CC BY
16
УДК 577.152.3
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДУОДЕНАЗЫ С ИНГИБИТОРАМИ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Н.А. Попыкина, И.П. Гладышева, Н.Г. Балабушевич, Т.С. Замолодчикова*, Н.И. Ларионова
(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии; e-mail: [email protected].)
Изучено взаимодействие дуоденазы - новой сериновой протеиназы, принадлежащей к немногочисленному классу "двуликих" протеиназ, с химостатином и лейпептином. Константа ингибирования (^инг) химостатином гидролиза дуоденазой субстратов Suc-Ala-Ala-Phe-pNA и N-i-Boc-O-Bz-Ser-Gly-Arg-pNA составила 63±4 нМ. Показано, что при смене химотрипсинового субстрата на трипсиновый ингибирование меняет конкурентный характер на бесконкурентный. При изучении ингибирования дуоде-назы изопропионил-лейпептином показано, что 50% ингибирование достигается при соотношении [/]0/[^]0 = 2000.
Дуоденаза, сериновая протеиназа кишечника [1], локализована в секреторных гранулах эпителиальных клеток бруннеровых желез дуоденальной слизистой [2]. Доказано, что дуоденаза принимает участие в активации проэнтеропептидазы - одноцепочечного предшественника энтеропептидазы [3].
Таким образом, дуоденаза, активируя проэнтеропеп-тидазу, может играть центральную роль в инициации каскада реакций протеолитического расщепления, приводящих к активации панкреатических ферментов. Кроме того, последние исследования показали, что дуодена-за способна активировать PAR рецепторы [4], что не исключает ее роли в воспалительных процессах, происходящих в организме. Субстратная специфичность дуо-деназы необычна - она проявляет свойства трипсино- и химотрипсиноподобных протеиназ [2]. Так, по отношению к синтетическим и белковым субстратам трипсино-подобная активность дуоденазы выражена более ярко, чем химотрипсиноподобная. Однако при взаимодействии с белковыми ингибиторами протеиназ как аналогами субстратов дуоденаза проявляет свои химотрипсинопо-добные свойства [5].
В данной работе исследовано взаимодействие дуоденазы с ингибиторами микробного происхождения - химостатином и изопропионил-лейпептином. Эти ингибиторы могут быть использованы в качестве противовоспалительных и противораковых средств [6]. Известно, что химостатин и лейпептин являются мощными конкурентными ингибиторами ряда сериновых и цистеино-вых протеиназ и рассматриваются как пептидил-альде-гидные аналоги "переходного состояния" [7]. Ингибирование обусловлено образованием полуацеталей или ти-оацеталей с каталитически активными группами сери-новых или цистеиновых протеиназ и сопровождается конформационными перестройками в белке (схема 1) [8, 9]. Химостатин ингибирует ферменты, обладающие химотрипсиноподобной субстратной специфичностью [8, 10, 11], а лейпептин - ферменты c трипсиноподоб-ной субстратной специфичностью [8].
Материалы и методы
В работе использованы следующие реактивы: Трипсин быка, а-химотрипсин быка, "Merck" (Германия); Tris-оксиметиламинометан (трис-HCl), - "ICN"
* Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871 Москва. ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (095)310-7007).
C х е м а 1
Механизм ингибирования сериновых протеиназ ингибиторами микробного происхождения
Химостатин А
NH NH
HN^,NH2 ^NH
О г" ^ O
NH H
H3C^ NH NH
(США); соевый ингибитор типа Баумана-Бирк (BBI); этиловый эфир N-бензоил-Ь-аргинина (Bz-Arg-EE), этиловый эфир N-бензоил-Ь-тирозина (Bz-Tyr-EE), Suc-Ala-Ala-Phe-pNA, Tos-Gly-Pro-Lys-pNA, N-t-Boc-O-Bz-Ser-Gly-Arg-pNA - "Sigma" (США) (остальные реактивы были марки "о.с.ч", "х.ч." и "ч.д.а."). Все спектрофото-метрические измерения проводили на спектрофотометре "Shimadzu UV-265FW" (Япония).
Препарат BBI обладал 100%-й антитрипсиновой и 86%-й антихимотрипсиновой активностью. Содержание активных центров в препарате трипсина, определенное методом [12], составляло 61%.
Выделение и определение активности дуоденазы. Дуоденазу выделяли из дуоденальных желез быка методом аффинной хроматографии на соевом ингибиторе протеиназ типа Кунитца, иммобилизованном на сефаро-зе 4В [1]. Содержание белка в препарате дуоденазы определяли методом Лоури и др. [13]. Содержание активных центров дуоденазы определяли как путем ее титрования BBI с известной активностью [6].
Определение k и К . Измерение кинетических и
* кат м *
равновесных параметров гидролиза N-?-Boc-O-Benzyl-Ser-Gly-Arg-pNA проводили по изменению скорости его гидролиза от концентрации субстрата. Величину констант рассчитывали по уравнению Лайнуивера-Берка [14] и уравнению Иди [14]. Полученные £кат и Км для гидролиза N-?-Boc-O-Benzyl-Ser-Gly-Arg-pNA, катализируемого дуоденазой при pH 8,0 и Т = 37°,
Лейпептин
составляли 0,1 с 1 и 0,013 мМ соответственно.
Определение констант ингибирования (Кпш) дуоденазы химостатином и изопропионил-лейпептином. При исследовании ингибирования химостатином и изопропионил лейпептином гидролиза дуоденазой пептидных субстратов, фермент с ингибиторами предварительно инкубировали в течение 8 мин при рН 8,0 и Т = 37°, концентрацию химостатина варьировали в пределах 0-2 мМ, концентрацию изопропионил-лейпептина варьировали в пределах 0-40 мМ, концентрация фермента составляла 0,22 мМ, концентрации субстратов 8ис-А1а-А1а-РЬе-рКА, т-Вос-0^-8ег-01у-Лг§-рКЛ -19 и 43 мМ соответственно. Длина волны 405 нМ. Константы ингибирования, коэффициенты а и в, приведенные в табл. 1, определяли методом нелинейной регрессии по уравнению (1) [15]:
, _ Ч _ 1 Га+о--/?(1-сг)'
сс+сг
1+сгаК„,
аК„,
^а+а+/3[1+сг) 1+0" a+tj-fa+o) а+а\Е\а
__ж
щ
и, I'
, 4 «Кинг
и.
где А - остаточная активность фермента; V. - начальная скорость реакции в присутствии ингибитора; vo - начальная скорость реакции в отсутсвие ингибитора; с = [5]0/ Км; [5]0 - начальная концентрация субстрата; Км- константа Михаэлиса; [7]0 -
O
Т а б л и ц а 1 Константы ингибирования дуоденазы химостатином
C х е м а 2
Механизм ингибирования дуоденазы химостатином
Субстрат Параметры ингибирования
Suc-Ala-Ala-Phe-pNA Кинг = 60 нМ а = 2,87 ß = 0,28
Nt-Boc-o-Bz-Ser-Gly-Arg-pNA Кинг , = 67 нМ а = 0,14 ß = 0,37
Т а б л и ц а 2 Константы ингибирования химотрипсиноподбных ферментов химостатином
Фермент Кинг, нМ
Химотрипсин 0,4 [11, 12]
Химаза тучных клеток человека 1,33 [12]
Катепсин G 150 [11]
общая концентрация ингибитора; [E]0 - общая концентрация фермента.
Результаты и их обсуждение
Взаимодействие дуоденазы с химостатином. При взаимодействии дуоденазы с химостатином эффект ингибирования наблюдался при близких концентрациях фермента и ингибитора. Было сделано предположение, что хи-мостатин может взаимодействовать с дуоденазой по механизму обратимого гиперболического прочносвязываю-щего ингибирования. Однако теоретические кривые, рассчитанные для конкурентного связывания дуоденазы с субстратом и химостатином (схема 1), не соответствовали экспериментальным результатам.
Поэтому для описания взаимодействия химостатина с дуоденазой была использована следующая схема 2 [15].
На рис. 1 и 2 представлены зависимости химотрип-синоподобной и трипсиноподобной активностей дуоденазы от соотношения концентрации химостатина к ферменту и теоретические кривые, рассчитанные по уравнению 1 соответственно. Параметры ингибирова-ния приведены в табл. 1.-
Полученные данные указывают на то, что в реакции гидролиза субстрата Suc-Ala-Ala-Phe-pNA химос-татин проявляет гиперболический смешанный тип ингибирования (1 < а < 0 < ß < 1). Это означает, что первичное связывание химостатина или субстрата с ферментом ухудшает последующее связывание субстра-
Примечания. E - фермент; I - ингибитор; S - субстрат; P -продукт; Кинг=
[E][I]/EI; оКинг = [ES][I]/[ESI]; К = [Ej[S]/[ES]; aKs = [EI][S]/[ES]; a и ß - коэффициенты
та или химостатина соответственно. В случае гидролиза субстрата, имеющего Arg в Pj положении, ситуация меняется: ингибирование носит гиперболический бесконкурентный характер (0 < а< 1, 0 < ß < 1). В данном случае связывание одного из двух компонентов с ферментом усиливает связывание второго компонента. Это может быть обусловлено разными причинами, в том числе и конформационными изменениями.
Дуоденаза проявляет высокую степень структурной гомологии с катепсином G и химазой тучных клеток человека [16, 17]. Константы ингибирования этих протеиназ химостатином приведены в табл. 2. Химостатин является конкурентым ингибитором этих ферментов (схема 1). Так как константы ингибирования катепсина G и химотрипсина значительно отличаются (примерно в 400 раз), а константы скорости диссоциации примерно одинаковы, можно предположить участие дополнительных точечных взаимодействий в районе активного центра в дополнительной стабилизации ковалентного комплекса, что приводит к его высокой устойчивости [10]. Из табл. 2 можно видеть, что у химотрипсина и химазы тучных клеток человека (фермента, обладающе-
[Ло/Ио
Рис. 1. Ингибирование дуоденазы химостатином: субстрат - Suc-Ala-Ala-Phe-pNA, 19 мМ; [E]0 = 0,22 мМ; время инкубации 8 мин; Т = 37°; pH 8,0 (теоретический расчет по уравнению 1)
Т а б л и ц а 3
Константы ингибирования трипсиноподбных ферментов
леипептином
Фермент Кинг, нМ
Трипсин 13,4 [21]
Плазмин 1000 [22]
Wo/[E]o
Рис. 2. Ингибирование дуоденазы химостатином: субстрат - N-f-Boc-O-Bz-Ser-Gly-Arg-pNa, 43 мМ; [E]0 = 0,22 мМ; время инкубации 8 мин; T = 37°; pH 8,0 (теоретический расчет по уравнению 1)
го химотрипсиноподобной специфичностью) константы ингибирования на порядок выше, чем у ферментов с двойной специфичностью - дуоденазы и катепсина G.
Изменение механизма ингибирования протеиназ с двойной специфичностью при смене субстрата можно объяснить следующим образом. Природа химотрипсиноподобной специфичности дуоденазы и катепсина G до сих пор не установлена. Однако известно, что при замене Arg-226 в связывающем кармане гранзима B (фермента высоко гомологичного вышеперечисленным) на Gly гранзим B утрачивает активность по отношению к субстратам, имеющим отрицательно заряженные аминокислотные остатки в Р1-положении, но сохраняет способность расщеплять субстраты с гидрофобными остатками в Р1-положении [18]. Плетнев с соавторами [17] предположил, что остаток Asp-226 в дуоденазе и Glu-226 в катепсине G не является необходимым для связывания Phe (Tyr) в положении Р1 лиганда. При этом электростатическое взаимодействие положительно заряженного аминокислотного остатка в Р1 положении субстрата с отрицательно заряженным Asp (Glu)-226 вносит большой вклад в стабилизацию фермент-субстратного комплекса [19]. Вероятно, химостатин связывается в гид-
Данная работа поддержана грантом РФФИ № 01-04-49848.
рофобном кармане дуоденазы таким образом, что не только не мешает, но, как показывают полученные нами экспериментальные данные, даже усиливает связывание положительно заряженных субстратов. Следовательно, наряду с комплексом фермент-ингибитор и фермент-субстрат, возможно образование тройного комплекса фермент-ингибитор-субстрат, что соответствует механизму бесконкурентного ингибирования.
Взаимодействие дуоденазы с лейпептином. При исследовании ингибирования гидролиза субстрата Tos-Gly-Pro-Lys-pNA изопропионил-лейпептином было показано, что при соотношении концентрации ингибитора к ферменту [I]0/[E]0 = 2000 наблюдалось 50%-е ингибирование, т.е. Кинг по грубой оценке имеет порядок 10 4 М. Константы ингибирования трипсина [21] и плазмина [22] лейпептином приведены в табл. 3. Конечно, эти величины значительно меньше оцененной нами константы ингибирования дуоденазы, однако здесь проявилась ее двойная специфичность, так как на химазу тучных клеток и катепсин G лейпептин не оказывает ингибирующего действия [23].
Слабое ингибирование дуоденазы лейпептином неудивительно, так как пептидный субстрат аналогичного строения Ac-Leu-Leu-Arg-pNA является одним из наихудших субстратов, связывающихся с дуоденазой [2].
Таким образом, в результате проведенного исследования было показано, что механизм взаимодействия дуоденазы как представителя класса "двуликих" протеиназ с химостатином зависит от субстрата (гидрофобного или заряженного). Лейпептин же является слабым ингибитором дуоденазы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zamolodchikova T.S., Vorotyntseva T.I., Antonov V.K. // Eur. J.
Biochem. 1995. 227. P. 866.
2. Zamolodchikova T.S., Sokolova E.A., Alexandrov S.L. et al. // Eur. J.
Biochem. 1997. 249. P. 612.
3. Zamolodchikova T.S., Sokolova E.A., Deshun L., Sadler J.E. //
FEBS Lett. 2000. 466. P. 295.
4. Pemberton A.D., Zamolodchikova T.S., Scudamore C.L .et al. // Eur.
J. Biochem. 2002. 269. P. 1171.
5. Гладышева И.П., Замолодчикова Т.С., Соколова Е.А., Ларионо-
ва Н.И. // Биохимия. 1999. 64. C. 1473.
6. Umezawa H. // Methods Enzymology. 1976. 45. P. 678.
7. Lienhard G.E. // Science. 1973. 180. P. 149.
8. Антонов В. К. Химия протеолиза. М., 1991. C. 215, 255.
9. Matis J.A., Henes J.B., Fruton J.S.// J.Biol.Chem. 1977. 252. P. 6776.
10. Stein R.L., Strimpler A.M. // Biochemistry. 1987. 26. P. 2611.
11. Johnson L.A., Moon K.E., EisenbergM. // BBA. 1988. 953. P. 269.
12. Chase T., Shaw E. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. 269. P. 508.
13. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall, R.J. // J. Biol. Chem. 1951. 193. P. 265.
14. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М., 1976. C. 79, 168, 219.
15. Szedlacsek S.E., Ostafe V., Serban M., Vlad M.O. // Biochem J. 1988. 254. P. 311.
16. Zamolodchikova T.S., Vorotyntseva T.I., Nazimov T.V., Grishina G.A. // Eur. J. Biochem 1995. 227. P. 873.
17. Pletnev V.Z., Zamolodchikova T.S., Pangborn. W.A., Duax W.L. // Proteins. 2000. 41. P. 8.
18. Caputo A., JamesM.N.G., Powers J.C. et al. // Nat. Struct. Biol. 1994. 1. P. 364.
19. Kuramochi H., Nakata H., Ishil S. // J. Biochem (Tokyo). 1979. 86. P. 1403.
20. CummingsH.S., CastellinoF.J. // Biochemistry 1984. 23. P. 105.
21. Nakagawa H., Suzuki M., Shuto K. et al. // J. Pharmacobidyn. 1982. 5. P. 319.
Поступила в редакцию 25.10.02
