь в низких концентрациях. При увеличении концентрации N0- образуется избыточное количество оксида азота, что вызывает ингибирование роста корней. При действии экзогенной АБК уровень N0 в клетках корня также повышается до значений, ингиби-рующих рост БК.
Рис. 4. Гипотетическая схема регуляции роста БК нитратом, нитритом и АБК через образование оксида азота. Повышение содержания оксида азота стимулирует рост БК, избыточное образование N0 — ингибирует
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hodge A. The plastic plant: root responses to heterogeneous supplies of nutrients // New Phytologist. 2004. Vol. 162. N 2. P. 9—24.
2. Новикова Г.В., Степанченко H.C., Носов A.B., Мош-ков И.Е. В начале пути: восприятие АБК и передача ее сигнала у растений // Физиол. раст. 2009. Т. 56. № 6. С. 806—823.
3. De Smet I., Zhang H, Inzé D, Beeckman T. A novel role for abscisic acid emerges from underground // Trends Plant Sci. 2006. Vol. 11. N 9. P. 434—439.
4. Zhang H., Jennings A., Barlow P., Forde B. Dual pathways for regulation of root branching by nitrate // Plant Biology. 1999. Vol. 96. N 11. P. 6529—6534.
5. Сидоренко Е.С., Харитонашвили Е.В. Нитрат-ион — сигнал для роста и развития корневой системы // Агрохимия. 2011. № 7. С. 38—43.
6. Scheible W.-R., Morcuende R., Czechowski T., Fritz C., Osuna D., Palacios-Rojas N, Schindelasch D., Thimm O., Ud-vardi M.K., Stitt M. Genome-wide reprogramming of primary and secondary metabolism, protein synthesis, cellular growth processes, and the regulatory infrastructure of Ararabidopsis in response to nitrogen // Plant Physiol. 2004. Vol. 136. N 1. P. 2483—2499.
7. Zhang H., Forde B. An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture // Science. 1998. Vol. 279. P. 407—409.
8. Castaings L, Camargo A., Pocholle D., Gaudon V., Texier Y., Boutet-Mercey S., Taconnat L, Renou J.-P., Daniel-Vedele F., Fernandez E, Meyer C., Krapp A. The nodule inception-like protein 7 modulates nitrate sensing and metabolism in Arabidopsis // Plant J. 2009. Vol. 57. N 3. P. 426—435.
9. Krouk G., Crawford N, Coruzzi G., Tsay Y.-F. Nitrate signaling: adaptation to fluctuating environments // Current Opinion in Plant Biology. 2010. Vol. 13. N 3. P. 1—8.
10. De Smet I., Signora L., Beeckman T., Inzé D., Foyer C.H., Zhang H. An abscisic acid-sensitive checkpoint in lateral root development of Arabidopsis // Plant J. 2003. Vol. 33. N 3. P. 543—555.
11. Signora L., De Smet I., Foyer C.H., Zhang H. ABA plays a central role in mediating the regulatory effects of nitrate on root branching in Arabidopsis // Plant J. 2001. Vol. 28. N 6. P. 655—662.
12. Wang R., Tischner R., Gutierrez R.A., Hoffman M., Xing X., Chen M., Coruzzi G., Crawford N.M. Genomic analysis of the nitrate response using a nitrate reductase-null mutant of Arabidopsis // Plant Physiol. 2004. Vol. 136. N 1. P. 2512—2522.
13. Wang R., Xing X., Crawford N. Nitrite acts as a trans-criptome signal at micromolar concentrations in Arabidopsis roots // Plant Physiol. 2007. Vol. 145. N 4. P. 1735—1745.
14. Vidal E.A., Gutiérrez R A. A systems view of nitrogen nutrient and metabolite responses in Arabidopsis // Current Opinion in Plant Biology. 2008. Vol. 11. N 5. P. 521—529.
15. Бидл К.Л. Анализ роста растений // Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения / Под ред. и с предисл. А.Т. Мокроносова. М.: Агропромиздат, 1989. 460 с.
16. Красиленко Ю.А., Емец А.И., Блюм Я.Б. Функциональная роль оксида азота у растений // Физиол. раст. 2010. T. 57. № 4. С. 483—494.
17. Lozano-Juste J., Leon J. Nitric oxide modulates sensitivity to ABA // Plant Signaling & Behavior. 2010. Vol. 5. N 3. P. 314—316.
18. Rockel P., Strube F., Rockel A., Wildt J., Kaiser W. Regulation of nitric oxide (NO) production by plant nitrate reductase in vivo and in vitro //J. Experiment. Bot. 2002. Vol. 53. N 366. P. 103—110.
19. Stohr C., Stremlau S. Formation and possible roles of nitric oxide in plant roots // J. Experiment. Bot. 2006. Vol. 57. N 3. P. 463—470.
20. Lozano-Juste J., Leon J. Enhanced abscisic acid-mediated responses in nia1nia2noa1-2 triple mutant impaired in NIA/NR- and AtNOA1 dependent nitric oxide biosynthesis in Arabidopsis // Plant Physiol. 2010. Vol. 152. N 2. P. 891—903.
21. Desikan R., Griffiths R., Hancock J., Neill S. A new role for an old enzyme: nitrate reductase-mediated nitric oxide generation is required for abscisic acid-induced stomatal closure in Arabidopsis thaliana // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2002.Vol. 99. N 25. P. 16314—16318.
22. Garcia-Mata C., Lamattina L. Nitric oxide induces stomatal closure and enhances the adaptive plant responses against drought stress // Plant Physiol. 2001. Vol. 126. N 3. P. 1196—1204.
23. Neill S., Barros R., Bright J., Desikan R., Hancock J., Harrison J., Morris P., Ribeiro D., Wilson I. Nitric oxide, sto-matal closure, and abiotic stress // J. Experiment. Bot. 2008. Vol. 59. P. 165—176.
24. Kasprowicz A., Szuba A., Volkmann D., Baluska F., Wojtaszek P. Nitric oxide modulates dynamic actin cytos-keleton and vesicle trafficking in a cell type-specific manner in root apices // J. Experiment. Bot. 2009. Vol. 60. P. 1605—1617.
Поступила в редакцию 19.05.11
NITRATE AND ABA INTERACTION IN REGULATION OF LATERAL ROOT ELONGATION IN ZEA MAYS L.
E.S. Sidorenko, E.V. Kharitonashvili
Lateral root (LR) elongation rate depends on NO-, NO- and ABA availability in the nutrient solution. Short-term exposure on 0,01—1,5 mM KNO3 stimulates LR elongation rate; in experiments with KNO2 only 0,01 mM stimulates LR elongation rate. Exogenous 10-6 M ABA inhibites
LR growth. Simultaneous effects of NO3 and ABA or NO 2 and ABA on LR elongation rate are different. Role of endogenous NO in regulation of LR elongation is discussed.
Key words: NO-, NO-, ABA, lateral root elongation, Zea mays L.
Сведения об авторах
Сидоренко Екатерина Сергеевна — науч. сотр. кафедры физиологии растений биологического факультета МГУ. Тел. 8-495-939-42-55; e-mail: [email protected]
Харитонашвили Елена Владимировна — канд. биол. наук, доцент кафедры физиологии растений биологического факультета МГУ. Тел. 8-495-939-42-55; e-mail: [email protected]
