CC BY
46
©Коллектив авторов, 1995 УДК 616-006.446-085.37
Л. И. Станкевич, А. С. Духанин, Н. Е. Кушлинский,
П. В. Сергеев
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АЗАТИОПРИНА И 6-МЕРКАПТОПУРИНА С ЛИМФОБЛАСТАМИ КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ОСТРОМ ЛЕЙКОЗЕ
Российский государственный медицинский университет Москва,
НИИ клинической онкологии
Современная терапия острых лейкозов предусматривает выбор соответствующей программы специфической терапии, направленной на возможно полную элиминацию лейкозных клеток и меры коррекции или компенсации кроветворной, иммунологической и других функций организма, нарушенных лейкозным процессом и специфической терапией.
К группе иммунодепрессантов — антагонистов пурина — относится 6-меркаптопурин (6-МГТ) и его аналоги, среди которых самый распространенный — азатио-прин (АЗТ). Широкое применение этой группы иммуносупрессивных средств при терапии острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), различных аутоиммунных заболеваний основано на их непосредственном влиянии на синтез ДНК в лимфоидных клетках. Предполагают несколько возможных механизмов цитотоксического действия 6-МП: его химическое превращение в нуклеотид [1] и последующее ингибирование по принципу обратной связи внутриклеточного синтеза эндогенных пуринов [4]; встраивание 6-МП в нуклеиновые кислоты, вызывающее нарушение их структуры [2]. Однако до настоящего времени остаются невыясненными механизм избирательного действия антагонистов пурина на лимфоидные клетки [2], а также причина различной чувствительности опухолевых клеток к этим препаратам.
Известно, что на многих типах лимфоидных клеток, включая лимфоциты, мононуклеарные фагоциты [7], гра-нулоциты [9], представлены пуриновые аденозиновые рецепторы. Пуриновые рецепторы (А'-и А2-подтипы) функционально связаны с аденилатциклазой, следовательно, и с изменением уровня цАМФ в клетке.
В данной работе исследовали роль пуринергического рецепторного звена в механизме взаимодействия 6-МП и АЗТ с лимфобластами костного мозга при остром лейкозе.
Цель данного исследования: 1) изучение специфического связывания селективного лиганда пуриновых рецепторов 3Н-МЕСА лимфобластами; 2) определение относительного сродства 6-МП и АЗТ к пуриновым рецепторам лимфобластов; 3) сравнительное исследование влияния аденозина, 6-МП и АЗТ на внутриклеточное содержание цАМФ.
Материалы и методы. В работе использовали бластные клетки костного мозга больных ОЛЛ. Приблизительно 0,5 мл пунктата отбирали в пробирку и дважды отмывали в НЕРЕЗ-буфере (pH 7,35).
Определение характера связывания 3 Н - N Е С А лимфобластами.В пробы, содержащие по 120 мкл суспензии клеток (конечная концентрация 10—20 млн клеток в I мл), вносили 10 мкл раствора меченого N ЕС А («АтегеЬат» в НЕРЕЗ-буфере до конечных концентраций 0,1—5 мкМ и 10 мкл избытка немеченого аденозина («Бегуа»). Конечная концентрация аденозина в среде инкубации составляла Ы0"6—3 10 5М. Пробы инкубировали в течение 30 мин при температуре 37° С. Специфическое связывание 3Н-НЕСА вычисляли как
L. I. Stankevich, A. S. Dukhanin, N. E. Kushlinsky,
P. V. Sergeev
INTERACTION OF AZATHIOPRINE AND 6-MERCAPTOPURINE WITH BONE MARROW LYMPHOBLASTS IN ACUTE LEUKEMIA
Russian State Medical University, Research Institute of Clinical Oncology, Moscow
The modern therapy for acute leukemia involves certain programs of specific therapy aiming at full elimination of leukemic cells and correction or compensation of the hemopoietic, immunologic and other functions of the body affected by leukemic disease and by the specific therapy undertaken.
The group of purine antagonistic immunodepressants includes 6-mercaptopurine (6-MP) and its analogs with the best known agent azathioprine (AZT). This group of im-munosuppressors is widely used in therapy of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and various autoimmune diseases due to the agents’ direct effect on DNA synthesis in lymphoid cells. There are presumably several mechanisms of the 6-MP’s cytotoxic action including its chemical transformation into nucleotide [1] with further inhibition of intracellular synthesis of endogenous purines [4], 6-MP’s interference in and destruction of nucleic acids [2]. However, the mechanism of selective action of purine antagonists on lymphoid cells is not known yet [2] as well as the reason of different sensitivity of tumor cells to these drugs.
As known, many lymphoid cell types including lymphocytes, mononuclear phagocytes [7], granulocytes [9] bear purine adenosine receptors. The purine receptors (A, and A2 subtypes) are functionally related to adenylatecyclase and therefore contribute to changes in cellular cAMP content.
The purpose of this investigation was to study the role of the purinergetic receptor link in the mechanism of interaction of 6-MP and AZT with bone marrow lymphoblasts in acute leukemia.
The following objectives were set: 1) to study specific binding of the purine receptor selective ligand 3H-NECA by lymphoblasts; 2) to determine relative affinity of 6-MP and AZT to lymphoblastic purine receptors; 3) to compare adenosine, 6-MP and AZT for their effects on intracellular cAMP concentration.
Materials and Methods. We used bone marrow blasts from patients with ALL. About 0.5 ml puncture material was placed into a test tube and washed twice with HEPES buffer (pH 7.35).
Determination of manner of 3H-NECA binding by lymphoblasts. 10 mcl of labeled NECA (Amersham) solution in HEPES buffer (endpoint concentration 0.1—5 mcM) and 10 mcl excess of unlabeled adenosine (Serva) were added to samples containing 120 mcl of cell suspension each (endpoint concentration 10 to 20 mln cells per ml). The adenosine endpoint concentration in incubation medium was lxl 0-6 to 3x1 O'5 M. The samples were incubated for 30 min at 37°C. 3H-NECA specific binding was calculated as the difference between quantities of cell-bound NECA in the absence and in the presence of unlabeled adenosine.
Competitive analysis of the 3H-NECA binding in the presence of the immunodepressants was carried out according to the procedure described above. Endpoint concentrations of 6-MP (Jarma) and AZT (Serva) in incubation medium were lxl 0‘6 to 3x1 O'5 M.
After cessation of incubation sample aliquots (100 mcl) were quickly transferred on CF/C (Watman) filters and washed two times with 2 ml HEPES buffer (t=4°C). The filters were then dried at room temperature
Рис. 1. Специфическое связывание 3H-NECA лимфобластами костного мозга в координатах Скэтчарда.
По оси абсцисс — концентрация связанного лиганда, пмоль/106 клеток; по оси ординат — отношение количества связанного меченого NECA и концентрации свободного 3H-NECA, пмоль/мкМ-106 клеток.
Fig.1. Specific binding of 3H-NECA by bone marrow lymphoblasts in Scatchard coordinates.
Numbers on the x axis show bound ligand concentration, pmol/10 cells; numbers on the у axis show ratio of bound and free labeled NECA concentrations, pmol/mcMx106 cells.
разницу между количеством связанного клетками NECA при отсутствии и в присутствии немеченого аденозина.
Конкурентный анализ связывания 3H-NECA клетками в присутствии иммунодепрессантов проводили по описанной выше схеме. Конечная концентрация 6-МП («Jarma») и АЗТ («Serva») в среде инкубации составляла МО-6—310_5М.
По окончании инкубации аликвоты проб (100 мкл) быстро переносили на фильтры GF/C «Whatman» и дважды отмывали в 2 мл HEPES-буфера (t=4° С). Фильтры высушивали при комнатной температуре и помещали во флаконы со сцинтилляционной жидкостью для определения содержания меченого NECA методом жидкостной радиометрии.
Определение внутриклеточного уровня цАМФ. После 40-минутной предварительной инкубации при 37° С к пробам, содержащим I мл суспензии клеток, добавляли исследуемые вещества в объеме 20 мкл или 20 мкл раствора Хенкса (контрольные пробы). Концентрация клеток составляла 5 млн в I мл среды (раствор Хенкса, pH 7,4). Исследовали влияние аденозина (конечная концентрация 2,510“7, 510-7, 10-*, 210-6М), АЗТ(10~5, 210~5М), NECA(10-7, 310“5М), 6-МП (2,5-10-6, 5 Ю4, 10“5, 2 10-5М) на внутриклеточный уровень цАМФ после 10 мин инкубации клеток с указанными соединениями. По окончании инкубации клетки разрушали в ледяном трис-ЭДТА-буфере (pH 7,5), пробы немедленно помещали на водяную баню при 90° С на 3 мин, затем центрифугировали (10 мин при 800g) и в супернатанте определяли концентрацию цАМФ с помощью стандартных наборов фирмы «Amersham» (Англия).
Для математического описания кинетики взаимодействия веществ с рецепторами было использовано преобразование Скэтчарда [6]. Расчет доверительных интервалов экспериментальных значений и оценку достоверности различий между ними проводили по методу Стьюдента при уровне значимости р=0,05 с помощью стандартных программ математического обеспечения для ЭВМ «Unimex Computer».
Результаты и обсуждение. Анализ специфического связывания NECA лимфобластами в координатах Скэтчарда представлен на рис. 1. График Скэтчарда, характеризующий связывание 3H-NECA лимфобластами, имеет вогнутую форму и разлагается на две составляющие прямые. Такая форма графика позволила предположить существование двух типов мест связывания лиганда, что подтвердилось в дальнейших исследованиях с применением 100-кратного избытка АЗТ и 6-МП.
Таким образом, лимфобласты костного мозга содержат два типа участков связывания 3H-NECA. Тип I —
and placed in vials containing scintillation fluid to measure the labeled NECA by liquid radiometry.
Determination of intracellular cAMP. After 40-min pre-incubation at 37°C 20 mcl of test substances or Henx solution was added to the samples containing 1 ml cell suspension (control samples). Cell concentration was 5xl06 per ml of medium (Henx solution, pH 7,4). Effects of adenosine (endpoint concentration 2.5xl0"7, 5x10‘7, 10‘6, 2xlO"6M), AZT (10"s, 2xlO'5M), NECA (10'7, 3xl0-5M), 6-MP (2.5xl0‘6, 5x 10"6, 10"5, 2x 10"5M) on intracellular cAMP level after 10-min incubation of cells with the mentioned substances were studied. On cessation of incubation the cells were destroyed in glacial tris-EDTA buffer (pH 7,5), the samples were immediately put on water bath at 90°C for 3 min, then centrifuged (10 min at 800 g). Concentration of cAMP was determined in the supernatant using standard kits from Amersham (England).
Mathematical description of substance-receptor interaction kinetics was based on Scatchard transformation [6]. Calculation of confidence intervals of experimental values and evaluation of significance of the differences were performed by Student’s test at p=0.05 using standard Unimex Computer soft-ware.
Results and Discussion. Fig. 1 shows results of analysis of NECA specific binding by lymphoblasts in Scatchard coordinates. The Scatchard curve describing the lymphoblast binding of NECA is concave and has two linear sections. This curve behavior suggests the existence of two types of the ligand binding which was confirmed by further study using a 100-fold excess of AZT and 6-MP.
Thus, bone marrow lymphoblasts have two types of 3H-NECA binding sites. Type I is characterized by high affinity with Cd = 0.53±0.15 mcM and maximal binding capacity Bmax = 0.25 pmol/106 cells. Type II represents low affinity sites with Cd = 6.5±1.0 mcM and Bmax = 1.5±0.2 pmol/106 cells. Ratio of the two types of receptor sites shows individual differences.
Adenosine, 6-MP and AZT concentrations at which 3H-NECA specific binding is 50% of baseline (IC50) were determined by competitive analysis.
Рис. 2. Влияние NECA на содержание цАМФ в лимфобластах костного мозга.
По оси абсцисс — концентрация NECA, мкМ; по оси ординат — концентрация цАМФ, пмоль /107 клеток. Пунктирной линией обозначен базальный уровень цАМФ в лимфобластах.
Fig.2. NECA effect on cAMP content in bone marrow lymphoblasts.
Numbers on the x axis show NECA concentration, mcM; numbers on the у axis show cAMP concentration, pmol/107 cells. Dash line marks lymphoblastic cAMP baseline.
высокоаффинные, характеризующиеся Кд=0,53±0,15 мкМ и максимальной связующей емкостью Втах=0,25 пмоль/106 клеток. Тип II — низкоаффинные с Кд=6,5±1,0 мкМ и Втах=1,5±0,2 пмоль/106 клеток. Соотношение между двумя типами рецепторных участков имеет существенные индивидуальные различия.
С помощью конкурентного анализа определены концентрации аденозина, 6-МП и АЗТ, при которых специфическое связывание 3H-NECA составляет 50% от исходного (1С50).
Относительное сродство изученных соединений ко второму подтипу А2-рецепторов убывает в ряду: 6-МП > аденозин > АЗТ. 1СЯ составляет для NECA 4,2-1 О^М, для аденозина 6,610 6М, для 6-МП 1,310“6М, для АЗТ более 6,0- 10~5М. Следовательно, низкоаффинные участки связывания 3H-NECA являются мишенью действия цитостатика 6-МП.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что избирательная чувствительность лимфобластов костного мозга к 6-МП может определяться наличием на их поверхности специфических участков связывания цитостатика.
Повышение уровня цАМФ в лимфобластах костного мозга под действием NECA имеет двухфазный характер. График зависимости внутриклеточной концентрации цАМФ от концентрации NECA представлен на рис. 2. В диапазоне концентраций 10~7—10-6М NECA вызывает повышение уровня цАМФ до значений 3,2—3,8 пмоль/ 107 клеток. Базальный уровень цАМФ в лимфобластах достоверно ниже чем в лимфоцитах и составляет 2,0— 2,3 пмоль/107 клеток. Увеличение концентрации NECA до 10~6—10_5М приводит к дальнейшему подъему уровня цАМФ в пределах 4,9—5,7 пмоль/107 клеток, т. е. в среднем в 2,5 раза.
В таблице приведены результаты исследования влияния иммунодепрессантов на содержание цАМФ в лимфобластах костного мозга. Видно, что действие 6-МП на уровень цАМФ носит дозозависимый характер и наиболее выражено при концентрации препарата 10'5М, что соответствует терапевтической дозе препарата [3, 5, 8]. Повышение содержания цАМФ, вызванное АЗТ, достоверно ниже.
Индуцированное агонистами пуриновых рецепторов увеличение внутриклеточного уровня цАМФ приводит к снижению функциональной активности лимфоидных клеток и в конечном итоге к цитолизу. Таким образом, избирательное иммуносупрессивное действие аналогов аденозина, в том числе 6-МП и АЗТ, может определяться их способностью модулировать активность аденилат-циклазы лимфобластов.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Герасимова Г. К., Матвеев Л. В., Сидорова Т. А., Голенко О. Д. II Экспер. онкол. — 1982. — Т. 4, № 4. — С. 29—33.
2. Герасимова Г. К., Сидорова Т. А., Волкова М. А. и др. // Вести. АМН СССР. — 1984. — № 5. — С. 78—85.
3. Махонова Л. А. II Педиатрия. — 1991. — № 11. — С. 54—58.
4. Наполов Ю. К., Борисов К. Б. И Фармакол. и токсикол. — 1991. — № 4. — С. 80—87.
5. Румянцев А. Г. II Педиатрия. — 1980. — № 5. —С. 57—62.
6. Сергеев П. В., Шимаиовский Н. Л. Рецепторы. — М., 1987.
7. Lappin D., Whaley К. // Clin. exp. Immunol. — 1984.—N 2.— P. 454—460.
Таблица
Table
Влияние иммунодепрессантов на содержание цАМФ в лимфобластах костного мозга (М ± т)
Immunodepressants’ effect on cAMP content in bone marrow lymphoblasts (X±SD)
Условия опыта
Уровень цАМФ, пмоль/107 клеток
концентрация препарата
Ю^М 10“5M
6-МП (n=5) 6-MP (n=5) 2,3 + 0,2(110) 4,3 ± 0,3*(205)
A3T (/1=5) AZT (л=5) 3,1 ± 0,2* (148) 3,3 ±0,2* (157)
Контроль Control 2,1 ±0,2
Ю^М 10‘5M
Test conditions drug concentration
cAMP level, pmol/107 cells
Примечание. "“Достоверное отличие от контроля при р < 0,05.В скобках указана степень прироста внутриклеточного уровня цАМФ в процентах к контролю.
Note. *, the difference from control is statistically significant at p. Numbers in parentheses show percentage of intracellular cAMP increment as compared to control.
Relative affinity of the test compounds to 2 receptor subtypes is reducing, as follows: 6-MP > adenosine >AZT. IC50 is 4.2xlO_6M for NECA, 6.6xlO_6M for adenosine, 1.3xlO'6M for 6-MP and more than 6.0x10‘5M for AZT. Therefore, the low affinity 3H-NECA binding sites are targets of the cytostatic 6-MP action.
Our experimental findings prove that the selective sensitivity of bone marrow lymphoblasts to 6-MP is determined by the presence of specific binding sites on their surface.
The cAMP content in bone marrow lymphoblasts was increasing under the effect of NECA in a two-phase mode. Fig. 2 shows the rise in intracellular cAMP concentration with respect to NECA concentration. In a concentration range of 10'7 to 10_6M NECA induced increase in cAMP to 3.2—3.8 pmol/107 cells. The rise in the NECA concentration upto 10'6—10‘5 led to further rise in cAMP to 4.9—5.7 pmol/107 cells, i.e. two-fold on the average.
The table summarizes data on immunodepressants’ effect on cAMP content in bone marrow lymphoblasts. The 6-MP effect on the cAMP level was dose-dependant and reached peak at a concentration 10'5M which corresponds to the drug therapeutic dosage [3,5,8]. The rise in cAMP under the effect of AZT was significantly lower.
The rise in intracellular cAMP concentration induced by purine receptor agonists leads to decrease in functional activity of lymphoid cells and eventually to cytolysis. Thus, the selective immunosuppressing action of adenosine analogs including 6-MP and AZT may be determined by their ability to modulate activity of lymphoblastic adenylatecyclase.
8. Marone G. II Int. ]. clin. Lab. Res. — 1992. — Vol. 22. P. 235—242.
9. Marone G., Vigorita S., Antonelli C., Torela G. et al // Life Sci. 1985. — Vol. 36, N 4. — P. 339—345.
Поступила 06.04.94 / Submitted 06.04.94
