CC BY
88РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Сибирское отделение Сибирский институт физиологии и биохимии растений
На правах рукописи УДК 577.1
ВЕРХОТУРОВ Василий Владимирович
ВЗАИМНОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ
Специальность: 03.00.12 - Физиология растений 03.00.04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Иркутск 1999
Работа выполнена в лаборатории по исследованию биологически активных веществ Якутской государственной сельскохозяйственной академии
Научный руководитель: кандидат химических наук,
профессор, Рогожин. В. В.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
Романенко А. С.
доктор биологических наук, профессор, академик АН РС(Я) Кершенгольц Б. М.
Ведущая организация: Иркутский государственный
университет им. А. А. Жданова
Защита диссертации состоится 8 декабря 1999 г в 1400 час. на заседании диссертационного совета Д.003.25.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу:
664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова 132 а/я 1243. СИФИБР
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН
Автореферат разослан ____________ 1 999 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук:
Акимова. Г. П.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Период прорастания семян делится на три этапа: 1) активация метаболизма (этап физического набухания семян); 2) подготовка к началу роста растяжением (наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша); 3) собственно рост органов проростка (Обручева, Антипина, 1997). Во влажных семенах наблюдается активное потребление кислорода, который может вызывать окислительное повреждение тканей (Барабой, 1991). В развитии окислительного стресса играют роль активные формы кислорода: О21, О2-, Н2О2, НО-, НОИ и др. (Зенков, Меньшиков, 1993). Накопление АФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран. Супероксидные радикалы модифицируют белки (Дубинина, Шугалей, 1993), нарушают структуру ДНК, разрушают гормоны и другие функционально активные вещества (Владимиров, Арчаков, 1 972). Поэтому изучение проявления компенсаторных механизмов в семенах на действие АФК является общебиологической задачей.
При прорастании семян в них генерируются активные формы кислорода, защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной антиоксидантной системы, состоящей из низко- и высокомолекулярных соединений (Inze, Van Montagu, 1 995). К группе низкомолекулярных антиоксидантов относятся дигоксин, аскорбиновая кислота, гидрохинон, мочевая кислота, мелатонин, глутатион и др.(Кения и др., 1993). В комплекс высокомолекулярной системы антиоксидантной защиты входят ферменты: каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза и др. (Андреева, 1988; Калашникова и др., 1999; Dhindsa et al., 1981). Действие компонентов системы антиоксидантной защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях (Бурлакова и др., 1975; Кения и др., 1993). Однако роль антиоксидантов в механизмах покоя и прорастания семян пшеницы мало изучена. Хотя известно, что многие из низкомолекулярных антиоксидантов могут быть субстратами пероксидазы (Андреева, 1988; Запрометов, 1993). Являясь компонентами единой антиоксидантной системы растений, низко- и высокомолекулярные антиоксиданты способны оказывать взаимное влияние. Однако механизм этого взаимодействия недостаточно изучен.
Пероксидаза входит в состав антиоксидантной системы растений, активность которой определяет их уровень устойчивости к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза (Савич, 1989). Обладая широкой субстратной специфичностью, фермент может проявлять свойства оксидазы (Березин и др., 1975). Активность пероксидазы возрастает с увеличением дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя (Иванова, Вафина, 1 997). Однако мало изучена роль пероксидазы в механизме действия антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы и не раскрыта роль низкомолекулярных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении роли антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы, установлении закономерностей проявления ее реактивности на действие низких температур и биологически активных веществ, а также в раскрытии роли пероксидазы и антиоксидантов в механизмах формирования покоя семян пшеницы. В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:
1 . Изучить количественные закономерности проявления пероксидазной активности в процессе набухания и прорастания семян пшеницы.
2. Исследовать количественные показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантов в проростках пшеницы.
3. Установить количественные закономерности проявления индивидуальной реактивности проростков на действие низких положительных температур.
4. Изучить влияние антиоксидантов на каталитические свойства пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного окисления.
5. Выявить закономерности взаимного влияния низко- и высокомолекулярных антиоксидантов, входящих в единую систему антиоксидантной защиты живых организмов.
6. Исследовать влияние экзогенных антиоксидантов на прорастание и всхожесть семян пшеницы.
Научная новизна. Пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты осуществляется, если с окисленными формами пероксидазы (Е1 и Е2) связываются одна или две молекулы аскорбиновой кислоты. При связывании двух молекул субстрата наблюдается активирование фермента, тогда как связывание нескольких молекул субстрата ингибирует пероксидазу. При совместном присутствии аскорбиновая кислота и гидрохинон окисляются последовательно. Гидрохинон активирует окисление аскорбиновой кислоты, тогда как её избыток ингибирует пероксидазу. Показано, что антиоксиданты и пероксидаза входят в единую систему антиоксидантной защиты растений, где выполняют строго специализированные функции. Пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, контролирует уровень перекиси водорода и антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а антиоксиданты, накапливаясь в тканях, участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов. При этом антиоксиданты могут регулировать активность пероксидазы, осуществляя, таким образом, общий контроль над деятельностью системы антиоксидантной защиты.
Предложен механизм формирования покоя семян, заключающийся в том, что антиоксиданты в высоких концентрациях, понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть.
Практическая ценность. Установлено, что, насыщая зерна ксенобиотиками можно добиваться повышения их посевных качеств, а также сопротивляемости зерен и растений к экзогенным патогенным факторам. Полученные данные позволяют предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах функционально активных веществ, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа набухания. Замачивание семян на это время не принесет им существенного вреда и не повлияет на посевные качества. Обработка семян пшеницы биологически активными веществами в течение первых двух часов будет способствовать повышению их всхожести. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для повышения сопротивляемости семян и проростков пшеницы к действию неблагоприятных факторов среды и увеличению их урожайности. Защищаемые положения. Низкомолекулярные антиоксиданты способны регулировать активность пероксидазы, что проявляется в реакциях индивидуального и совместного окисления субстратов in vitro и in vivo. Взаимное влияние низкомолекулярных антиоксидантов и пероксидазы является одним из регуляторных механизмов прорастания семян пшеницы.
Апробация. Основные результаты диссертационной работы были доложены на совместном заседании кафедры агробиохимии и лаборатории исследования биологически активных веществ ЯГСХА (1997 г), на научно - практической конференции агротехнологического факультета секции "Физиология и биохимия растений" (Якутск 1997 г), на межвузовской конференции молодых ученых ЯГУ (1998 г), на семинаре отдела физиологии и биохимии Института биологии ЯФ СО РАН (1998 г), на семенаре Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (1999 г.), на II-ой Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва 1999 г). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста,
состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 12 схем, 39 рисунков и 1 4 таблиц. Список литературы состоит из 265 источников, в том числе 1 24 зарубежных авторов.
Список сокращений: АФК- активные формы кислорода; ПО - пероксидаза; ПОЛ -перекисное окисление липидов; ТБК - тиобарбитуровая кислота; МДА - малоновый диальдегид; АО - антиоксиданты; ОДН - о-дианизидин; АК - аскорбиновая кислота; ГХ -гидрохинон; 2,4-ДНФ - 2,4-динитрофенол; УФ-облучение - ультрафиолетовое облучение; АДГ - алкогольдегидрогеназа; Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; kcat, k'cat -каталитические константы скорости реакции окисления одной и двух молекул АК соответственно; в - численная константа; Vm - максимальная скорость; Km - константа Михаэлиса; Km1, Km2 - константы Михаэлиса при связывании одной и двух молекул АК соответственно; n - количество молекул АК, ингибирующих пероксидазу.
Материал и методы исследования
В работе использовали НАД, НАДФ, глюкозо-6-фосфат, пероксидазу - фирмы "Reanal" (Венгрия), о-фенантролин - фирмы "Serva" (Германия), тритон Х-100 - препарат фирмы "Ferak Berlin" (Западный Берлин), этанол очищали перегонкой, о-дианизидин марки ч. очищали возгонкой в вакууме, остальные реактивы соответствовали квалификации о.с.ч.; для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду.
Объектом исследования служили семена пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Омская 12. Для индукции перекисного окисления липидов семена с влажность 5-6% помещали под ртутнокварцевую лампу БНПО2-30-001У3.5, (Россия) с интенсивностью облучения 30 Вт/м2, расположенной на расстоянии 25 см от семян. Контрольные и опытные (после УФ-облучения) семена вначале замачивали на дистиллированной воде 24 ч, а затем проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при 23 °С при естественном освещении, смачивая их дистиллированной водой (10 мл на чашку Петри). Число семян в одной чашке - 100.
Для анализа продуктов тиобарбитуровой кислоты и антиоксидантов 1 г семян или сырой массы проростков гомогенизировали в фарфоровой ступке с 3 мл 50%-ного раствора этанола, гомогенат центрифугировали 10 мин при 7000 g. Супернатант для исследования активности пероксидазы получали аналогично, используя 0.1 М натрий-фосфатный буфер рН 7.0.
Содержание малонового диальдегида исследовали по реакции с тиобарбитуровой кислотой при 532 нм, е = 155 мМ-1см-1 (Владимиров, Арчаков, 1972) с нашими модификациями. К 0.5 мл супернатанта последовательно добавляли 0.5 мл 1%-ного раствора тритона Х-100, 0.2 мл 0.6 М НО и 0.8 мл 0.06 М ТБК. Смесь нагревали на кипящей водяной бане 10 мин. Реакцию останавливали охлаждением при температуре 150С 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0.2 мл 5 мМ трилона Б и 5-10 мл 96%-ного этанола. Контролем служила пробирка, в которую добавляли те же растворы, кроме ТБК. Содержание МДА в проростках выражали в нмоль/г сухой массы.
Анализ антиоксидантов проводили по методике (Ермаков, 1987). К 0.2 мл супернатанта последовательно добавляли 0.2 мл 0.5%-ного о-фенантролина в 96%-ном этаноле и 0.2 мл 0.2%-ного FeCl3 в 96%-ном этаноле. Затем обьем доводили до 3 мл 96%-ным этанолом и выдерживали 1 0 мин в темноте. Расчет антиоксидантов проводили по калибровочному графику, построенному для кверцетина. Количество антиоксидантов, содержащихся в проростках, рассчитывали в мкг/г сухой массы.
Активность пероксидазы определяли при 220С по начальной скорости окисления о-дианизидина или аскорбиновой кислоты перекисью водорода. К 2.0 мл 0.1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), добавляли 0.2 мл раствора супернатанта и 0.1 мл 0.43 мМ раствора о-дианизидина в 96%-ном этаноле или 0.1 мл 5.5 мМ раствора аскорбиновой кислоты. Реакцию инициировали введением 0. 1 мл 1 6 мМ перекиси водорода. Окисление о-дианизидина регистировали по увеличению поглощения при 460 нм, е = 30 мМ-1см-1
(Лебедева и др., 1977), а аскорбиновой кислоты по уменьшению поглощения при 265 нм, е = 7000 М-1см-1 (Досон и др., 1991). За единицу активности фермента принимали количество о-дианизидина или аскорбиновой кислоты (мкмоль), окисленных за 1 мин 1 г сухой массы. Активность алкогольдегидрогеназы определяли, как описано в работе (Кершенгольц, Рогожин, 1979). Активность глюкозо-6-фосфатдегирогеназы определяли по методике (Рогожин, 1996). Содержание эндогенной аскорбиновой кислоты в семенах определяли по методике (Полевой, Максимов, 1978).
Спектрофотометрические исследования проводили на двухлучевом спектрофотометре БМБ 100 Б фирмы "Уапап" (США).
В таблицах приведены средние значения и их стандартные ошибки, полученные из 4-х отдельных опытов, каждый из которых состоял из четырех повторностей (чашек Петри), статистическую ошибку для средней проводили по методике (Лакин, 1 990), используя ППП Снедекор У2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Состояние антиоксидантной системы при прорастании семян пшеницы
1.1 Активность пероксидазы и содержание низкомолекулярных антиоксидантов при
набухании семян пшеницы
Наличие высокой активности пероксидазы в семенах и проростках пшеницы позволяет предположить об участии фермента в метаболических процессах, происходящих во время покоя семян и в период их активного прорастания. Нами изучена динамика активности пероксидазы и содержание АО в семенах пшеницы в течение 24 часов набухания при 50 (I группа) и 230С (II группа). Процесс набухания семян, замоченных в дистиллированной воде, сопровождается возрастанием активности фермента (рис. 1 ).
4-
_0
о о го
о
£ 3,5 о
с; о
3-
2,5
1
12 16 20 24 Время, ч
Рис. 1 . Активность пероксидазы зерен пшеницы сорта Омская 1 2 в зависимости от времени набухания при 50С (1) и 230С (2).
4
8
Определены величины каталитических констант пероксидазы зерен пшеницы в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты. Показано, что Кт мало изменяется в исследованном диапазоне рН 5-7. Кт по о-дианизидину незначительно отличается от константы Михаэлиса, определенной для очищенного препарата пероксидазы хрена фирмы "ЯеапаГ', тогда как Кт по АК в 5-9 раз ниже показателей очищенного препарата. Такие различия можно объяснить присутствием в гомогенате посторонних субстратов пероксидазы, участвующих в совместном окислении аскорбиновой кислоты.
Активность пероксидазы и содержание АО в зародыше у семян I группы было выше в 1.5 раза. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и кожуре в 1.5 и 1.8 раза соответственно (табл. 1). Пероксидаза входит в состав антиоксидантной системы, активность которой определяет уровень устойчивости растений к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза. Фермент может проявлять свойства оксидазы. Поэтому активность пероксидазы возрастает с увеличением дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя.
Таблица 1 .Биохимические показатели органов семян пшеницы сорта Омская 12 после 24 часов замачивания зерен в дистиллированной воде при разных температурах.
Орган ПО мкмоль/мин г сухой ПОЛ нмоль/ г сухой АО мкг/г сухой массы
массы массы
Температура, 0С
5 23 5 23 5 23
Сухое зерно 3.70±0.21 3.60±0.25 25.3±1.8 21.8±1.1 85.2±3.2 88.3±3.8
Кожура 0.44±0.03 0.25±0.02 23.4±1.5 25.5±1.6 160.7±12.1 176.2±13.4
семени
Эндосперм 0.42±0.03 0.28±0.03 19.6±1.2 20.7±1.3 133.3±6.5 124.3±11.3
Щиток 22.2±0.12 21.7±0.11 - - 256.4±15.2 256.4±18.8
Зародыш 59,3±0.45 39.0±0.32 95.3±5.4 117.4±8.5 398.4±24.7 285.7±21.5
1.2 Активность пероксидазы и содержание низкомолекулярных антиоксидантов при
прорастании семян пшеницы
Активность пероксидазы в проростках пшеницы, семена которых замачивали при 50 и 230С, проявлялась в своеобразной динамике и зависела от природы исследуемых частей пшеницы (зерно, надземная часть или корни) (рис. 2). Отмечался линейный рост активности пероксидазы в зерне с небольшим опережением у зерен II группы (рис. 2а). Зависимости активности пероксидазы надземной части проростков пшеницы имели вид "качелей" с постепенным снижением в первые 3-4 дня, а затем повышением к 7-му дню прорастания проростков (рис. 2б). Причем более высокие показатели активности пероксидазы были у семян II группы. Своеобразная динамика проявлялась в активности пероксидазы корней (рис. 2в).
В корнях семян II группы в первые 2-3 дня понижалась активность пероксидазы и только на 7-ой день отмечался рост. Зависимость активности пероксидазы у корней семян I группы принимала вид затухающих колебаний с возрастанием активности на 3-й и 6-й день, с понижением к седьмому дню прорастания корней до нормы. Причем активность пероксидазы в корнях семян I группы была в 1.5-2.5 раза выше, чем у корней семян II группы. Нами отдельными экспериментами было показано отсутствие в супернатанте активаторов и ингибиторов пероксидазы. Поэтому мотивацией к повышению активности пероксидазы, по-видимому, является проявление компенсаторных антиоксидантных механизмов, направленных на предотвращение развития окислительного повреждения тканей (Бурлакова и др., 1975), вызванных воздействием низких температур.
Поскольку ключевую роль в развитии окислительного повреждения играют активные формы кислорода:
О ■, Н2О2, НО-, органические радикалы, образование которых наиболее интенсивно протекает в корнях растений (Минибаева и др., 1997). Увеличение активности пероксидазы может быть вызвано синтезом на холоде в семенах пшеницы новых изоферментов пероксидазы или накоплением соединений, являющихся субстратами фермента, индуцирующих её синтез, что будет проявляться в возрастании активности пероксидазы (Андреева, 1988). Однако высокие концентрации субстратов пероксидазы могут
ингибировать фермент, способствуя, таким образом, увеличению концентрации перекиси водорода в клетках.
А
60 50 40 30 20 10 0
.х-
140
Р\2 120
100
' X
/ 80
; 1 * 60
40
20
-1—1 0
1 2 3 4 5 6 7
—I-1-1-1-1-1
2 3 4 5 6 7
240 200 160 -120 -80
В
2 3 4 5 6 7
Время прорастания, сут. Рис. 2. Динамика активности пероксидазы (мкмоль/мин г сухой массы) в зерне (А), надземной части (Б) и корнях (В) проростков пшеницы сорта Омская 12 в зависимости от их времени прорастания. Семена предварительно замачивали в дистиллированной воде при 50С (1) и 230С (2) в течение 24 ч, а проращивали при 230С.
Подтверждением высказанных предположений являются результаты по динамике содержания МДА и АО в корнях и надземной части проростков пшеницы зерен I и II групп (рис. 3). Видно, что показатели уровня ПОЛ и содержания АО находятся в прямой зависимости (г=0,5).
Повышение содержания АО преимущественно сопровождается повышением ПОЛ, тогда как активность пероксидазы возрастает с уменьшением содержания антиоксидантов (г=-0,65). В случае увеличения содержания АО отмечается понижение активности пероксидазы, а увеличение активности пероксидазы сопровождается понижением уровня ПОЛ (г=-0,65).
500 400 300 200 100 -0
МДА нмоль/г сухой массы
300 п
200 -
100 -
АО мкг/г сухой массы
Х---Х
2
200
100 -
х- -
400
200
X Г
А 2
•V * V
X'
34567
3 4 5 6 7
Время прорастания, сут.
0
0
0
Рис. 3. Влияние температуры замачивания семян пшеницы сорта Омская 12 на содержание малонового диальдегида и антиоксидантов в их надземной части (А, Б) и корнях (В, Г) этиолированных проростков. Условия те же, что на рис. 2.
Величины показателей корреляции, возможно, были выше, если бы при проведении анализа учитывалось влияние всех компонентов антиоксидантной системы (супероксиддисмутаза, каталаза и т д). Наблюдаемые изменения, возможно объяснить в рамках единого представления о роли пероксидазы и АО, являющихся компонентами антиоксидантной системы, в регулировании процессов перекисного окисления в живых организмах. Пероксидаза способна использовать в качестве субстратов антиоксиданты и перекись водорода. Фермент катализирует реакцию, в которой АО окисляются, а перекись водорода восстанавливается до воды. Однако в высоких концентрациях антиоксиданты способны ингибировать фермент и таким образом способствуют увеличению уровня ПОЛ в клетках. Взаимная регулируемость компонентов антиоксидантной системы позволяет контролировать ПОЛ в живых организмах и поддерживать его на определенном постоянном уровне.
1.2.1 Каталитические свойства пероксидазы проростков пшеницы
Нами изучены каталитические параметры пероксидазы 7-ми суточных проростков пшеницы. В качестве субстратов использовали аскорбиновую кислоту (медленно окисляемый) и о-дианизидин (быстро окисляемый субстрат). Показано, что различия в величинах Кт по ОДН пероксидазы проростков пшеницы (надземная часть и корни) (табл. 2), а также Ут проростков пшеницы семян I и II групп незначительны. Основные изменения наблюдаются у Кт по АК пероксидазы корней пшеницы зерен I и II групп. Величины Кт зерен I группы выше в 1.5-2 раза, по сравнению с зернами II группы. Значения Ут по ОДН и по АК пероксидазы корней пшеницы зерен I группы в 1.5-2 раза выше, чем корней пшеницы зерен II группы. Тогда как Кт по АК пероксидазы корней пшеницы зерен II группы в 2-7 раз ниже, у пероксидазы надземной части проростков этой же группы. Следует отметить различия в показателях Кт по ОДН корней пшеницы, которые были в 1.5-3 раза выше, чем у пероксидазы хрена. Так же можно отметить сильные различия в Кт по АК для пероксидазы хрена, и из надземной части и корней проростков пшеницы. У корней пшеницы зерен I и II групп Кт по АК в 3-13 и 6-19 раз ниже соответственно, чем у пероксидазы хрена.
Таблица 2. Величины Кт (мкМ) реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты, катализируемых пероксидазой зерен и 7-ми суточных проростков (надземная часть и корни) пшеницы сорта Омская 1 2.
рН Сухое зерно Проростки пшеницы Корни хрена**
Надземная часть Кор ни
ОДН АК ОДН* ОДН АК ОДН* АК* ОДН АК ОДН АК
5.0 54±2 38±2 62±2 94±3 263±12 22±1 70±2 62±2 33±2 40±2 340±18
5.5 59±3 35±2 137±4 115±3 161±9 67±3 51±2 124±4 27±2 45±2 170±8
6.0 57±2 30±2 49±2 64±2 33±2 65±2 15±1 67±2 11±1 40±2 190±11
7.0 39±1 26±1 12±1 36±2 24±1 52±2 18±1 39±2 12±1 30±1 230±14
* зерна пшеницы замачивались при 5°С, ** пероксидаза хрена - препарат фирмы "Reanal".
Такую высокую разницу в значениях Km можно объяснить, во-первых, за счет того, что в исследованиях были использованы гомогенаты корней пшеницы, содержащие весь спектр изоферментов пероксидазы. Тогда как пероксидаза хрена являлась очищенным препаратом, в составе которого преимущественно изоферменты С и В (Андреева, 1988). Во-вторых, наличием в гомогенате тканей большого количества антиоксидантов, являющихся субстратами пероксидазы, в присутствии которых скорость окисления ОДН и АК может возрастать (Лебедева, Угарова, 1996).
1.3 Роль пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов в защите проростков от
окислительного стресса.
Поскольку пероксидаза и антиоксиданты входят в единую систему защиты растений от окислительного стресса, то нами изучено их участие в регулировании уровня ПОЛ на 3-5 день прорастания проростков пшеницы (рис. 4).
Время прорастания, сут.
Рис. 4. Динамика содержания антиоксидантов (1,1'), активности пероксидазы (2,2') и малонового диальдегида (3,3') в надземной части (А) и корнях (Б) проростков пшеницы сорта Омская 12. Предварительно зерна пшеницы замачивали в дистиллированной воде при 50С в течение 24 ч, проращивание проводили при 280С.
Видно, что в надземной части проростков пшеницы уровень АО на 4-5 сутки понижается в 1.4-1.5 раза, при повышении активности пероксидазы в 1.8 раза. По-видимому, в этот период контроль за уровнем ПОЛ в побегах резко снижается, что проявляется в возрастании содержания МДА в 1.5 раза. В корнях проростков пшеницы на 4-й день прорастания уровень ПОЛ возрастает в 1.5 раза, при этом содержание АО и активность пероксидазы понижаются в 2.4 и 1.2 раза соответственно.
Таким образом, контроль над уровнем ПОЛ в проростках пшеницы осуществляют как низкомолекулярные антиоксиданты, так и пероксидаза. При этом известно, что в надземной части больше содержится АО и меньше пероксидазы, чем в корнях проростков пшеницы. Поэтому ведущая роль в регулировании ПОЛ в надземной части преимущественно выполняют низкомолекулярные антиоксиданты, где за счет активного фотосинтеза идет их накопление. Тогда как в корнях эта функция возложена на пероксидазу, высокая активность которой обеспечивает поддержание определенного уровня ПОЛ. Поскольку высокие концентрации АО могут ингибировать пероксидазу, то, по-видимому, накопление или понижение содержания АО в проростках, может регулировать активность фермента.
Для подтверждения этого предположения мы изучили влияние низкой температуры (+5°С) во время 24 ч набухания зерен на динамику уровня ПОЛ, АО и активность пероксидазы проростков пшеницы в течение 3-5 суток прорастания. Как видно из рис. 5 в основном, наблюдаются взаимозависимые колебания исследованных параметров. При этом в корнях и надземной части понижение активности пероксидазы сопровождается возрастанием уровня ПОЛ, а повышение содержания АО приводит к понижению активности пероксидазы. Понижение активности пероксидазы чаще всего наблюдается при повышении уровня АО, что можно объяснить ингибированием фермента высокими концентрациями антиоксидантов.
200
150
100
50
0
200 150 100 50 0
А
200
150
100
50
0 200
150
100
50
0
3 4 5
Время прорастания, сут.
Рис. 5. Динамика содержания малонового диальдегида (1), активность пероксидазы (2) и антиоксиданты (3) в корнях проростков пшеницы сорта Омская 12 в зависимости от времени проращивания, в % от контроля. Зерно замачивали при 50С, время, ч: А - 6, Б - 12, В - 18, Г -24. Проращивание семян проводили при 280С.
1
2
3
5
2. Низкомолекулярные антиоксиданты - субстраты пероксидазы
2.1 Пероксидаза в реакциях индивидуального окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона
2.1.1 .Аскорбиновая кислота как медленно окисляемый субстрат пероксидазы Из данных приведенных в таблице 3 видно, что аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом пероксидазы. Пероксидазное окисление АК зависит от числа молекул субстрата взаимодействующих с окисленными формами фермента (Е1 и Е2). При связывании двух и более молекул АК наблюдается активирование фермента. Однако связывание нескольких (6-9) молекул АК ингибирует пероксидазу (рис.6).
Таблица 3. Величины каталитических констант для пероксидазного окисления аскорбиновой
кислоты
рН КШ1 мкМ КШ2 мкМ с-1 к cat с-1 в п
4.0 - 420±34 - 24.7±2.1 - -
4.5 - 380±28 - 20.2±2.0 - -
5.0 9.7±0.4 340±31 2.1±0.12 17.6±1.5 18.6±1.4 8
5.5 10.8±0.5 170±12 1.9±0.11 6.8±0.3 4.5±0.3 7
6.0 6.1±0.3 190±10 1. 1±0.11 8.4±0.9 12.4±0.9 6
6.5 - 150±13 - 4.0±0.2 - -
7.0 11.5±0.4 230±18 1.1±0.10 3.7±0.1 7.5±0.5 9
8.0 - 97±7 - 3.8±0.1 - -
Связывание одной молекулы АК с Е1 достаточно прочное, поскольку Кт1 составляет 6.111.5 мкМ, что соизмеримо с величинами констант связывания быстро окисляемого субстрата пероксидазы о-дианизидина, у которого Кт при рН 3.7-7.0 составляет 11-20 мкМ (Лебедева и др.,1977). Дополнительное связывание других молекул АК в 40-50 раз хуже. Причем Кт связывания субстрата с окисленными формами фермента мало зависит от рН. Если с ферментом связываются более одной молекулы субстрата, то последующее каталитическое превращение АК улучшается. Количество связавшихся молекул, ингибирующих фермент, зависит от рН.
Следует отметить, что при окислении медленно окисляемых субстратов, таких как аскорбиновая кислота, в механизме действия пероксидазы заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое значение. Константа связывания АК с окисленными формами пероксидазы соизмерима с Кт быстро окисляемых органических субстратов фермента, поэтому предварительное связывание АК с полуокисленными формами пероксидазы (Е1 и Е2) может препятствовать их пероксидазному окислению. При связывании двух молекул АК процесс пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты будет ускоряться, а избыток АК понижает каталитическую активность фермента. По-видимому, данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях.
Рис. 6. Ингибирование реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты ее избытком. Штриховая линия является теоретической при условии образования неактивного фермент-субстратного комплекса. рН 5.5, 0.1 М натрий-ацетатный буфер; пероксидаза - 0.1 мкМ; перекись водорода - 0.64 мМ; аскорбиновая кислота - 22.0-352.0 мкМ.
2.1.2. Гидрохинон - быстро окисляемый субстрат пероксидазы.
Реакция пероксидазного окисления гидрохинона характеризуется высокими кс^ (12202225 с-1), что позволяет отнести этот субстрат к группе быстро окисляемых субстратов пероксидазы, таких как о-дианизидин, у которого кс^ при рН 3.7-7.0 составляет 625-3540 с-1 (Лебедева и др., 1977). Величина Кт для гидрохинона достаточно низкая и составляет 150650 мкМ в зависимости от рН, что по величине соизмерима с константой Михаэлиса для ферроцианида калия (Угарова и др., 1977). Однако это в 10 раз хуже, чем Кт у о-дианизидина. Кт и кса пероксидазного окисления гидрохинона мало зависят от рН. Оптимум каталитической активности фермента приходится на рН 4.5-5.5. Связывание 2-3 молекул субстрата с фермент-субстратным комплексом ингибирует пероксидазу. Количество молекул гидрохинона, ингибирующих фермент, зависит от рН, что возможно, вызвано изменениями в
протяженности субстратсвязывающего участка активного центра фермента, уменьшающегося в кислых рН.
2.2 Пероксидаза в реакциях совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона
Нами изучено совместное окисление аскорбиновой кислоты и гидрохинона (рис. 7). Показано, что в этих реакциях осуществляется упорядоченный процесс окисления субстратов, который определяет преимущественное окисление медленно окисляемого субстрата. Предварительное связывание АК в активном центре фермента улучшает в 28-420 раз последующее связывание молекул гидрохинона. Связавшись, гидрохинон не оказывает влияние на связывание второй молекулы АК, что выражается в неконкурентном типе активирования.
АК '
М-1
Рис. 7. Зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления АК при различных концентрациях гидрохинона, мкМ: 1-0, 2-2.0, 3-8.0, 4-12.0. Концентрации: пероксидаза-94 нМ, перекись водорода-0.64 мМ, АК-2.2-176 мкМ, рН 5.5.
Очередность задается тем, что связывание АК с окисленными формами пероксидазы почти на два порядка лучше, чем гидрохинона. Присутствие гидрохинона в активном центре фермента способствует ускорению окисления молекул АК в 4-41 раз. Особенно этот эффект проявляется при рН 5.5-7.0. Оптимум активирования приходится на рН 6-7. Высокие концентрации АК ингибируют фермент как в реакциях индивидуального, так и совместного с гидрохиноном пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты. Причем, если в реакциях индивидуального окисления АК, фермент при рН 6-7 ингибируют 6-9 молекул субстрата, то в реакциях совместного окисления АК и гидрохинона ингибирование пероксидазы возможно лишь двумя молекулами аскорбиновой кислоты.
Пероксидаза хрена способна катализировать окисление органических соединений не только перекисью водорода, но в отдельных случаях и кислородом воздуха (Березин и др., 1975). Высказывается предположение, что для выполнения столь разнообразных функций у фермента имеется два различных активных центра (Рамазанова и др., 1971; Siegel, Galston, 1 967). В некоторых реакциях для проявления каталитической активности пероксидазе требуются ионы металлов, такие как Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ca2+ и др. или сложные органические соединения, вступающие во временное взаимодействие с ферментом. Проявление ответной реакции пероксидазы на различные соединения, которые могут активировать или ингибировать фермент позволяет отнести его к числу регуляторных (Андреева, 1988). Поэтому активирование пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты высокими концентрациями субстрата и
гидрохинона позволяет предположить наличие вблизи активного центра фермента регуляторного участка, связывание с которым субстратов может повышать или понижать его активность.
Следует особо подчеркнуть биологическое значение наблюдаемого эффекта активации пероксидазы в реакциях окисления медленно окисляемого субстрата в присутствии быстро окисляемого и ингибирование активности фермента высокими концентрациями субстрата. Выявленные закономерности позволяют понять механизм действия большого количества соединений, используемых в предпосевной обработке семян и обладающих стимулирующим, ретардантным, ингибирующим действием в отдельности, а также в различных сочетаниях (Михно,1997). Пероксидаза входит в состав комплекса ферментов катализирующих окисление различных соединений, используемых в аэробных метаболических процессах, интенсивность которых возрастает в процессе набухания и прорастания семян (Gibson, Liu, 1978).
До сих пор являются спорными вопросы относительно эффектов активирования всхожести семян низкими концентрациями соединений и механизмы понижения их всхожести при использовании высоких концентраций веществ. На основании полученных данных можно предложить механизм участия пероксидазы в этих процессах. Так как фермент является показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах и активность которого увеличивается при их прорастании, понижение активности пероксидазы служит критерием углубления покоя семян. Поэтому аскорбиновая кислота и гидрохинон в высоких концентрациях, понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть.
2.3. Роль низкомолекулярных антиоксидантов в регулировании активности
пероксидазы
Нами изучено участие антиоксидантов: дигоксина, кверцетина и аскорбиновой кислоты в пероксидазном окислении о-дианизидина. Показано, что кверцетин и аскорбиновая кислота реагируют с окисленными соединениями пероксидазы. При добавлении дигоксина при всех изученных концентрациях мы не наблюдали изменений оптической плотности на полосе Соре (403 нм), что свидетельствует о том, что дигоксин не является субстратом пероксидазы. Однако дигоксин проявлял антиконкурентный характер ингибирования пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного с ферроцианидом окисления о-дианизидина при всех изученных значениях рН. Дигоксин может связываться с фермент-субстратным комплексом как в реакциях индивидуального окисления о-дианизидина, так и в реакциях его совместного окисления с ферроцианидом калия. Сродство ингибитора к фермент-субстратному комплексу при совместном окислении в 5-6 раз выше, чем в реакции индивидуального окисления о-дианизидина и зависело от рН.
Кверцетин, который по своей природе является субстратом пероксидазы (Жанаева и др., 1986), ингибировал фермент в реакции пероксидазного окисления о-дианизидином по смешанному типу. Связываясь в активном центре фермента, кверцетин затруднял последующее связывание и превращение о-дианизидина. Смешанный тип ингибирования вызван конкуренцией двух субстратов пероксидазы, один из которых является медленно окисляемым (кверцетин), а другой быстро окисляемым (о-дианизидин).
При совместном внесении в реакционную среду АК и о-дианизидина наблюдалось их дифференцированное пероксидазное окисление - окисление ОДН не происходило до полного превращения аскорбиновой кислоты. В отсутствие пероксидазы о-дианизидин не ускорял окисление аскорбиновой кислоты. При использовании низких концентраций пероксидазы (0.17 нМ) окисление аскорбиновой кислоты протекает очень медленно, что
свидетельствует об активации пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты о-дианизидином. Начальная скорость окисления АК не зависела от ее концентрации в интервале (4-320 мкМ), но изменялась при концентрации о-дианизидина (17-172 мкМ) в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен. По-видимому, как и при совместном окислении ферроцианида и о-дианизидина (Ugarova et al., 1981), в данном случае наблюдается субстрат-субстратная активация. Скорость пероксидазного окисления АК возрастает в 200-700 раз в присутствии о-дианизидина. Медленно окисляемый субстрат, каким является аскорбиновая кислота, эффективнее окисляется радикалами быстро окисляемого субстрата о-дианизидина, чем соединениями Е1 и Е2 пероксидазы. Показано, что как при индивидуальном, так и совместном с о-дианизидином окислении аскорбиновой кислоты на рН-зависимости lgkcat проявляется ионогенная группа с рКа~6.5. Можно высказать предположение, что это имидазольная группа остатка гистидина (Jamada, Jamasaki, 1974; Лебедева и др., 1977).
Выявленные закономерности имеют важное биологическое значение, поскольку раскрывает регуляторную роль антиоксидантов в пероксидазном окислении быстро окисляемых субстратов, заключающаяся в том, что увеличение содержание антиоксидантов в исследуемом биообъекте может ингибировать пероксидазу, тогда как возрастание содержания пероксидазы будет способствовать быстрому их окислению.
3. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на всхожесть семян пшеницы
3.1. Действие физико-химических факторов на прорастание семян
Биологически активные вещества очень часто используются для повышения всхожести семян (Шорнинг и др., 1999; Лукаткин, Левина, 1997). В зависимости от природы они могут регулировать протекание метаболических процессов (Ладыженская, Кораблева, 1985), активировать или ингибировать различные ферменты (Кефели, 1997), влиять на проницаемость мембран клеток (Сытник, Терещенко, 1983). Среди этой группы следует выделить соединения, обладающие антиоксидантной активностью, и являющиеся субстратами пероксидазы. Обладая разным механизмом действия, они в малых концентрациях активировали прорастание семян, а в больших - понижали их всхожесть. При этом проявлялась индивидуальная чувствительность семян пшеницы к используемым соединениям. Низкие концентрации строфантина, аскорбиновой кислоты, норадреналина, салицилата натрия, аминазина и этанола повышали всхожесть семян пшеницы на 15-20%. Тогда как высокие концентрации исследуемых соединений понижали их всхожесть. По величине ингибирующего эффекта исследованные нами соединения можно было расположить в следующем порядке: 2,4 ДНФ > гидрохинон >аминазин >дигоксин >салицилат натрия > этанол > норадреналин > строфантин >викасол.
Установлено, что высокие концентрации этанола понижают всхожесть семян пшеницы (Андрианова, Бакулидзе, 1996), тогда как малые дозы УФ облучения могут повышать их всхожесть (Рогожин, Курилюк, 1996). Известно, что свет может усиливать чувствительность растений к низким температурам. Так, например, выращивание растений при 10-13°С и высокой радиации способствует появлению некротических пятен на листьях и приводит к снижению интенсивности фотосинтеза при стабильном содержании хлорофилла (Taylor, Rowley, 1971; Scott, 1970). Нами изучено влияние 5 и 60 мин УФ-излучения на всхожесть семян пшеницы сорта Омская 1 2. Показано, что у семян, предварительно подвергнутых УФ-облучению, всхожесть несколько понижается, тогда как УФ-облучение семян после замачивания в растворах этанола различных концентраций повышает их всхожесть на 1 21 5%. Причем это особенно проявляется при длительном в течение 60 мин УФ-облучении семян. Проращивание семян при низкой температуре (14°С) стимулирует их прорастание, понижая ингибирующий эффект этанола. УФ-облучение таких семян дополнительно может увеличивать их всхожесть.
Исходная влажность семян обычно составляет 5-6%. При погружении в воду в течение 1 6-24 часов идет активное поглощение воды семенами. В этот период запускаются основные биохимические процессы, обеспечивающие последующее прорастание семян, на протекание которых оказывают влияние биологически активные соединения. Поэтому этот отрезок времени является наиболее важным в проявлении специфичности действия функциональных веществ. Показано, что всхожесть семян пшеницы имеет выраженный колебательный характер, зависящий от природы и концентрации используемого вещества. Так, малые концентрации этанола (0.1-0.5 мМ), в которых проводили набухание семян в течение первых 24 часов, повышали всхожесть семян пшеницы, а высокие концентрации этанола (0.1-2 М) понижали их всхожесть. Особенно это заметно, если замачивание семян проводили в течение первых 4-8 часов. Аналогичный эффект был отмечен и в работе (Зауралов и др., 1997). Однако это влияние этанола зависело от температуры среды и продолжительности замачивания.
Условно на кривой зависимости всхожести семян от времени замачивания в растворе 1 М этанола можно выделить три периода. Первый период, активационный, наблюдающийся при замачивании семян в этаноле в течение 2-х часов, при этом всхожесть семян повышается на 10-15%. Второй период, повышенной сопротивляемости к действующему фактору, который выявляется в течение 2-12 часов. В этот период можно наблюдать резкие эпизодические всплески повышения всхожести семян при общей тенденции к ее понижению. Третий период, устойчивого понижения всхожести, когда продолжительное действие используемого вещества последовательно уменьшает всхожесть семян. Естественно, что выделение этих периодов в действии функционально активных веществ условно и зависит от природы соединений и их концентраций. Высокие концентрации токсичных соединений могут сглаживать динамику проявления реактивности семян на действующий фактор. Так, замачивание семян пшеницы в растворах 2,4-динитрофенола, аминазина и дигоксина может проявляться в своеобразной динамике понижения всхожести семян. Показано, что высокие концентрации этих реагентов могут обвально уменьшать всхожесть семян пшеницы. Однако, несмотря на то, что в первые 60 мин замачивания использовались высокие концентрации реагентов, их влияние всегда выражалось в повышении всхожести семян. Дальнейшее же набухание семян в течение 4-8 часов вызывало резкое понижение всхожести, с последующим снижением до минимального уровня (3-5%). Однако, замачивание семян при низкой температуре, уменьшает ингибирующий эффект используемых реагентов, возможно, за счет снижения проницаемости мембран семян пшеницы для биологически активных веществ используемого раствора (Levitt, 1980).
Нами исследована всхожесть семян пшеницы предварительно замоченных в 0. 1 М растворе салицилата натрия и 2 М растворе этанола при температуре 5° и 23 °С. Показано, что замачивание семян при низкой температуре может снимать ингибирующий эффект, обусловленный высокими концентрациями реагентов. При этом наблюдается сглаживание динамики понижения всхожести семян, с проявлением повышенной их устойчивости к воздействующему фактору. В понижении всхожести семян пшеницы можно выделить период повышенной устойчивости семян к биологически активным соединениям, который проявляется в основном между 8 и 16 часами замачивания. Неоднородность всхожести семян позволяет предположить проявления у них компенсаторных механизмов, противодействующих проникновению с водой функционально активных веществ.
Пероксидаза, алкогольдегидрогеназа и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа играют важную роль в покое и прорастании семян пшеницы. В прорастающих семенах активность пероксидазы возрастает, а активность АДГ снижается. У непроросших семян активность АДГ повышается в 2.5-5.5 раза, при понижении активности пероксидазы в 2.8-3.5 раза по сравнению с прорастающими семенами. Высокая разница в величинах активности ферментов, по-видимому, может указывать на степень их участия в механизмах прорастания семян пшеницы (Рогожин, Егорова, 1 990).
3.2 Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на физиолого-биохимические показатели
семян при прорастании
Действие БАВ может проявляться в понижении протекания биосинтетических процессов или ингибировании активности ферментов семян пшеницы. Причем высокие концентрации антиоксидантов могут понижать активность пероксидазы и за счет этого регулировать продолжительность гипобиотического состояния семян. Возможно, что ведущую роль в поддержании гипобиоза семян пшеницы выполняет пероксидаза, уменьшение активности которой углубляет покой семян, что проявляется в задержке их прорастания и понижении всхожести.
Для подтверждения этого предположения мы изучали влияние различных концентраций аскорбиновой кислоты и гидрохинона на всхожесть семян пшеницы (рис.8). Набухание семян в различных растворах аскорбиновой кислоты и гидрохинона приводит к понижению их всхожести при одновременном уменьшении активности пероксидазы, которая коррелирует с возрастанием содержания в семенах пшеницы аскорбиновой кислоты и гидрохинона. Установлена положительная корреляция между всхожестью семян и активностью пероксидазы, которая находятся в обратной зависимости от содержания антиоксидантов в семенах пшеницы.
ГХ, мМ
Рис. 8. Зависимости содержания АК (1), гидрохинона (1') и активности пероксидазы (3,3') в зернах пшеницы сорта Омская 12 различной всхожести (2,2'), замоченных в растворах АК (а) и гидрохинона (б). Условия: 23 °С, время замачивания 24 ч, всхожесть определяли на 7-ой день проращивания зерен пшеницы.
Поскольку пероксидаза входит в систему антиоксидантной защиты живых организмов и поэтому совместно с каталазой, супероксиддисмутазой и другими ферментами пероксидаза может предохранять организмы от действия активных форм кислорода, защищая ткани от окислительного шока, поэтому в семенах пшеницы, а затем и в проростках отмечается высокая активность пероксидазы. При набухании семян в воде в них возрастает дыхание, что сопровождается увеличением активности пероксидазы, особенно, проявляющееся при прорастании семян. Высокие экзогенные концентрации АК и гидрохинона могут ингибировать пероксидазу семян пшеницы, при этом понижая их всхожесть.
После действия высоких концентраций АК и гидрохинона всхожесть семян пшеницы составляла 8-15%. Замачивание семян в 1 М растворе АК приводило к понижению активности пероксидазы в корнях и надземной части на 2-ые сутки прорастания до 30 и 23, на 3-тьи - 55 и 45, на 4-тые - 55 и 70, а на 6-тые - 62 и 87% соответственно. Набухание семян пшеницы в растворах 50 мМ гидрохинона снижало активность пероксидазы в корнях и надземной части проростков на 2-ые сутки прорастания до 15 и 10, на 3-тьи - 20 и 17, на 4-тые - 27 и 1 9, а на 6-тые - 45 и 42% соответственно. Тогда как, набухание семян пшеницы в растворах низких концентраций АК и гидрохинона практически не влияло на активность пероксидазы в семенах.
Для подтверждения избирательности действия антиоксидантов на пероксидазу зерен пшеницы нами было изучено их влияние на активность других ферментов зерен, в частности, алкогольдегидрогеназу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. Показано, что независимо от концентрации используемых антиоксидантов активность АДГ и Г6ФДГ в семенах практически не изменялась после 24 ч замачивания их в растворах аскорбиновой кислоты и гидрохинона.
3.3 Роль аскорбиновой кислоты при прорастании семян пшеницы
Подтверждением участия АК в регулировании покоя семян являются выполненные нами исследования по изучению эндогенного содержания АК в семенах до и после замачивания их в воде, а также в проростках пшеницы (табл.4). Показано, что уровень АК в непроросших семенах пшеницы на протяжении всего срока прорастания сохраняется на достаточно высоком уровне и в 1.5-1.8 раз выше, чем в сухих семенах. Отмечается явная тенденция к понижению содержания АК в проклюнувшихся семенах и в проростках пшеницы по сравнению с уровнем этого антиоксиданта в непроросших семенах. На четвертые сутки прорастания в надземной части и корнях проростков пшеницы уровень АК понижается в 4 раза. Эти изменения в содержании АК могут служить подтверждением участия эндогенных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.
Таблица 4. Содержание аскорбиновой кислоты (мг/100 г сухой массы) в семенах и проростках пшеницы сорта Омская 12 во время прорастания.
Время прорастания, сут. Семена Проростки
Непроросшие Проклюнувшиеся Корни Надземная часть
Контроль (сухие) 15.2±0.5 (100%) - - -
1 24.8±0.8 (163%) - - -
2 26.4±0.9 (174%) 22.4±0.8 (147%) - -
3 26.8±0.9 (176%) 19.2±0.6 (126%) 3.8±0.2 (25%) 7.2±0.3 (47%)
4 23.6±0.6 (155%) 8.0±0.3 ( 53%) 3.6±0.2 (24%) 4.0±0.2 (26%)
Таким образом, участие антиоксидантов в механизме покоя семян, по-видимому, обусловлено ингибированием ферментов антиоксидантной системы защиты растений, в особенности, пероксидазы, наблюдаемое как in vitro, так и in vivo. Понижение активности фермента высокими концентрациями антиоксидантов способствует углублению покоя семян пшеницы, а активирование пероксидазы - ускоренному их выходу из состояния покоя и быстрому прорастанию.
ВЫВОДЫ
1. При набухании и прорастании семян пшеницы активность пероксидазы в семенах и проростках возрастает. Повышение содержания антиоксидантов происходит в ответ на увеличение уровня перекисного окисления липидов, тогда как активность пероксидазы возрастает с уменьшением содержания антиоксидантов. В случае повышения уровня
антиоксидантов отмечается понижение активности пероксидазы. Таким образом, осуществляется взаимная регуляция системы антиоксидантной защиты растений.
2. Низкие положительные температуры способствуют повышению активности пероксидазы и содержания антиоксидантов в зародыше семян пшеницы. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и кожуре.
3. Константы Михаэлиса по о-дианизидину, определенные для пероксидазы пшеницы и хрена, близки. Кт по аскорбиновой кислоте у пшеницы в 5-9 раз ниже за счет присутствия в гомогенате зерна посторонних субстратов пероксидазы, участвующих в совместном окислении аскорбиновой кислоты.
4. Контроль над уровнем ПОЛ в проростках пшеницы осуществляют как низкомолекулярные антиоксиданты, так и пероксидаза. В надземной части больше содержится антиоксидантов и меньше пероксидазы, чем в корнях проростков пшеницы. Ведущая роль в регулировании ПОЛ в надземной части преимущественно выполняют низкомолекулярные антиоксиданты, тогда как в корнях эта функция возложена на пероксидазу.
5. Константа связывания аскорбиновой кислоты с окисленными формами пероксидазы соизмерима с Кт быстро окисляемых органических субстратов фермента, поэтому предварительное связывание аскорбиновой кислоты с полуокисленными формами пероксидазы может препятствовать их пероксидазному окислению. При связывании двух молекул аскорбиновой кислоты процесс ее пероксидазного окисления ускоряется, а избыток аскорбиновой кислоты понижает каталитическую активность фермента. Данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях.
6. Аскорбиновая кислота и гидрохинон являются медленно и быстро окисляемыми субстратами пероксидазы соответственно. Гидрохинон активирует окисление аскорбиновой кислоты, тогда как избыток аскорбиновой кислоты ингибирует фермент в реакции совместного окисления субстратов. Окисление о-дианизидина не наблюдалось до полного превращения гидрохинона. Скорость пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии о-дианизидина может превышать скорость индивидуального окисления этих субстратов более чем в 10-100 раз.
7. Дигоксин, связываясь с фермент-субстратным комплексом, в котором присутствует стабильный полуокисленный продукт о-дианизидина, ингибирует пероксидазу по антиконкурентному типу и подавляет свободнорадикальное окисление ОДН. Кверцетин, связываясь с ферментом понижает сродство и эффективность превращения о-дианизидина, ингибирует пероксидазу по смешанному типу.
8. Низкомолекулярные антиоксиданты в малых концентрациях активировали прорастание семян на 15-20%, а в больших - понижали их всхожесть до 3-11%. При этом проявлялась индивидуальная чувствительность семян пшеницы к используемым соединениям. Высокие концентрации антиоксидантов могут понижать активность пероксидазы и за счет этого регулировать продолжительность гипобиотического состояния семян пшеницы.
9. Содержание аскорбиновой кислоты в непроросших семенах пшеницы на протяжении всего срока прорастания сохраняется на достаточно высоком уровне и в 1.5-1.8 раз выше, чем в сухих семенах. Отмечена тенденция к понижению уровня аскорбиновой кислоты в проклюнувшихся семенах и в проростках пшеницы по сравнению с уровнем этого антиоксиданта в непроросших семенах. Эти изменения в содержании аскорбиновой кислоты могут служить подтверждением участия эндогенных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.
Список опубликованных работ, отражающих содержание диссертации.
1. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Аскорбиновая кислота - медленно окисляемый субстрат пероксидазы хрена // Биохимия.-1997.-Т.62.-№12.-С.1686 - 1690.
2. Рогожин В. В., Верхотуров В. В. Стационарная кинетика пероксидазного окисления 2-хлор-10-(3-диметиламинопропил)-фенотиазина в присутствии пероксидазы хрена // Биохимия.-1998.-Т.63.-№ 5.-С.85-90.
3. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние антиоксидантов (дигоксина, кверцетина и аскорбиновой кислоты) на каталитические свойства пероксидазы хрена // Биохимия.-1998.-Т.63.-№ 6.-С.63-68.
4. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Влияние функционально активных веществ на пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты и о-дианизидина, катализируемое пероксидазой хрена // Наука и образование.- 1998.- № 4.-С.21-25.
5. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы хрена // Биохимия.-1998.-Т.63.-№ 12.-С.107-112.
6. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Механизм угнетения активности пероксидазы салицилатом натрия//Наука и образование.-1999.-№1.-С.74-79.
7. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия перекисью водорода в присутствии пероксидазы хрена // Биоорганическая химия.-1999.-Т.25.-№ 1.-С.70-73.
8. Рогожин В.В., Верхотуров В. В. Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии пероксидазы хрена// Биоорганическая химия.-1999.-Т.25.-№ 5.-С.377-382.
9. Рогожин В.В., Курилюк.Т.Т., Верхотуров В.В., Колесова Т. К. Роль пероксидазы и антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян // Тезисы 11-ой Международная конференция "Регуляторы роста и развития растений".-М.-1999.-с. 125-126.
Верхотуров Василий Владимирович
ВЗАИМНОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ
ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ А втореферат
Отпечатано в Институте земной коры СО РАН Иркутск. ул. Лермонтова 128 Тираж 100 экз.
