CC BY
28
6. Устройство для изучения всасываемости веществ кишечником животных: пат. 111427 Российская Федерация. МПК A61D 99/00 / Ю.К. Коваленок, Г.Г. Щербаков, А.А. Груздков, Л.В. Громова, А.В. Богомольцев; заявитель Коваленок Юрий Казимирович (BY). - № 2011131486/13; заявл. 28.07.11; опубл. 20.12.2011 // Бюллетень. - № 35. - 2 с.
7. Bunzel, M. Chemical Characterization of Klason Lignin Preparations from Plant-Based Foods / M. Bunzel, A. SchuBler, G. Tchetseubu Saha // J Agric Food Chem. - 2011. -Dec 14; 59 (23). - P. 12506-12513.
8. Effects of denaturation and amino acid modification on fluorescence spectrum and he-magglutinating activity of Hericium erinaceum Lectin / M. Gong [et al.] // Acta Biochim Bio-phys Sin (Shanghai). - 2004. - Vol. 36. - №2. 5. - Р. 343-350.
9. Goldstein, I.J. Isolation, physicochemical characterization, and carbohydrate-binding specificity of lectins / I. J. Goldstein, R. D. Porez // The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine / I.E. Liener, N. Sharon, I.J. Goldstein. - Orlando: Academic Press, 1986. - Р. 33-243.
10. Higuchi, M. Growth inhibition and small intestinal lesions in rats after feeding with isolated winged bean lectin / M. Higuchi, I. Tsuchiya, K. Iwai // Agrie. Biol. Chem. - 1984. -Vol. 48. - № 3. - Р. 695-701.
11. Lectin-mediated drug delivery: influence of mucin on cytoadhesion of plant lectins in vitro / M. Wirth [et al.] // J. Control Release. - 2002. - Vol. 79. - P. 183-191.
12. Lorenzsonn, V. In vivo responses of rat intestinal epithelium to intraluminal dietary lectins / V. Lorenzsonn, W. A. Olsen // Gastroenterology. - 1982. - Vol. 82. - Р. 838-848.
13. Maize-Glucosidase-aggregating Factor Is a Polyspecific Jacalin-related Chimeric Lec-tin, and Its Lectin Domain Is Responsible for -Glucosidase Aggregation / Farooqahmed S. Kittur [et al.] // Journal of biological chemistry. - 2007. - Vol. 282. - № 10. - Р. 72997311.
14. Oliveira, A.C. Lesions of intestinal epithelium by ingestion of bean lectins in rats / A.C. Oliveira, B.C. Vidal, V.C. Sgarbier // J. Nutr. Sci. Vitaminol. - 1989. - Vol. 35. - № 4. -Р. 315-322.
15. Soybean protein isolate and soybean lectin inhibit iron absorption in rats / Hisayasu Sanae [et al.] // J. Nutr. - 1992. - Vol. 122. - P. 1190-1196.
16. The interaction between plant lectins and the small intestinal epithelium: a primary cause of intestinal disturbance / M. J. Kik [et al.] // Vet Q. - 1989. - Apr. 11 (2). - P. 108-115.
УДК 619:616.391
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФИТОЛЕКТИНОВ С МЕМБРАНАМИ ЭНТЕРОЦИТОВ ТОЩЕЙ КИШКИ КАК ЭТИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКТОР ГИПОМИКРОЭЛЕМЕНТОЗОВ
Ю.К. КОВАЛЕНОК УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Республика Беларусь, 210026
(Поступила в редакцию 18.04.2013)
Введение. Для успешного решения актуальных вопросов производства животноводческой продукции необходимы глубокие исследования в области биохимии и, в частности, молекулярной биологии. Прогресс и достижения в этой области науки тесно связаны с развитием новых методов исследований [1-3]. Одним из них является изучение особого класса белков - лектинов. Эти белки являются одним из эволюционно выработанных растениями защитных факторов, позволяющих растительному организму противостоять различного рода не-
благоприятным воздействиям [6, 9, 10]. Лектины - это белки, не относящиеся к классу иммунных и ферментных белков, способные к обратимому связыванию с углеводной частью гликоконъюгатов без нарушения ковалентной структуры любых из узнаваемых гликозильных лигандов. В основе образования комплекса лектин-гликолиганд лежит явление комплементарности, т. е. пространственного соответствия молекул лектина и углеводного детерминанта друг другу [5]. Благодаря своей способности к комплексообразованию с углеводами, в том числе и с углеводными детерминантными системами любых цитоплазмати-ческих мембран, лектины вызывают реакции агглютинации, преципитации, а также биологический ответ системы, на которую они воздействуют. Поэтому многие исследователи относят лектины к белкам -модификаторам биологического ответа [5, 7, 8].
Вместе с тем физиологическая роль эндолектинов изучена не достаточно. Лектины семян рассматривают как запасные белки, средства транспорта углеводов, а также способа защиты растений от поедания. В последнее время получены данные о том, что инфицирующая способность вирусов, а также образование симбиоза азотфиксирующих бактерий с бобовыми культурами также осуществляется за счет лек-тин-углеводного взаимодействия [3]. Исследователями обнаружено, что многие фитолектины являются термостабильными белками, а лек-тины содержащиеся в семенах растений выступают в роли антипитательных веществ. Ранее в модельных экспериментах нами установлено статистически значимое снижение всасывания микроэлементов кишкой крупного рогатого скота при наличии в реакционной смеси выделенных лектинов кукурузы.
Цель работы - изучить взаимодействия лектинов со слизистой оболочкой кишки.
Материал и методика исследований. Исследования, положенные в основу настоящей работы выполнены в УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» при техническом сотрудничестве РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию» (Республика Беларусь).
Реализация поставленной цели осуществлялась путем гистохимического исследования фрагментов тощей кишки бычков, инкубировавшихся in vitro в модельной системе изучения всасывания веществ [4] кишкой животных в солевых растворах Си, Zn, Co и Fe.
В данные растворы вносился меченый пероксидазой хрена лектин кукурузы в концентрации 50 мг/л - 2-я и 3-я группы проб, также в состав 3-й группы проб дополнительно к названным компонентам вводился N-ацетил-Б-глюкозоамин в концентрации 10 мг/л. К данному веществу проявляет высокую специфичность лектин кукурузы [8], связывая его в своих активных центрах, тем самым ослабляя или полностью ликвидируя лектиновую активность. Лектин кукурузы получали
из молодых проростков кукурузы методом аффинной хроматографии по протоколу [8].
Материал, предназначенный для гистологических исследований, фиксировали в 10%-ном растворе формалина. Зафиксированный материал подвергали уплотнению путем заливки в парафин по общепринятой методике, а также замораживанием. Гистологические срезы готовили на санном и замораживающем микротомах. Для изучения общих структурных изменений срезы кишечника бычков окрашивали гематоксилин-эозином.
При проведении гистохимических исследований быстро извлеченные участки тощей кишки замораживали до температуры -30 oC на охлажденном блок-держателе криостата. Затем готовили криостат-ные срезы кишки толщиной 5 мкм. Замороженные срезы фиксировали смесью ацетон: метанол:формалин (в пропорции 19:19:2) в течение 90 с при комнатной температуре, а затем высушивали на воздухе. В последующем гистосрезы кишечника дважды отмывали трис -солевым буфером в течение 2 мин, а затем инкубировали в смеси с 0,5 мг/мл 3,3-диаминобензидина (3,3-diaminobenzidin, DAB, Sigma) и 4 мкл/мл Н2О2 в трис-солевом буфере в течение 5 мин. Раствор NiCl2 добавляли к инкубационной смеси для улучшения контраста клеток (конечная концентрация 1 мг/мл). Окрашенные препараты отмывали дистиллированной водой, сушили на воздухе, обезвоживали в спирте и заключали в бальзам.
Общегистологические и гистохимические исследования проводили с помощью светового микроскопа «БИОМЕД-6» (Россия). Полученные данные документированы микрофотографированием с использованием цифровой системы считывания и ввода видеоизображения «ДСМ-510», а также программного обеспечения по вводу и предобработке изображения «ScopePhoto».
Оценку гистохимической реакции на лектин производили по 4 бальной системе. Интенсивно окрашенные структуры отмечали «+++» (резко положительный результат окраски), среднеокрашенные -«++» (положительный результат окраски), слабоокрашенные - «+» (слабо положительная окраска), неокрашенные - «0» (негативный результат окраски).
Автор выражает благодарность докторам медицинских наук М.Д. Луцику и А.Д. Луцику (г. Львов, Украина), доктору биологических наук В.М. Лахтину (г. Москва, Россия) и кандидату ветеринарных наук И.Н. Громову (г. Витебск, Беларусь), оказавшим значимую консультативную помощь при выполнении исследований, положенных в основу настоящей работы.
Результаты исследований и их обсуждение. При проведении общегистологического анализа тощей кишки крупного рогатого скота существенных структурных различий между группами проб не отмечалось. На гистопрепаратах кишечника четко визуализировались слизистая, мышечная и серозная оболочки. Среди структур слизистой
оболочки определялись эпителиальный, собственный, мышечный и подслизистый слои. Кишечные ворсинки образованы путем выпячивания всех слоев слизистой оболочки. При впячивании эпителия в собственный слой слизистой оболочки формировались многочисленные крипты. Среди эпителиоцитов, покрывающих ворсинки, определялись множественные призматические каемчатые и расположенные поодиночке бокаловидные клетки. Клетки эпителия крипт представлены каемчатыми эпителиоцитами, бокаловидными клетками и бескаемчатыми энтероцитами (камбиальными клетками). Собственный слой слизистой оболочки образован рыхлой соединительной тканью, содержал кишечные железы, кровеносные, лимфатические сосуды и узелки. Мышечную пластинку формировали 2-3 слоя гладких миоцитов. В подслизистом слое содержались железы, нервные сплетения, более крупные сосуды и лимфоидные узелки.
Гистохимическое исследование проб кишечника телят, полученных после инкубации в различных растворах, позволило выявить лектинсо-держащие структуры неодинаковой степени интенсивности окраски. Так, в пробах кишок 1-й группы, полученных после инкубации в контрольном растворе солей, результаты гистохимической окраски на выявление лектина варьировали от негативной до слабо положительной (рис. 1, 2). В случае слабо положительной реакции основными местами локализации лектиновых включений были кишечные крипты. В одних пробах лектиновые конъюгаты просматривались как диспергированные включения желто-коричневого или буро-коричневого цвета с очень низкой интенсивностью окраски, равномерно залегающие в плазмолемме эпителиальных клеток крипт (рис. 1, 2). В других случаях они принимали вид четко очерченных гранул буроватого цвета и обнаруживались в небольших группах (рис. 3) эпителиоцитов отдельных крипт, занимая преимущественно апикальный полюс клетки (рис. 2). Диффузные включения лектина с низкой интенсивностью гистохимической окраски закономерно выявлялись и в покровном эпителии ворсинок.
В пробах кишок 2-й группы, инкубированных в растворе солей микроэлементов и лектина кукурузы, результаты гистохимической окраски варьировали от положительной до резко положительной.
При изучении эпителиальной выстилки кишечных ворсинок лекти-новые включения просматривались как гранулярные, коричневого или буро-коричневого цвета, до 2-3 мкм в диаметре (рис. 3, 4). Они фиксировались в области щеточной каемки, в плазмолемме между энтероци-тами. Кроме того, отмечено незначительное усиление гистохимической окраски в местах залегания лимфоидных узелков, что связано, по нашему мнению, с частичным попаданием экзогенных лектинов в лимфатическое русло кишечника.
При этом интенсивность гистохимической окраски бокаловидных клеток была закономерно выше, нежели в каемчатом эпителии (рис. 3). Во всех случаях отмечалась высокая интенсивность окраски эпителия общекишечных желез, эндотелия лимфатических и кровеносных капилляров. При световой микроскопии таких препаратов лектиновые
конъюгаты имели вид как распыленной зернистости, так и достаточно крупных гранул.
Результаты наших исследований также показали, что добавление в инкубирующий раствор М-ацетил-Б-глюкозоамина частично блокирует адгезию лектиновых молекул на клеточных мембранах.
1 - диспергированные включения лектина; 2 - крипты; 3 - собственная пластинка
Рис. 1. Морфологическая и гистохимическая структура слизистой оболочки тощей
кишки теленка. Группа проб № 1. Ув. х 130
1 - эпителий крипт;
2 - соединительная
ткань
Рис. 2. Низкое содержание лектина в железистом эпителии тощей кишки теленка. Группа проб N° 1. Ув. х 260
1 - призматический покровный эпителий; 2 - собственная пластинка
Рис. 3. Высокое содержание лектина в плазмолемме бокаловидных клеток слизистой оболочки кишечника теленка. Группа проб № 2. Ув. х 520
1 - просвет кишечника; 2 - собственный слой; 3 - венулы; 4 - покровный эпителий
Рис. 4. Структура ворсинки тощей кишки теленка после инкубации в присутствии лектинов кукурузы. Группа проб № 2. Ув. х 130
При этом гистологические срезы тощей кишки из группы проб № 3 отличались слабой или умеренной способностью гистохимической окраски. Как и в других группах проб, диффузные и гранулярные лек-
тиновые включения обнаруживались на апикальных полюсах каемчатого эпителия (рис. 5, 6).
1 - собственный слой слизистой оболочки; 2 - общекишечные железы
Рис. 5. Неравномерная гистохимическая реакция на выявление лектина в эпителии общекишечных желез. Группа проб № 3. Ув. х 130
1 - просвет крипт; 2 - капилляры и венулы собственной пластинки
Рис. 6. Положительный результат окраски
железистого эпителия на выявление лектинсодержащих структур. Группа проб N° 3. Ув. х 260
Характерной особенностью являлась неравномерная гистохимическая окраска. Так, в близко расположенных структурах интенсивность окраски варьировала от негативной до положительной (рис. 5).
Заключение. Таким образом, исследования демонстрируют выраженное взаимодействие кишечного эпителия с лектинами кукурузы, отмечено, что локализация этого взаимодействия и его интенсивность различны. Интенсивность гистохимической окраски бокаловидных клеток была закономерно выше, нежели в каемчатом эпителии. Во всех случаях отмечалась высокая интенсивность окраски эпителия общекишечных желез эндотелия лимфатических и кровеносных капилляров. Более того, наличие в системе специфичного лектину углевода существенно нивелирует негативный эффект. Изложенное может рассматриваться как один из возможных этиопатогенетических аспектов гипомикроэлементозов у животных. Вместе с тем, для убедительных доказательств данной теории эксперименты должны быть продолжены в условиях in vivo.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кучинский, М.П. Биоэлементы - фактор здоровья и продуктивности животных: монография / М.П. Кучинский. - Минск: Бизнесофсет, 2007. - 372 с.
2. Луцик, А.Д. Лектины: биологические свойства и применение в иммунологии / А.Д. Луцик // Биохимия человека и животных. - 1985. - Вып. 9. - С. 63-76.
3. Пономаренко, Ю. А. Питательные и антипитательные вещества в кормах: монография / Ю.А. Пономаренко; М-во сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь. - Минск: Экоперспектива, 2007. - 948 с.
4. Устройство для изучения всасываемости веществ кишечником животных: пат. 111427 Российская Федерация. МПК A61D 99/00 / Ю.К. Коваленок, Г.Г. Щербаков, А.А. Груздков, Л.В. Громова, А.В. Богомольцев; заявитель Коваленок Юрий Казимирович (BY). - № 2011131486/13; заявл. 28.07.11; опубл. 20.12.2011 // Бюллетень. - № 35. - 2 с.
5. Effects of denaturation and amino acid modification on fluorescence spectrum and he-magglutinating activity of Hericium erinaceum Lectin / M. Gong [et al.] // Acta Biochim Bio-phys Sin (Shanghai). - 2004. - Vol. 36. - №2. 5. - Р. 343-350.
6. Jackson, A.O. Plant-Microbe Interactions: Life and Death at the Interface / A.O. Jackson, C.B. Tailor // Plant Cell. - 1996. - Vol. 8. - №2 10. - P. 1651-1668.
7. Lectin-mediated drug delivery: influence of mucin on cytoadhesion of plant lectins in vitro / M. Wirth [et al.] // J. Control Release. - 2002. - Vol. 79. - P. 183-191.
8. Maize -Glucosidase-aggregating Factor Is a Polyspecific Jacalin-related Chimeric Lectin, and Its Lectin Domain Is Responsible for -Glucosidase Aggregation / Farooqahmed S. Kittur [et al.] // Journal of biological chemistry. - 2007. - Vol. 282. - №2 10. - Р. 7299-7311.
9. Malek, K. Defense on multiple fronts: how do plants cope with diverse enemies? / K. Malek, R. A. Dietrich // Trends Plant Science. - 1999. - Vol. 4. - №2 6. - P. 215-219.
10. Stotz, H.U. Plant-insect interactions / H. U. Stotz, J. Kroymann, T. Mitchell-Olds // Current Opinion in Plant Biology. - 1999. - Vol. 2. - № 4. - P. 268-272.
