CC BY
94
jS Выявление специфических
£ иммуноглобулинов класса G в препарате
£ Иммуноглобулин человека против
I клещевого энцефалита методом ИФА
-о
^ Ладыженская И.П., Воробьёва М.С., Саркисян К.А., Кузнецова Д.Д., Афонина О.С., Фадейкина О.В. (в
I Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств
jS медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ, Москва
Z
§ Detection of specific immunoglobulin G in
human immunoglobulin preparations against tick-borne encephalitis virus by ELISA
Ladyzhenskaya I.P., Vorobieva M.S.,Sarkisyan K.A., Kuznetsova D.D., Afonina O.S., Fadeikina O.V.
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expertise of Medical Application Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
r-
Препарат Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, раствор для внутримышечного введения, в течение многих лет применяется в РФ для экстренной серопрофилактики и лечения клещевого энцефалита. Шесть предприятий ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России более 50 лет осуществляют промышленный выпуск этого препарата. Основу препарата составляют специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, которые обладают защитной активностью при парентеральном введении и нейтрализуют вирус клещевого энцефалита, циркулирующий в крови инфицированного или заболевшего клещевым энцефалитом человека. Для определения активности препарата по содержанию антител к вирусу клещевого энцефалита применяется регламентированный метод - реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Метод иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет выявлять в сыворотке или плазме крови человека иммуноглобулины класса G к вирусу клещевого энцефалита при использовании наборов реагентов, предназначенных для этой цели. ЦЕЛЬ данного исследования - изучить и дать дополнительную характеристику специфической активности препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита по титру иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита при использовании метода имму-ноферментного анализа.
Ключевые слова: клещевой энцефалит, иммуноглобулины класса G к вирусу клещевого энцефалита, иммуноферментный анализ (ИФА), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), титр антител. Библиографическое описание: Ладыженская И.П., Воробьёва М.С., Саркисян К.А., Кузнецова Д.Д., Афонина О.С., Фадейкина О.В. Выявление специфических иммуноглобулинов класса G в препарате Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита методом иФа //Биопрепараты. 2013. № 3. С. 26-35.
Human immunoglobulin preparation against tick-borne encephalitis, solution for intramuscular injection, has been used in the Russian Federation for manyyears for the emergency seroprophylaxis and treatment of tick-borne encephalitis. Six units of the Federal State Unitary Enterprise Science and Production Association «Microgen» of the Ministry of Health of the Russian Federation have been commercially manufacturing the mentioned medicine for more than 50 years. The active part of the preparation consists of tick-borne encephalitis virus-specific antibodies, which demonstrate protective activity when administered parenterally and neutralize tick-borne encephalitis virus, circulating in the blood of an infected or sick person. Hemagglutination-inhibition reaction (HIR) is a specified method for evaluating the activity of the drug based on the amount of antibodies to tickborne encephalitis. The method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) allows to detect immunoglobulins G against tick-borne encephalitis virus in human blood serum or blood plasma by
ПРЕПАРАТЫ
/"-\
using a reagent kit elaborated for this purpose. The purpose of the present research is to study and provide additional characterization to the specific activity of human immunoglobulin preparations against tick-borne encephalitis virus according to the titer of immunoglobulins G against tick-borne encephalitis virus by enzyme immunoassay.
Key words: tick-borne encephalitis, immunoglobulins G against tick-borne encephalitis virus, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), hemagglutination- inhibition reaction (HIR), antibody titer. Bibliographic description: Ladyzhenskaya I.P., Vorobieva M.S., Sarkisyan K.A., Kuznetsova D.D., Afonina O.S., Fadeikina O.V. Detection of specific immunoglobulin G in human immunoglobulin preparations against
tick-borne encephalitis virus by ELISA //Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 3. P. 26-35. \_
Для корреспонденции:
Воробьёва М.С. - главный эксперт Управления экспертизы противовирусных МИБП
Центра экспертизы и контроля МИБП
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России,
119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41
e-mail: [email protected]
Статья поступила 17.12.12 г, принята к печати 22.08.2013 г
В течение многих лет в России для экстренной серопрофилактики и лечения клещевого энцефалита (КЭ) применяется препарат Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита. В 60-80-е годы прошлого столетия были проведены многочисленные исследования по доказательству профилактических и лечебных свойств этого препарата [1-4].
На первых этапах получения препарата использовали отобранную по титру антител к вирусу КЭ плазму крови доноров, проживающих в эндемичных по клещевому энцефалиту регионах и имеющих в крови, благодаря естественному «проэпидемичиванию», антитела к вирусу клещевого энцефалита. Позднее, плазму крови человека для производства этого препарата стали получать от доноров, вакцинированных против клещевого энцефалита.
В Инструкциях по медицинскому применению отечественных вакцин против КЭ представлены специальные схемы вакцинации для доноров, обеспечивающие получение в короткие сроки регламентированного уровня специфических антител в плазме крови доноров [5-7].
Отечественный препарат Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита представляет собой концентрированный раствор очищенной фракции иммуноглобулинов, выделенных методом фракционирования этиловым спиртом при температуре ниже 0°С из плазмы крови здоровых доноров, содержащей антитела к вирусу КЭ.
Иммунологические свойства: действующим началом препарата являются иммуноглобулины класса О, обладающие активностью антител, нейтрализующих вирус клещевого энцефалита. Препарат также повышает неспецифическую резистентность организма [8, 9].
В готовом препарате фракция иммуноглобулинов должна составлять не менее 97% от общего белка. Содержание белка в иммуноглобулине - от 10 до 16%. Титр антител к вирусу КЭ в реакции торможения гемаг-глютинации (РТГА) - не менее 1:80 [8, 10, 11].
Согласно нормативной документации на Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита [10] методом определения показателя «Специфическая активность» препарата является, как было указано выше, РТГА. Однако на современном уровне развития аналитических методов в биологии представлялось целесообразным дополнить характеристику показателя «Специфическая активность» препарата показателем активности препарата по титру иммуноглобулинов класса О к вирусу КЭ в иммуноферментном анализе (ИФА) [2, 12, 13].
Цель работы - изучить возможность применения им-муноферментного анализа для выявления иммуноглобулинов класса О к вирусу КЭ и дать дополнительную характеристику специфической активности препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в ИФА по титру специфических иммуноглобулинов класса О.
Для выполнения этой цели были проведены следующие исследования:
I. Титрование образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита производства различных предприятий ФГУП «НПО «Ми-кроген» для определения титра антител к вирусу КЭ по регламентированному методу (РТГА).
II. Подбор условий проведения иммуноферментного анализа для выявления иммуноглобулинов класса О к вирусу КЭ в препарате Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита при использовании отечественных наборов реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса О к вирусу КЭ, предназначенных для исследования сывороток (плазмы) крови человека.
Подтверждение пригодности отработанной методики постановки ИФА для иммуноглобулинов класса О при параллельном исследовании серий препарата с использованием наборов реагентов для ИФА отечественного и зарубежного производства.
III. Титрование образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита методом ИФА для определения содержания иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ для дополнительной характеристики специфической активности препарата.
Материалы и методы
Материалы:
1. Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, раствор для внутримышечного введения, производитель ФГУП «НПО «Микроген», Минздрава России - образцы 58 серий выпуска 2009-2012 гг в производственных филиалах ФГУП «НПО «Микроген», расположенных в следующих городах России - г Томск - 28 серий, г Пермь - 12 серий, г Уфа - 6 серий, г Хабаровск -5 серий, г Екатеринбург - 4 серии, г Омск - 3 серии.
2. Иммуновенин - иммуноглобулин человека нормальный, лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения, производитель ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, филиал г Уфа - образцы 2 серий.
3. Пентаглобин - иммуноглобулин человека нормальный (IgG+IgM+IgA), раствор для инфузий, производитель: фирма «Biotest», Германия - образцы 1 серии.
4. Плазма для фракционирования, субстанция, производитель ГБУЗ «СПК Калининградской области», Россия - образцы 2 серий.
5. Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита «Векто ВКЭ - IgG», производитель ЗАО «Вектор-Бест», Россия.
6. Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита «NovaLisa TBE/FSME-IgG -ELISA», производитель «Nova Tec Immunodiagnostica GmbH», Германия.
7. Набор реагентов «Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ», производитель ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, филиал г. Томск.
8. Эритроциты гусей для постановки РТГА.
Примечание: Образцы серий вышеуказанных различных иммуноглобулинов, плазмы для фракционирования были предоставлены для выполнения этого исследования из Лаборатории иммуноглобулинов и препаратов крови Испытательного Центра МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
Методы:
1. Титрование образцов препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита - регламентированным методом РТГА (Инструкция по применению набора реагентов Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ) [11].
В состав набора реагентов для РТГА в качестве основного компонента входит инактивированный бета-пропиолактоном антиген вируса клещевого энцефалита, полученный методом боратно-солевой экстракции из мозга белых мышей, инфицированных вирусом КЭ, штамм № 139, обладающий способностью вызывать
агглютинацию эритроцитов гуся [11, 14]. Гемагглюти-нирующая активность и выбор рабочей дозы антигена для РТГА проводится в реакции гемагглютинации (РГА) с взвесью гусиных эритроцитов по учёту феномена агглютинации эритроцитов. При использовании образцов сывороток (плазмы) крови, содержащих антитела к вирусу КЭ, агглютинация тормозится (подавляется), благодаря блокировке ответственного за этот феномен антигена - гемагглютинина (ГА), обычно располагающегося на поверхности вириона [11]. В РТГА используется рабочая доза антигена вируса КЭ - 8 ГАЕ.
До постановки в РТГА образцы исследуемых препаратов иммуноглобулинов: Иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита, Иммуновенина, Пента-глобина, Плазмы для фракционирования, субстанция предварительно обрабатывали для удаления неспецифических гемагглютининов и ингибиторов гемагглютинации 25% взвесью каолина и 0,4% взвесью гусиных эритроцитов. В результате проведенной обработки было получено исходное разведение каждого образца - 1:10, из которого далее готовили на боратном буферном растворе разведения от 1:20 до 1:1280. За титр антител в каждом исследуемом образце иммуноглобулина принимали максимальное разведение препарата, при котором наблюдали визуально полную задержку гемагглютинации (-) с рабочей дозой антигена, при контрольном титровании которой наблюдается гемагглютинация не менее чем на 3+.
2. Подготовка и предварительное определение оптимального разведения образцов препаратов иммуноглобулинов: Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, Иммуновенин, Пентаглобин, Плазма для фракционирования, субстанция - для исследования методом ИФА в наборах реагентов отечественного производства «Векто ВКЭ - 1дО». Постановку ИФА проводили согласно Инструкции по применению данного набора реагентов [12].
Набор реагентов «Векто ВКЭ - 1дО» предназначен для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса О к вирусу КЭ в сыворотках или плазме крови человека, при этом исследуемые образцы сыворотки или плазмы предварительно разводят 1:100 для предотвращения неспецифических реакций.
Для проведения ИФА с образцами препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита и других препаратов иммуноглобулинов готовили разведения каждого исследуемого препарата от 1:400 до 1:25600 на растворе для разведения сывороток из комплекта набора.
При использовании набора реагентов «Векто ВКЭ -1дО» учет результатов реакции проводили по измерению величины оптической плотности (ОП) растворов в лунках планшета-иммуносорбента на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме 450/620 нм. Учитывая показатели ОП в лунках с отрицательным контрольным образцом (К-), вычисляли критическое значение оптической плотности (ОПкрит.). За титр иммуноглобулина класса О (результат анализа положительный) принимали максимальное разведение исследуемого образца, при котором величина оптической плотности (ОПобр.) была равна или более ОПкрит.
ПРЕПАРАТЫ
Таблица 1. Состав диагностических наборов реагентов для РТГА и ИФА, предназначенных для выявления антител (иммуноглобулинов) к вирусу клещевого энцефалита
Биологические реагенты, входящие в состав диагностических наборов Набор реагентов для РТГА Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса С к вирусу клещевого энцефалита
«Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА,РСК,РРГ» (ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ) «ВектоВКЭ-IgG» (ЗАО «Вектор-Бест» Россия) «NovaLisa TBE/FSME -IgG- Elisa» (Фирма «NovaTec Immundiagnostica GmbH», Германия)
СОСТАВ
1. Иммуносорбент Антиген вируса клещевого энцефалита, полученный методом боратно-солевой экстракции из мозга белых мышей инфицированных вирусом КЭ, очищенный протаминсульфатом, инактивированный Планшет разборный с иммобилизованным антигеном вируса КЭ Планшет разборный с иммобилизованным антигеном вируса КЭ
2. К+ (положительный контрольный образец) К+ (РТГА) - асцитная жидкость крыс, иммунизированных живым вирусом КЭ, обработанная хлороформом, каолином и гусиными эритроцитами К+ (положительный контрольный образец, инактивированный) Не входит в состав набор
3. К- (отрицательный контрольный образец) К- (РТГА) - асцитная жидкость неим-мунизированных крыс, обработанная хлороформом, каолином и гусиными эритроцитами К- (отрицательный контрольный образец, инактивированный) Не входит в состав набора
4. Калибровочные растворы, содержащие иммуноглобулины класса С к вирусу КЭ Не входят в состав набора Калибровочные растворы, содержащие 1дС к вирусу КЭ в концентрациях от 10 до 1б0 ЕД/ мл* Стандарты IgG к вирусу КЭ от 0 до 300 NTU/ml** (TBE/FSME IgG)
5.Растворы для разведения образцов Смесь солей (таблетка) для приготовления боратного буферного раствора (ББР) рН 9,0 ± 0,05; Смесь солей (таблетка) для приготовления фосфатного буферного раствора (ФБР) рН б,2 ± 0,05 Растворы для разведения сывороток (РПРС - для предварительного разведения и РРС - раствор для разведения) Растворы для разведения сывороток (IgG pH 7,2 ± 0,2)
6. Конъюгат Отсутствует; для визуального выявления результатов взаимодействия комплекса «антиген-антитело» (феномен задержки гемагглютинации) используют 0,4% взвесь эритроцитов гуся Конъюгат антител к иммуноглобулинам человека, меченых пероксидазой хрена TBE/FSME anti-IgG конъюгат-связанные с пероксидазой антитела к IgG человека
7. Субстрат Отсутствует Раствор тетраметилбензидина (раствор ТМБ) ТМБ субстрат (раствор TMB) 3,3,5,5-тетраметилбензидин
8. Промывочные растворы Отсутствуют Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т*25) 20-кратный концентрат буферного раствора рН 7,2 ± 0,2
9.Стоп-реагент Отсутствует Стоп-реагент Стоп-раствор - 0,2 М раствор серной кислоты
10. Результьы анализа Визуальное выявление: (-) полное оседание эритроцитов (от 3+ до 4+) гемагглютинация эритроцитов Результаты ИФА регистрируют, измеряя величину оптической плотности растворов в лунках на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме 450/620 нм Результаты ИФА регистрируют, измеряя величину оптической плотности растворов в лунках на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме 450/620 нм
* Калибраторы используются только при количественном варианте ИФА.
"NTU/мл = Nova Tec Units, при интерпретации результатов ИФА (значение величин применяется при регистрации положительного или отрицательного результата анализа).
О9
Для сравнения и оценки специфичности положительных результатов ИФА для препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в опыте ИФА в разведении 1:400 и более параллельно исследовали образцы препаратов иммуноглобулинов человека нормальных (Пентаглобин, 1 серия, Иммуновенин, 2 серии, образцы Плазма для фракционирования, субстанция, 2 серии), которые по данным РТГА не содержали антитела к вирусу КЭ (титр менее 1:10).
Воспроизводимость полученных результатов ИФА оценивали при параллельном титровании образцов в разведениях 1:400-1:25600 трёх серий (в трех повторах) препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита на двух наборах реагентов для ИФА: «Векто ВКЭ - IgG» и «NovaLisa TBE/FSME IgG ELISA».
Для зарубежного набора,согласно Инструкции по применению [13], расчет активности (титр) специфического иммуноглобулина класса G проводили при сравнении значений ОП разведений исследуемых образцов препарата со значениями ОП калибровочных стандартов, входящих в комплект этого набора реагентов.
Состав диагностических наборов реагентов для РТГА и ИФА представлен в таблице 1.
3. Определение содержания иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в образцах 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита при титровании методом ИФА в наборах реагентов отечественного производства «Векто ВКЭ - IgG».
4. Методы статистической обработки и анализа полученных результатов. Определяли значение среднеарифметической величины титров и ошибку средней ОП [17-19].
Для статистической характеристики результатов экспериментов выбрана медиана - показатель, позволяющий статистически охарактеризовать ряд анализируемых значений и который можно применять для любого типа распределений данных [18]. Применение медианы
рекомендовано в тех случаях, когда значения подвержены варьированию (от 1:6400 до 1:25600). Вычисление медианы проводили в соответствии с методикой, изложенной в [19]. Медиана - это значение исследуемого признака, справа и слева от которого находится одинаковое число упорядоченных элементов выборки. Наглядное применение метода статистики «Медиана» для распределения титров антител в РТГА и титров иммуноглобулинов класса G в ИФА для образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита представлено на рисунках 1 и 2.
Результаты и обсуждение
I. Диагностический набор реагентов «Диагностикум клещевого энцефалита, сухой, для РТГА, РСК, РРГ» предназначен для исследования сывороток (плазмы) крови человека и иммуноглобулина человека против КЭ на наличие антител к вирусу КЭ.
Для подтверждения наличия антител к вирусу КЭ в РТГА при использовании «Диагностикума клещевого энцефалита сухого для РТГА, РСК, РРГ» были исследованы образцы 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита различных филиалов предприятия «НПО «Микроген», а также образцы препаратов Иммуновенин, Пентаглобин, Плазма для фракционирования.
Результаты представлены в таблице 2 и на рис. 1. Как видно из представленных данных, все образцы 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита содержали специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита и соответствовали по показателю «Специфическая активность» требованиям НД.
Большинство образцов серий имели титры антител -1:160, 1:320, единичные образцы имели титр - 1:640, что соответствовало паспортным данным.
Таблица 2. Определение антител к вирусу клещевого энцефалита в РТГА в образцах серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, производитель ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России
Производство (филиалы НПО «Микроген») Количество исследованных серий Титр антител к вирусу КЭ в РТГА (показатель активности по НД - не менее 1:80)*
1:160 1:320 1:640
г. Томск 28 14 12 2
г. Пермь 12 6 3 3
г. Уфа 6 5 1 -
г. Хабаровск 5 5 - -
г. Екатеринбург 4 4 - -
г. Омск 3 3 - -
Всего 58 *** 37 /64,3%** 16 /27,5% 5/8,9%
*За титр исследуемого образца иммуноглобулина принимают максимальное разведение, дающее полную (-) задержку гемагглю-тинации с 8 ГАЕ антигена вируса КЭ. Определяется визуально.
**37/64,3% - числитель: количество образцов препарата с данным показателем титра, знаменатель: показатель в %. ***При исследовании образцов препаратов: Иммуновенин (2 серии); Пентаглобин (1 серия); Плазма для фракционирования, субстанция (2 серии) - антитела к вирусу КЭ не выявлены.
ПРЕПАРАТЫ
рис. 1. определение уровня антител к вирусу кЭ в образцах иммуноглобулина человека против кЭ в реакции
ртга.
В образцах исследованных серий препаратов Имму-новенин, Пентаглобин, Плазма для фракционирования антитела к вирусу клещевого энцефалита отсутствовали.
II. Подбор условий проведения ИФА для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в препарате Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита.
Для выполнения этой задачи использовали коммерческий набор реагентов для ИФА отечественного производства «Векто ВКЭ - предназначенный для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в сыворотках или плазме крови человека.
Первоначально исследовали образцы одной серии препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, образцы двух серий препарата Иммунове-нин, образец одной серии препарата Пентаглобин и двух серий Плазмы для фракционирования, субстанция.
Вышеуказанные препараты разводили раствором для разведения сывороток, входящим в состав набора реагентов для ИФА. Для постановки ИФА был использован ряд разведений образцов препаратов от 1:400 до 1:25600, так как в предварительных исследованиях было показано, что для более низких разведений
Таблица 3. Результаты сравнительного изучения в наборе реагентов «ВектоВКЭ - IgG» показателей оптической плотности (ОП 450/620 нм) при титровании в ИФА образцов препаратов, содержащих и не содержащих (по данным РТГА) антител к вирусу КЭ
№ п/п Наименование препарата Показатели ОП растворов в лунках соответствующих разведений образцов препаратов:
разведения
1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600
1. Иммуноглобулин человека против КЭ серия №Т28 >3.5* 3.045 1.877 1.025 0.512 0.253 0.124
2. Иммуновенин (иммуноглобулин человека нормальный) серия № У-75 0.201 0.108 0.067 0.041 0.031 0.032 0.019
3. Иммуновенин (иммуноглобулин человека нормальный) серия № У-76 0.172 0.091 0.058 0.035 0.033 0.028 0.018
4 Пентаглобин (иммуноглобулин человека нормальный) серия № 146222 0.056 0.054 0.038 0.036 0.035 0.036 0.030
5. Плазма для фракционирования серия № 6 0.007 0.021 0.023 0.021 0.024 0.024 0.015
6. Плазма для фракционирования серия № 7 0.013 0.026 0.032 0.022 0.023 0.022 0.016
Примечания. Критерии оценки результатов ИФА (Инструкция по применению набора реагентов) Показатели оптической плотности ОП 450/620 нм: Контрольные образцы:
К+ (положительный контрольный образец) - не менее 0,8; К- (отрицательный контрольный образец) - не более 0,2; Учет результатов анализа: ОПкрит. = ОПср.К- + 0,1;
ОПобр. > ОПкрит. (результат анализа положительный); ОПобр. < ОПкрит. (результат анализа отрицательный).
*ОПобр. - оптическая плотность в лунках с исследуемым образцом; Контрольные образцы, комплектующие набор (характеристики, полученные при тестировании, средняя из трех определений):
- ОПК+ = 2,980;
- ОПК - =0,020;
ОПкрит. = 0,120. Положительный результат анализа: >0.120;
Отрицательный результат анализа: <0.120.
С31
препарата иммуноглобулина против КЭ значения ОП «зашкаливали» при измерении на спектрофотометре (1:100, 1:200 - ОП = более 3,5).
После внесения проб исследуемых препаратов в соответствующих разведениях в лунки планшета-иммуносорбента (в лунках сорбирован антиген вируса клещевого энцефалита) дальнейшую постановку ИФА проводили в соответствии с Инструкцией по применению на отечественный набор для ИФА.
Результаты представлены в таблице 3.
Иммуноглобулин человека против КЭ в разведении 1:400 имел показатель ОП более 3,5, при этом в разведении 1:400 в образцах двух серий препарата Иммуно-венин выявлены следовые низкие значения ОП: 0,201 и 0,172 при ОПкрит. = 0,120. Для последующих разведений образцов препарата Иммуновенин, а также Пен-таглобин и Плазмы для фракционирования в ИФА выявлены отрицательные значения ОП. В данном опыте положительный результат анализа - специфический титр иммуноглобулина класса О к вирусу КЭ для препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита соответствовал разведению 1:12800.
Таким образом, для получения объективных и специфичных результатов титрования иммуноглобулина класса О к вирусу КЭ целесообразно проводить разведения образцов препарата, начиная с 1:800, при котором для препаратов иммуноглобулинов человека нормальных и для плазмы крови человека положительные значения ОП отсутствуют.
Для подтверждения полученных результатов по подбору оптимального разведения для ИФА, оценки воспроизводимости этих результатов было проведено параллельное титрование образцов трех серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в наборах реагентов для ИФА отечественного и зарубежного производства. Иммуноглобулины титровали в тех же разведениях, что и в предыдущем опыте. В каждом испытании для оценки воспроизводимости результатов постановки ИФА повторяли для каждой серии препарата трехкратно. Результаты представлены в таблицах 4 и 5.
В данной серии опытов на наборе реагентов «Векто ВКЭ - 1дО» (табл. 4) была подтверждена правильность установленных значений разведений иммуноглобулина против КЭ (1:800-1:25600), в ИФА получены сходные показатели среднеарифметических значений ОП в образцах препарата каждой из трех серий в соответствующем разведении.
Были определены максимальные разведения образцов иммуноглобулина против КЭ, в пробах с которыми выявлялся положительный результат анализа (ОПобр.> ОПкрит.), при ОПкрит. = 0,121. Эти значения максимального разведения образцов с положительной реакцией в ИФА, равные 1:12800, были определены как титры иммуноглобулина класса О против КЭ в ИФА в наборе реагентов «Векто ВКЭ - 1дО».
В таблице 5 представлены результаты титрования образцов тех же трех серий препарата иммуноглобу-
Таблица 4. Показатели оптической плотности (ОП) при титровании методом ИФА образцов трех серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита (данные тестирования в наборе реагентов «ВектоВКЭ-IgG»)
№ п/п Серия Иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита Количество исследованных образцов Показатели ОП растворов в лунках соответствующих разведений образцов разведения
1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600
1 Т32 3 3,35*+0,018 2,53+0,008 1,61+0,026 0,84+0,015 0,4+0,008 0,21±0,008 0,11+0,006
2 П569 3 3,35+0,021 2,62+0,072 1,68+0,053 0,93+0,056 0,45+0,047 0,23±0,045 0,12+0,017
3 П567 3 3,39 + 0,028 2,65 + 0,068 1,77+0,075 0,97+0,059 0,46 + 0,015 0,24 ± 0,003 0,13 + 0,007
Примечания. Критерии оценки результатов ИФА (Инструкция по применению набора реагентов) Показатели оптической плотности ОП 450/620 нм: 1. Контрольные образцы:
К+ (положительный контрольный образец) - не менее 0,8; К- (отрицательный контрольный образец) - не более 0,2; Учет результатов анализа: ОПкрит. = ОПср.К- + 0,1;
ОПобр. > ОПкрит. (результат анализа положит.);
ОПобр. < ОПкрит. (результат анализа отриц.).
*ОПобр. - оптическая плотность в лунках с исследуемым образцом
п = 3; (Х+т), где X - средняя арифметическяя, т - ошибка средней.
Контрольные образцы, комплектующие набор реагентов (характеристики полученные при тестировании):
- ОПК + = 3.001;
- ОПК- = 0.021;
ОПкрит. = 0.121; Положительный результат анализа: > 0,121;
Отрицательный результат анализа: < 0,121.
ПРЕПАРАТЫ
Таблица 5. Показатели оптической плотности (ОП) при титровании методом ИФА образцов трех серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита (данные тестирования в наборе реагентов «NovaLisa TBE / FSME IgG - ELISA»
№ п/п Серия Иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита Количество исследованных образцов Показатели ОП растворов в лунках соответствующих разведений образцов разведения
1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600
1 Т32 3 1,82*+0,023 1,43+0,004 0,96+0,007 0,67±0,014 0,38±0,004 0,21+0,008 0,13+0,001
2 П569 3 1,73+0,015 1,38+0,030 0,92+0,035 0,62±0,028 0,35±0,029 0,19+0,010 0,12+0,007
3 П567 3 1,80 + 0,032 1,37 + 0,042 0,91+0,004 0,60±0,030 0,33 ± 0,007 0,18 + 0,012 0,12 + 0,004
Примечания. Критерии оценки результатов ИФА (Инструкция
Показатели оптической плотности (ОП 450/620 нм):
Контрольные реагенты:
-стандарты ^Ти/мл) * *
0 N^^<0,200
50 N^^>0,200
130 N^^>0,400
200 N^^>0,800
300 N^^>1,200
Учет результатов анализа:
Положительный результат >110 NTU/мл
Отрицательный результат <55 NTU/мл
Серая зона (неопределенный результат) 55-110 NTU/мл
по применению набора реагентов): *ОПобр. - оптическая плотность в лунках с исследуемым образцом n=3; (X+m), где Х - средняя арифметическяя, m - ошибка средней;
Контрольные реагенты, комплектующие набор «Nova Lisa ТВЕ /FSME IgG - ELISA» (значения ОП стандартов, полученные при тестировании): 0 NTU /мл - 0,018 50 NTU/ мл - 0,223 130 NTU /мл - 0,635 200 NTU /мл - 1,241 300 NTU/мл - 2,044
"NTU/мл - единицы активности Nova Tec Units.
лина против КЭ в зарубежном наборе реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса О к вирусу КЭ (NovaLisa ТВЕ^МЕ-1дО^^А). Использованы те же разведения образцов иммуноглобулина против КЭ от 1:400 до 1:25600. Выявлено, что значения ОП по разведениям для образцов трех серий препарата имеют близкие показатели и воспроизводимы по среднеарифметическим величинам ОП.
Метод учета результатов ИФА (положительный и отрицательный результат анализа) в данном наборе реагентов предусматривает, согласно Инструкции по применению, обязательное использование калибровочных стандартных образцов с определенными показателями единицы активности ^Т11/мл). Для положительного показателя анализа установлено значение >110 NTU/мл, для отрицательного - значение <55 NTU/мл, серая зона (неопределенный результат) - 55-110 NTU/мл.
В проведенном нами тестировании значения NTU/ мл в калибровочных стандартных образцах набора соответствовали следующим показателям ОП (что укладывалось в требования Инструкции по применению):
0 NTU/мл 0.018
50 NTU/мл 0.223
130 NTU/мл 0.635
200 NTU/мл 1.241
300 NTU/мл 2.044
Сопоставляя эти показатели ОП калибровочных стандартов с активностью в единицах NTU/мл, согласно Инструкции по применению на использованный набор, были установлены положительные результаты ИФА при значении ОП = 0,635, что соответствовало 130 NTU/мл (т.е. >110 NTU/мл) и отрицательные значения в реакции ИФА при значении ОП = 0,223,что соответствовало 50 NTU/мл (т.е. менее 55 NTU/мл).
Сравнивая эти значения ОП калибровочных стандартов с данными ОП при тестировании образцов трех серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, определяли положительный или отрицательный результат ИФА в соответствующем разведении исследуемого образца иммуноглобулина. Так ИФА реакция была положительной (ОП = 0,600; 0,620; 0,670) для разведения препарата 1:3200; в разведении 1:6400 (ОП = 0,330; 0,350; 0,380) реакция определялась как серая зона, т.е. неопределенный результат.
Таким образом, значения максимального разведения образцов с положительной реакцией, равные 1:3200 (1:6400) были определены как титры иммуноглобулина класса О против КЭ в ИФА в наборе реагентов «NovaLisa TBE/FSME-IgG-ELISA». Более низкие значения титра иммуноглобулина класса О при тестировании образцов серий препарата в данном наборе реагентов по сравнению с титрами, полученными на отечественном наборе реагентов, можно объяснить особенностями конструкции набора, методом учета результатов с применением калибровочных стандартов в единицах активности производителя ^^/мл) и, возможно, использованием антигена вируса КЭ европейского генотипа для приготовления планшета-иммуносорбента.
Для определения в ИФА концентрации иммуноглобулина класса О к вирусу КЭ в образцах серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в перспективе необходима разработка стандартного образца (СО) иммуноглобулина против клещевого энцефалита, калиброванного по содержанию специфического иммуноглобулина класса О в единицах активности.
С33
Таблица 6. Определение иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита в ИФА (набор реагентов «ВектоВКЭ- IgG») в образцах 58 серий препарата «Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита», производитель ФГБУ «НПО «Микроген»
Производство (филиалы НПО «Микроген) Количество исследованных серий Титр антител (иммуноглобулинов класса G) к вирусу КЭ в ИФА*
1:6400 1:12800 1:25600
г. Томск 28 б 20 2
г. Пермь 12 - 8 4
г. Уфа 6 - 3 3
г. Хабаровск 5 - 2 3
г. Екатеринбург 4 1 - 3
г. Омск 3 - 3 -
Всего 58 7 /12,1%** 3б /62,0% 15 /25,9%
*За титр иммуноглобулина класса в в исследуемом образце препарата принимали максимальное разведение, при котором в ИФА значение оптической плотности в лунках было равно или более ОП критической (ОПкрит.); вычисление значения ОПкрит. проводилось по формуле в соответствии с Инструкцией по применению набора.
**7 /12,1% - числитель: количество образцов препарата с данным показателем титра; знаменатель: % от общего числа исследованных образцов.
III. Определение содержания специфических иммуноглобулинов класса G в образцах 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита методом ИФА с применением отечественного коммерческого набора реагентов для ИФА - «Векто ВКЭ -IgG». После получения удовлетворительных результатов по воспроизводимости данных по содержанию иммуноглобулина G к ВКЭ в наборах реагентов отечественного и зарубежного производства в дальнейшем для тестирования образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита нами был выбран отечественный набор для ИФА - «Векто ВКЭ - IgG».
Набор реагентов для ИФА «Векто ВКЭ - IgG», производства ЗАО «Вектор-Бест» разработан более 10 лет тому назад, зарегистрирован в РФ и с успехом применяется для диагностики КЭ, мониторинга этой инфекции, для изучения иммунного статуса привитых против КЭ многими российскими специалистами [15, 16].
Нами было проведено тестирование образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в вышеуказанном наборе реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулина класса G. Использовали подобранное нами исходное разведение (1:400-1:800) исследуемых образцов этого препарата.
Результаты представлены в таблице 6 и на рисунке 2.
На представительном количестве образцов серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита показана возможность выявления специфических иммуноглобулинов класса G по титру -соответствующему максимальному разведению препарата с положительным результатом анализа.
Согласно данным таблицы 6 и рисунка 2, наибольшее количество образцов серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита содержало иммуноглобулины класса G к вирусу КЭ в титре 1:12800 и 1:25600, образцы 7 серий - в титре 1:6400.
11600 ++
4 3241»
х
х
& J&2M
X
ä 1&0М
I
i экю 3
* 6400 й ijoa
ИФА
пргплрл □
рис. 2. определение уровня иммуноглобулинов класса в к вирусу кЭ в образцах иммуноглобулина человека против КЭ, методом ИФА.
Таким образом, при исследовании образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита показано, что титры иммуноглобулинов класса в к вирусу КЭ в ИФА превышают в 10-40 раз титры антител, определяемых в РТГА.
Выводы:
1. Показана возможность дополнительной характеристики препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита по содержанию иммуноглобулинов класса в при титровании образцов 58 серий этого препарата методом ИФА в наборе реагентов отечественного производства «Векто ВКЭ - 1дв».
2. Подобраны условия проведения ИФА для выявления иммуноглобулинов класса в к вирусу КЭ в препарате Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита. Подтверждена специфичность выявления иммуноглобулинов класса в к вирусу КЭ параллельными исследованиями препаратов иммуноглобулинов
*
ПРЕПАРАТЫ
человека нормальных (Иммуновенин, Пентаглобин, Плазма для фракционирования, субстанция), не содержащих антитела к вирусу КЭ по данным РТГА.
3. Воспроизводимость метода ИФА в применении к титрованию препарата Иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита подтверждена при параллельном титровании образцов трех серий препарата в трехкратном повторении в двух наборах реагентов для ИФА отечественного и зарубежного производства.
Литература:
1. Воронкова Г.М., Николаева С.П., Захарычева Т.А., Воробьева М.С., Шарыгин С.Л. Лечебный эффект донорских специфических иммуноглобулинов при клещевом энцефалите // Биопрепараты. 2005. № 2 (18). С. 15.
2. Козлова И.В., Злобин В.И., Воробьева М.С., Вер-хозина М.М. Иммуноглобулины и тест-системы для профилактики и диагностики клещевого энцефалита // Экспресс-диагностика и экстренная профилактика иксодовых клещевых инфекций. М. 2009.
3. Пеньевская Н.А. Оценка эффективности этиотроп-ной профилактики инфекций, передающихся клещами: проблемы теории и практики. Омск. 2010. 229 с.
4. Субботина Л.С. Результаты использования метода ELISA при изучении клещевого энцефалита и бешенства // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1985. № 1. С. 73-77.
5. Билалова Г.П. Вакцина клещевого энцефалита «ЭнцеВир»: иммунобиологические и клинические испытания: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Уфа. 2003.
6. Инструкция по применению: «ЭнцеВир», вакцина клещевого энцефалита культуральная очищенная концентрированная инактивированная сорбированная, производства ФГУП «НПО «Микроген», PN000763/01 - 180309/.
7. Инструкция по применению: «Вакцина клещевого энцефалита культуральная, очищенная, концентрированная, инактивированная, сухая», производства ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», PN003793/01.
8. Инструкция по применения лекарственного препарата для медицинского применения Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита.
9. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 2010. гл. 6. раздел 6.4.
10. Фармакопейная статья предприятия ЛС-001279-010811: Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, раствор для внутримышечного введения.
11. Инструкция по применению набора реагентов Диа-гностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ.
12. Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита «Век-то ВКЭ - IgG».
13. Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита «NovaLisa TBE /FSME IgG-ELISA».
14. Островская Л.А., Верета Л.А., Мжельская Т.В. и др. Штамм вируса клещевого энцефалита № 139 для приготовления гемагглютинирующего инактиви-рованного диагностикума (Авт. Свидетельство на изобретение № 107/ 1634 от 8.10.83).
15. Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Бархалева О.А. и др. Иммунный ответ при экспресс-иммунизации против клещевого энцефалита вакцинами «ЭнцеВир» (Россия) и «ФСМЕ - Иммун» (Австрия) // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2009. № 5 (48). С. 61.
16. Николаева С.П., Воронкова Г.М., Мжельская Т.В. и др. Специфическая диагностика клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов в Хабаровском крае // Биопрепараты. 2005. № 2 (18). С. 11.
17. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Изд-во медицинской литературы, 1962. С. 16.
18. Гланц С. Медико-биологическая статистика, М. 1999. С . 32-36.
19. ГОСТ Р ИСО 16269-2004: Статистическое представление данных. Медиана.
с
