Взаимодействие фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, и его рецептора CD74 усиливается церулоплазмином с лабильно связанной медью Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Экспериментальные модели Experimental models

фективности антибиотиков использовались диски антибиотиков (Oxoid Ltd., England). Исследование фагоцитоза меченых Cy3 (GE Healthcare, Sweden) L. monocytogenes (EGD серовар l/2a) проводилось на проточном цитометре (Cytomics FC 500 MPL, Beckman Coulter, Inc.). Анализировалось не менее 10000 событий. Эукариотические клетки кудьтивировались в питательной среде в СО2 инкубаторе при 37 °C. Количество IL-6 определялось с помощью ИФА (R&D Systems).

Результаты. Полученный рекомбинантный человеческий белок Tag-7/PGLYRP-l связывается с клеточными стенками бактерий, но не демонстрирует бактерицидной и бактериостатической активности при использованных концентрациях. Однако с помощью диско-диффузионного метода было выявлено, что в некоторых случаях присутствие Tag7/PGLYRP-1 может усиливать чувствительность бактерий к наличию антибактериальных препаратов.

С использованием макрофагоподобной клеточной линии ANA-1 продемонстрировано, что присутствие Tag-7/PGLYRP-l стимулирует фагоцитоз внутриклеточных патогенных бактерий L. monocytogenes. С помощью инфекционной in vitro модели показано, что присутствие Tag-7/PGLYRP-l ингибирует внутриклеточное выживание L. monocytogenes, предохраняя эукариотические клетки от заражения.

Белок Tag-7/PGLYRP-l способствует выработке клетками ANA-1 активных форм кислорода, а так же провос-палительного цитокина IL-6.

Заключение. Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что пептидогликан-распознаю-щий белок Tag-7/PGLYRP-l активирует защитные механизмы врожденного иммунитета, препятствует заражению эукариотических клеток L. monocytogenes.

Работа поддержана грантом РФФИ № l5-04-07649.

Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации № НШ-9069.20l6.4.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФАКТОРА, ИНГИБИРУЮЩЕГО МИГРАЦИЮ МАКРОФАГОВ, И ЕГО РЕЦЕПТОРА CD74 УСИЛИВАЕТСЯ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНОМ С ЛАБИЛЬНО СВЯЗАННОЙ МЕДЬЮ

Соколов А.В., Костевич В.А., Горбунов Н.П., Грудинина Н.А., Васильев В.Б.

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия

Введение. Ранее нами было установлено, что медьсодержащий белок острой фазы воспаления церулоплаз-мин (ЦП), благодаря наличию лабильно связанных ионов меди, образует белок-белковый комплекс с фактором, ингибирующим миграцию макрофагов (МИФ) — ключевым цитокином воспаления. Введение насыщенного медью ЦП усиливало провоспалительную активность МИФ при моделировании септического шока у мышей in vivo, приводя к l00% смертности мышей, а аффинные антитела против МИФ препятствовали этому. Поскольку для активации провоспалительной активности МИФ необходимо его взаимодействие с инвариантной цепью главного комплекса гистосовместимости (CD74), были основания высказать гипотезу, что ЦП с лабильно связанной медью может влиять на взаимодействие МИФ и CD74. Целью

работы явилось исследование взаимодействия МИФ, ЦП и CD74. В задачи входило получение высокоочищенных белков и характеристика их взаимодействия.

Материалы и методы. Взаимодействие ЦП, МИФ и sCD74 изучали с помощью аффинной хроматографии, гель-фильтрации, электрофореза в полиакриламидном геле без детергентов и метода поверхностного плазмон-ного резонанса. Был клонирован внеклеточный домен рецептора CD74 (sCD74), получена плазмида, кодирующая N-концевую полигистидиновую последовательностью, сайт для гидролиза тромбином перед аминокислотной последовательностью sCD74. Отработан протокол, позволивший выделить высокоочищенный sCD74 из телец включения E. coli с помощью металл-хелатной хроматографии, гидролиза тромбином и аффинной хроматографии на МИФ-агарозе.

Результаты. Соответствие аминокислотной последовательности электрофоретически гомогенного sCD74 было доказано с помощью масс-спектрометрии фрагментов трипсинолиза (найдено 90% предсказанной последовательности). С помощью оптических сенсоров с иммобилизованным МИФ (BiaCore X-100) мы показали, что на взаимодействие МИФ и sCD74 практически не влияли ионы меди: константы диссоциации 19,1(+/-1,2) и 17,7(+/-0,9) нМ. ЦП лишенный ионов лабильной меди не влиял на взаимодействие МИФ и sCD74, напротив, присутствие ионов лабильной меди в ЦП увеличило сродство МИФ и sCD74 в 1,5 раза: константа диссоциации 12,2(+/-0,7) нМ. Аналогичные результаты были получены с помощью метода аффинной хроматографии: ЦП с лабильно связанными ионами меди способствовал взаимодействию sCD74 с иммобилизованным на агарозе МИФ. При гель-фильтрации ЦП, МИФ и sCD74 элюи-ровались совместно в буфере, содержащем 5 мкМ сульфата меди.

Заключение. Таким образом, мы показали, что ЦП может усиливать взаимодействие МИФ с внеклеточным доменом CD74.

Исследование поддержано грантом РФФИ № 16-0401182.

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОРАКОВЫХ СВОЙСТВ КОМПЛЕКСА ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА С ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ

Соколов А.В., Власенко А.Ю., Костевич В.А., Старикова Э.А., Киселева Е.П., Васильев В.Б.

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия

Введение. Белок грудного молока и секреторных гранул нейтрофилов, лактоферрин (ЛФ), обладает противораковой активностью, однако механизм его действия изучен не до конца. Недавно было показано, что ЛФ молока коров подобно альфа-лактальбумину образует комплекс с олеиновой кислотой, вызывающий апоптоз раковых клеток в культуре. Целью работы явилось исследование взаимодействия ЛФ человека с олеиновой кислотой и его противораковых свойств in vitro и in vivo. В задачи входило исследование липолитического эффекта ЛФ, изучение взаимодействия ЛФ и олеиновой кислоты, влияния комплекса на апоптоз культивируемых клеток, а также наблюдение за ростом гепатомы 22А после подкожной инокуляции мышам.