CC BY
17УДК 616-092.9:612.351.1:577.151.63:577.124.8 https://doi.org/10.29296/25877313-2020-12-01
© Коллектив авторов, 2020
ВЫЯВЛЕНИЕ РНК SARS-COV2 С ПОМОЩЬЮ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ ПЕТЛЕВОЙ АМПЛИФИКАЦИИ С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ МЕТОДОМ АНАЛИЗА КРИВЫХ ПЛАВЛЕНИЯ
И.П. Оскорбин
к.б.н., мл. науч. сотрудник, Институт химической биологии Г.Ю. Шевелёв к.х.н., зав. лабораторией, Институт химической биологии E-mail: [email protected] К.А. Проняева лаборант,
Институт химической биологии A.A.Степанов к.м.н., зав. лабораторией, Институт химической биологии Д.В. Пышный
д.х.н., чл.-корр. РАН, директор института,
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) М.Л. Филипенко
к.б.н, зав. лабораторией,
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск)
и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск)
и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск)
Актуальность. В связи с продолжающейся пандемией COVID-19, вызванной коронавирусом SARS-CoV2, существует острая потребность в диагностических тестах для выявления РНК вируса SARS-CoV2. Наиболее широко используемый метод ОТ-ПЦР позволяет получить результаты тестирования в течение 1,5-2 часов. Вместе с тем в связи с нехваткой пропускной способности диагностических лабораторий представляется необходимой разработка более быстрых методов тестирования. Цель исследования. Создание метода выявления РНК коронавируса SARS-CoV2 с помощью мультиплексной изотермической петлевой амплификации (LAMP) с обратной транскрипцией посредством анализа кривых плавления.
Материал и методы. В качестве стандартных образцов использовали сконструированную плазмиду с фрагментом генома SARS-CoV2 и фага MS2, фрагменты геномной РНК SARS-CoV2 и фага MS2. Клинические образцы (назофарингеальные мазки), получали от пациентов ЦНМТ ИХБФМ СО РАН; РНК выделяли с помощью набора «РИБО-преп» ЦНИИ Эпидемиологии (Москва, Россия). LAMP проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad; США). Аналитические характеристики LAMP определяли с помощью разведений стандартных образцов. Клиническую чувствительность и специфичность мультиплексной LAMP оценивали, проводя тестирование клинических образцов одновременно LAMP и ОТ-ПЦР.
Результаты. Подобраны праймеры и оптимизированы условия для проводения детекции с помощью LAMP участков РНК SARS-CoV2 и фага MS2, который служил внутренним контролем выделения РНК и амплификации. Мультиплексирование было основано на анализе кривых плавления продуктов амплификации. Предел чувствительности мультиплескной LAMP составил 20 молекул РНК SARS-CoV2 на реакцию. Конкордантность результатов тестирования 40 клинических образцов сравнительно с ОТ-ПЦР в реальном времени составила 92%.
Выводы. Разработан метод для выявления РНК коронавируса SARS-CoV2 на основе мультиплексной изотермической петлевой амплификации. Метод, основанный на мультиплексной LAMP, может быть использован как альтернатива ПЦР в диагностической практике для экономии машинного времени и времени персонала.
Ключевые слова: SARS-CoV2, коронавирус, изотермическая петлевая амплификация, LAMP, мультиплексная амплификация.
Для цитирования: Оскорбин И.П., Шевелёв Г.Ю., Проняева К.А., Степанов A.A., Пышный Д.В., Филипенко М.Л. Выявление РНК SARS-CoV2 с помощью мультиплексной изотермической петлевой амплификации с обратной транскрипцией методом анализа кривых плавления. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020;23(12):3-10. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-12-01
Вирус SARS-CoV2, относящийся к роду Beta-coronavirus, является причиной пандемии корона-вирусной инфекции COVID-19, которая продолжается по состоянию на ноябрь 2020 г. Как следствие, возникла чрезвычайно острая потребность в диагностических тестах для выявления РНК вируса SARS-CoV2. Наиболее распространённые используемые тест-системы основаны на ПЦР в режиме реального времени, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР в реальном времени). ОТ-ПЦР позволяет получить результаты в течение 1,5-2 ч с момента начала анализа РНК. Вместе с тем в связи с резко возросшей нагрузкой на диагностические лаборатории и ограниченным количеством специальных приборов для проведения ОТ-ПЦР (амплификаторов), время выполнения анализа стало фактором, лимитирующим общее число тестов, проводимых в течение рабочего дня. Иными словами, в целях увеличения пропускной способности лабораторий представляется необходимой разработка более быстрых диагностических методов.
За последние 30 лет на фоне бурного развития молекулярной биологии разработано множество различных подходов амплификации нуклеиновых кислот, альтернативных ПЦР. Проведение реакции при постоянной температуре позволяет отказаться от использования сложных и дорогостоящих амплификаторов, за счет чего становятся возможными миниатюризация оборудования для проведения реакции амплификации и разработка устройств для тестирования вне лабораторий у постели больного (point-of-care). В ряду методов изотермической амплификации особое место занимает изотермическая петлевая амплификация (LAMP, loop-mediated isothermal amplification [1]). LAMP основана на использовании цепь-вытес-няющей активности некоторых ДНК-полимераз и 2-3 пар олигонуклеотидных праймеров. Детекция результатов амплификации может осуществляться невооруженным глазом колориметрически, с помощью флуоресцентных интеркалирующих красителей или зондов, турбидиметрически или электрохимически, как в режиме реального времени, так и по окончании реакции. На основе LAMP разработано множество тестов для выявления инфекционных агентов сельскохозяйственных животных и растений, а также человека, в том числе вирусов гриппа, Зика, возбудителей туберкулёза и
малярии [2-5]. Чувствительность и специфичность LAMP не уступают ПЦР; вместе с тем LAMP более устойчива к ингибиторам и позволяет получить результаты тестирования в 2-3 раза быстрее (30-40 мин против 1,5-2 ч).
В силу своих преимуществ перед ПЦР при сохранении чувствительности и специфичности, LAMP является перспективным методом для создания диагностических тестов с целью выявления РНК вируса SARS-CoV2. В течение 2020 г. создано несколько подобных тестов, часть из которых прошла сертификацию и используется в реальной клинической практике [6, 7]. Следует отметить, что основное внимание исследователей было сосредоточено на создании тестов на основе LAMP для диагностики у постели больного вне лабораторий. Вместе с тем LAMP может использоваться в режиме реального времени в рамках диагностических лабораторий, что позволит экономить аппаратное время и увеличить пропускную способность тестирования.
Мультиплексирование - амплификация двух и более фрагментов ДНК в одной реакционной смеси. С помощью мультиплексирования появляется возможность детектировать одновременно несколько патогенов, при этом уменьшается себестоимость тестирования. Кроме того, при мультиплексировании достигается одновременная амплификация внутреннего контроля реакции или внутреннего контроля выделения ДНК или РНК из образца, что позволяет отслеживать качество выделения тестируемых образцов нуклеиновых кислот и работоспособность реагентов для обратной транскрипции и амплификации. Мультиплексирование LAMP возможно с помощью модифицированных олигонуклеотидов, в том числе флуоресцентно меченых, или плавления продуктов амплификации в присутствии интеркалирующих красителей [8]. В последнем случае различение продуктов происходит за счёт характеристических для каждого продукта температур плавления.
Цель исследования - разработка метода выявления РНК вируса SARS-CoV2 с помощью мультиплексной изотермической петлевой амплификации, сопряженной с реакцией обратной транскрипции, содержащий внутренний контроль всех стадий диагностического процесса, дифференцируемый от SARS-CoV2 специфичного ам-пликона с помощью анализа кривых плавления.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клинические образцы (назофарингеальные мазки) получали от пациентов ЦНМТ ИХБФМ СО РАН (г. Новосибирск). Все участвовавшие пациенты подписали информированное согласие на проведение исследования, которое одобрено локальным этическим комитетом ИХБФМ СО РАН. Проведение локального клинического исследования утверждено на заседании учёного совета ИХБФМ СО РАН 22 июля 2020 г.
Фрагмент ДНК гена CoV2-E размером 200 п.н., комплементарный РНК вируса SARS-CoV2, получали с помощью ПЦР синтетическим образом из отдельных олигонуклеотидов по методу Polymerase Cycling Assembly (РСА).
Полученный фрагмент ДНК клонировали ре-стриктазно-лигазным методом в вектор pBlue-Script SK(+). Точность структуры плазмидных клонов, подтверждали секвенированием по методу Сэнгера (ЦКП «Геномика», ИХБФМ СО РАН; Россия). Плазмида pBlue Script SK(+) с геномом фага MS2 синтезирована искусственно (Shanghai Real GeneBio-tech, КНР). Рекомбинантные плазмидные ДНК выделены с помощью набора QIAGEN Plasmid MidiKit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя. Концентрацию полученных стандартных плазмидных ДНК определяли спектрофотометрически и флуорометрически с помощью набора Qubit™ BR («Invitrogen», США).
Стандарты РНК получали с помощью in vitro транскрипции, в качестве матрицы использовали линеаризованную плазмидную ДНК pBlue Script CoV2-E. Синтезированные фрагменты РНК очищали фенол-хлороформной экстракцией и осаждали изопропанолом. Очищенные фрагменты РНК растворяли в воде, обработанной ДЭПК и хранили при -80 °С.
Фаг MS2 выращивали, и фаговые частицы очищали, используя модифицированный протокол Sambrook и Rüssel («Evans», 1990). РНК фага MS2 очищали из фаговых частиц с помощью набора QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit («Qiagen», Германия) согласно протоколу производителя и хранили при -80 °С.
Изотермическую петлевую амплификацию ДНК в реальном времени проводили в 20 мкл. Реакционная смесь LAMP содержала 1-кратный реакционный буфер для Bst-полимеразы (20 MMTris-НС1рН8,8, 10 мМ (NH4)2S04, 150 мМ KCl, 0,1% Tween-20, 2 мМ MgS04), 1,4 мМ каждого дНТФ, по 0,2 мкМ внешних праймеров (F3/B3), 0,6 мкМ
петлевых праймеров (LF/BF), 1,6 мкМ внутренних праймеров (FIP/BIP), последовательности которых представлены в табл. 1, ДНК- или РНК-матрицу (тип и количество матрицы указаны ниже), 2 е.а. Gss-полимеразы из Geobacillus sp. 777, интеркали-рующий краситель SYTO-82 до концентрации 1 мкМ. При проведении LAMP с обратной транскрипцией в реакционную смесь добавляли 100 е.а. обратной транскриптазы M-MuLV («Биосан», Россия). Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США).
Программа включала в себя следующие стадии: отжиг праймеров и элонгацию при температуре 64 °С 90 циклов длительностью 20 с каждый с регистрацией сигнала флуоресценции на канале FAM; определение наработанных продуктов амплификации, их температуры плавления в диапазоне 70-95 °С после амплификации. При проведении LAMP с обратной транскрипцией добавляли в программу перед амплификацией инкубацию при 50 °С в течение 10 мин. Результаты изотермической амплификации оценивали по параметру Tt (time-to-threshold - время до пересечения кривой накопления продукта амплификации порогового значения). Все реакции LAMP проводили в трех повторах.
Аналитическую чувствительность мультиплексной LAMP оценивали, варьируя количество РНК-матрицы в реакционной смеси. Мультиплексную LAMP проводили с 1-кратными прай-мерами CoV2-E и 0,5-кратными праймерами MS2 в условиях, описанных выше. Количество РНК-матрицы CoV2-E составляло 100, 50, 20 или 10 молекул в реакционной смеси на фоне 12000 молекул РНК фага MS2. С каждой концентрацией РНК CoV2-E проводили мультиплексную LAMP в 20 технических повторах. О наличии амплификации РНК CoV2-E судили по появлению характеристического пика на графике плавления продуктов амплификации. За предел чувствительности принимали концентрацию РНК CoV2-E, при которой во всех технических повторах появлялся пик плавления продукта амплификации CoV2-E.
Аналитическую специфичность оценивали in silico, проверяя гомологию праймеров с геномами наиболее распространённых вирусных патогенов человека, вызывающих респираторные инфекции. Сравнение проводили посредством алгоритма BLAST на сайте NCBI.
Клиническую чувствительность и специфичность мультиплексной LAMP оценивали, исполь-
зуя клинические образцы (назофарингеальные мазки), полученные от пациентов ЦНМТ ИХБФМ СО РАН. РНК из клинических образцов выделяли с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-
преп» ЦНИИ Эпидемиологии (Москва, Россия) согласно инструкции производителя. Выделенную РНК тестировали на наличие РНК вируса SARS-CoV2 посредством ПЦР в реальном времени, а также с помощью мультиплексной LAMP.
Таблица 1. Список использованных в работе олигонуклеогидных праймеров и зондов
Название 5' -последовательность-3'
2019-nCoV-Cll-F С AC ACGAATTC GCC TTTGTAAGC AC AAGC TGA EcoRI
2019-nCoV-Cll-R CACACAAGCTTAAGAAGGTTTTACAAGACTCACGTTAA Hindlll
PMTL-1 CTTCGCTATTACGCCAGCT
PMTL-2 GC GGATAAC AATTTC AC AC AG
CoRE-F2 GCCTTTGTAAGCACAAGCTG
CoRE-B2 AAGAAGGTTTTACAAGACTCACGT
CoRE-LF С ATCC TTAC TGC GC TTC GAT
CoRE-LB TAACGTACCTGTCTCTTCCGAAA
CoRE-FIP GC AAGAAAAAGAAGTAC GC TATTAAC TAGAGTAC GAACTTATGTACTC ATTC
CoRE-BIP CGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGATATTGCAGCAGTACGCACAC
MS2-1-FIP CTCCTGAGGGAATGTGGGAACCCCGGCGTGCGCGTTAT
MS2-1-BIP GCCAGCGAGCTCTCCTCGGGCACCCGTGCTCTTTCGA
MS2-1-F3 CCGACAGCATGAAGTCCG
MS2-1-B3 AGCCCGCCCACCTTTC
MS2-1-LB GTTAGCCACTCCGAAGTGCG
MS2-1-LF GCTGACCGAGGGACCCC
N_Sarb_F CACATTGGCACCCGCAATC
N_Sarb_R GAGGAACGAGAAGAGGCTTG
N_Sarb_P FAM-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-BHQ1
E_Sarb_F AC AGGTAC GTTAATAGTTAATAGC GT
E_Sarb_R ATATTGC AGC AGTAC GC AC AC A
E_Sarb_P HEX-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ2
MS2-5-F GTACGAGGAGAAAGCCGGTTTC
MS2-5-R GTTCTGCGGCACTTCGATG
MS2-5-P FAM-TCCCTCGACGCACGCTCCTGCT-BHQ1
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор праймеров для LAMP. Дизайн мультиплексной OT-LAMP для выявления вируса SARS-CoV2 предполагает одновременную детекцию двух молекул РНК - участка геномной РНК вируса SARS-СоV2 и участка геномной РНК фага MS2. Последний может использоваться в качестве внутреннего контроля выделения РНК и добавляется в тестируемые клинические образцы непосредственно перед выделением. Таким образом, при введении в тест-систему внутреннего контроля выделения нуклеиновой кислоты и амплификации снижается вероятность ложноотрица-тельных результатов, связанных с некорректной обработкой клинических образцов.
В качестве мишеней для праймеров LAMP выбрали консервативный регион геномной РНК вируса SARS-CoV2, кодирующий участок белка Е. Праймеры подбирали в соответствии с рекомендациями, размещенными на сайте primerexplorer.jp. По аналогичным критериям отбирали праймеры для LAMP РНК фага MS2 (см. табл. 1).
Стандартными образцами ДНК для оценки эффективности LAMP служила сконструированная плазмида на основе вектора pBlueScript II SK(+) и фрагмента генома SARS-CoV2 длиной 200 п.н. В качестве стандартов РНК использовали фрагменты РНК, полученные с помощью транскрипции in vitro по матрице плазмид с фрагментом генома SARS-CoV2, а также ДНК и РНК фага MS2. Концентрацию всех стандартов определяли с помощью капельной цифровой ПЦР на платформе QX200 («Bio-Rad», США), праймеры и TaqMan-зонды для которой приведены в табл. 1.
Проверка работоспособности дуплексной LAMP CoV2-E-MS2. Мультиплексирование LAMP само по себе является сложной задачей, решение которой требует нетривиальных подходов. В настоящей работе для мультиплексирования LAMP использованы флуоресцентный интеркалирующий краситель и анализ кривых плавления продуктов амплификации - способ, успешно применяемый в ПЦР для решения аналогичной задачи, а также описанный в двух работах для LAMP [8, 9]. Такой подход позволяет проводить анализ на стандартных амплификаторах для ПЦР в реальном времени и не нуждается в дорогостоящих флуоресцентно-меченых олигонуклеотидах или специализированном оборудовании.
На начальном этапе работы сравнивали эффективность амплификации с помощью моно-плексов LAMP CoV2-E, MS2 с дуплексом MS2-CoV2-E. Для этого проводили LAMP, используя в качестве матрицы титры плазмидных стандартов CoV2-E и MS2, а также праймеры на CoV2-E и MS2. Эффективность работы дуплекса оценивали с каждым титром плазмидных стандартов по отдельности. Для дуплекса смешивали праймеры на CoV2-E и MS2 в соотношении 1:1, финальная концентрация праймеров была стандартной и равнялась таковой для моноплексов. Пороговое время для дуплекса со всеми концентрациями матрицы равнялось времени для моноплексов. Таким образом, было установлено, что при смешивании наборов праймеров не происходит ингибирования амплификации ни фрагмента CoV2-E, ни MS2. Температуры плавления CoV2-E и MS2 различались на 9 °С, и пики плавления соответствующих продуктов в дуплексе были чётко видны.
Известно, что при in vitro амплификации нуклеиновых кислот одновременная амплификация нескольких фрагментов может быть затруднена в силу разной эффективности реакции для разных фрагментов либо образования димеров праймеров. Снижение эффективности амплификации может приводить к падению общей чувствительности анализа. Однако вопреки нашим ожиданиям, само по себе наличие двух наборов праймеров для амплификации разных мишеней не приводило к падению амплификации ни фрагмента MS2, ни фрагмента SARS-CoV2.
Подбор оптимальной концентрации праймеров для LAMP MS2. Эффективность LAMP понижалась при непосредственной амплификации фрагментов РНК SARS-CoV2 и MS2, что закономерно приводило к снижению чувствительности выявления РНК SARS-CoV2. Возникшая проблема успешно решена понижением концентрации праймеров контрольного фрагмента MS2 по методу, часто практикуемому для решения аналогичной проблемы в ПЦР. Для достижения максимальной чувствительности дуплексной LAMP титровали концентрацию праймеров LAMP для MS2 в пределах от 1-кратной до 0,25-кратной стандартной концентрации, в то время как концентрация праймеров LAMP для CoV2-E была фиксирована и составляла 1-кратную величину. В качестве матрицы использовали плазмидные стандарты, сравнивали значе-
ния Tt и картин плавления для моноплексов прай-меров CoV2-E, MS2 и их дуплекса. По соотношению значений Tt в моноплексе и высоты пика плавления в дуплексе для дальнейшей работы выбрали 0,5-кратные праймеры MS2.
Выбор оптимальной концентрации контрольной РНК MS2. На последнем этапе оптимизации мультиплексной LAMP определяли оптимальную концентрацию контрольной матрицы в виде РНК фага MS2. Для этого сравнивали эффективность амплификации стандартов РНК CoV2-E с использованием праймеров для CoV2-E или дуплекса MS2-CoV2-E на фоне разной концентрации РЖ MS2 (12000, 2500 или 20 молекул на реак-
Meli Peak
6000 -r-r
70 75 80 8Б 90 9S
Temperature. Celsius
Результаты анализа кривых плавления продуктов LAMP при установлении предела детекции дуплекса MS2-CoV2. Представлены характеристические пики плавления продуктов LAMP, полученные с моноплексом CoV2-E и 103 молекул РНК CoV2-E (выделено квадратами), с моноплексом MS2 и 103 молекул РНК MS2 (выделено ромбами), с дуплексом MS2-CoV2-E 12000 молекулами на реакцию РНК MS и РНК CoV2-E: 100 молекулами (выделено окружностями), 50 молекулами (выделено треугольниками) и 20 молекулами (выделено крестами)
Таблица 2. Результаты сравнения мультиплексной LAMP MS2-CoV2-E с ОТ-ПЦР в реальном времени
ОТ-ПЦР Мультиплексная LAMP Всего
Положительные Отрицательные
Положительные 21 1 22
Отрицательные 2 16 18
Всего 22 18 40
цию). Эффективность амплификации CoV2-E оценивали по высоте соответствующего пика на графике плавления продуктов амплификации. Для дальнейшей работы в качестве внутреннего контроля выделения и амплификации использовали количество фага MS2, эквивалентное примерно 12000 копий РНК MS2 в реакционной смеси LAMP.
Оценка предела детекции. Предел детекции РНК коронавируса SARS-СоV2 с помощью мультиплексной LAMP оценивали, варьируя количество РНК CoV2-E в пределах 100-10 молекул на фоне 12000 молекул РНК MS2 в реакционной смеси. Всего использовали четыре концентрации РНК CoV2-E: 100, 50, 20 и 10 молекул в реакционной смеси, с каждой концентрацией проводили LAMP с праймерами MS2-CoV2-E в 20 технических повторах в одном запуске. Наличие РНК CoV2-E определяли по появлению соответствующего пика на графике плавления продуктов амплификации (рисунок). Пик плавления CoV2-E присутствовал во всех 20 технических повторах - для концентраций РНК CoV2-E 100, 50, 20 молекул в реакционной смеси, а также в 16 из 20 технических повторах для концентрации РНК CoV2-E 10 молекул на реакцию. Таким образом, предел детекции мультиплексной LAMP составил не менее 20 молекул РНК SARS-CoV2 в реакционной смеси.
Параметры разработанной дуплексной системы LAMP для выявления РНК SARS-CoV2 находятся на уровне опубликованных аналогичных тестов на основе моноплексной LAMP. Предел детекции моноплексной LAMP колеблется в районе 300-10 молекул вирусной РНК в реакции, конкор-дантность результатов с ПЦР составляет 92-95%. Таким образом, разработанный метод показал свою работоспособность и может быть использован для выявления иных нуклеиновых кислот иных патогенных организмов.
Клинические образцы. Валидацию мультиплексной LAMP MS2-CoV2-E проводили на 40 клинических образцах назофарингеальных мазков, РНК из которых получали с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп». Тестирование проводили двумя методами: 1) ОТ-ПЦР в режиме реального времени с помощью праймеров, рекомендованных ВОЗ [10] (табл. 1); 2) мультиплексной LAMP MS2-CoV2-E (табл. 2). Результаты тестирования обоими методами совпали для
31 образцов из 40. При этом для двух негативных по ОТ-ПЦР образцов, тестированных как позитивные по LAMP, показатель Cq ОТ-ПРЦ в реальном времени превышал 35. Таким образом, конкор-дантность результатов мультиплексной LAMP с ОТ-ПЦР в реальном времени составила 92%.
Следует отметить, что у LAMP в целом, а также у использованного подхода мультиплексирования существует ряд ограничений. Так, в силу большого количества амплифицируемого продукта реакционные смеси LAMP являются источником потенциальной контаминации лабораторного оборудования и поэтому требуют аккуратного обращения и надлежащей утилизации. Расход праймеров для LAMP превышает таковой для ПЦР: для LAMP требуется шесть праймеров вместо двух, причём в более высокой концентрации. Ферменты, используемые для LAMP, - мезофильные ДНК-полимеразы - менее доступны и производятся в меньшем количестве по сравнению с Taq-полимеразой и ее аналогами для ПЦР. Выбранный способ мультиплексирования LAMP - анализ кривых плавления -требует аккуратного подбора праймеров и расчёта температуры плавления амплифицируемых фрагментов так, чтобы их пики плавления не перекрывались.
Таким образом, LAMP, как и ПЦР имеет свой специфический набор требований и ограничений, а выбор метода тестирования должен основываться на аккуратном учёте особенностей конкретного подхода и возможностей диагностической лаборатории.
ВЫВОДЫ
1. Разработан метод выявления РНК корона-вируса SARS-CoV2 на основе мультиплексной изотермической петлевой амплификации. В одной пробирке проводили детекцию участков РНК SARS-CoV2 и фага MS2, последний служил внутренним контролем выделения РНК и амплификации. Мультиплексирование основывалось на анализе кривых плавления продуктов амплификации. Предел чувствительности мультиплескной LAMP со-
ставил 20 молекул РНК SARS-CoV2 на реакцию.
2. Конкордантность результатов тестирования 40 клинических образцов в сравнении с ОТ-ПЦР в реальном времени составила 92%.
Благодарности
Работа выполнена в рамках бюджетного финансирования ИХБФ.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Notomi Т., Okayama Н., Masubuchi Н. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28(12): E63.
2. Yongkiettrakul S., Kampeera J., Chareanchim W. et al. Simple detection of single nucleotide polymorphism in Plasmodium falciparum by SNP-LAMP assay combined with lateral flow dipstick. Parasitol. Int. 2017; 66(1): 964-971.
3. Global Tuberculosis Programme. The use of loop-mediated isothermal amplification (ТВ-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis : policy guidance. 38 p.
4. Guo X.G., Zhou F.Z., Li Q. et al. Rapid and reliable diagnostic method to detect Zika virus by real-time fluorescence reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. AMES Express. Springer Verlag. 2018; 8(1).
5. Poon L.L.M., Leung C.S., Chan K.H., et al. Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(1): 427^130.
6. Park G.S., Ku K., Baek S.H. et al. Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). J. Mol. Diagnostics. Elsevier B.V. 2020; 22(6): 729-735.
7. Kitagawa F., Orihara F., Kawamura R. et al. Evaluation of rapid diagnosis of novel Coronavirus disease (COVID-19) using loop-mediated isothermal amplification. J. Clin. Virol. Elsevier B.V. 2020; 129.
8. Dong J., Xu Q., Li Ch. et al. Single-color multiplexing by the integration of high-resolution melting pattern recognition with loop-mediated isothermal amplification. Chem. Commun. Royal Society of Chemistry. 2019; 55(17): 2457-2460.
9. Xu G., GunsonR.N., Cooper J.M., Reboud J. Rapid ultrasonic isothermal amplification of DNA with multiplexed melting analysis-applications in the clinical diagnosis of sexually transmitted diseases. Chem. Commun. Royal Society of Chemistry. 2015; 51(13):2589-2592.
10. Corman V., Landt O., Kaiser M. et al. Diagnostic detection of Wuhan Coronavirus 2019 by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020; 25(3): 2000045. doi: 10.2807/1560-7917.ES .2020.25.3.2000045.
Поступила 9 ноября 2020 г.
DETECTION OF A SARS-C0V2 RNA USING MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION WITH MELTING CURVE ANALYSIS
© Authors, 2020 I.P. Oscorbin
Ph.D. (Biol.), Minor Researcher,
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS (Novosibirsk) G.Yu. Shevelev
Ph.D. (Chem.), Head of Laboratory,
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS (Novosibirsk) E-mail: [email protected] K. A. Pronyaeva Laboratory Assistant,
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS (Novosibirsk) A.A. Stepanov
Ph.D. (Med.), Head of Laboratory,
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS (Novosibirsk) D.V. Pyshny
Dr.Sc. (Chem.), Corr. Member of RAS,
Director of the Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS (Novosibirsk) M.L. Filipenko
Ph.D. (Biol.), Head of Laboratory,
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS (Novosibirsk)
Relevance. Ongoing COVID-19 pandemic caused by the SARS-CoV2 coronavirus urges the need for diagnostic tests to detect the RNA of the SARS-CoV2 virus. The most common method, RT-PCR, allows to obtain the test results within 1.5-2 hours. However, the lack of capacity of diagnostic laboratories necessitates a developing of more rapid testing methods.
Purpose of the study. The development of a method for a detection of SARS-CoV2 RNA using multiplex reverse transcription loopmediated isothermal amplification with melting curve analysis
Material and methods. The constructed plasmids with a fragment of the SARS-CoV2 genome and MS2 phage, fragments of the SARS-CoV2 genomic RNA and MS2 phage were used as standard samples. Clinical samples (nasopharyngeal swabs) were obtained from patients CNMTof ICBFM SB RAS. RNA was isolated using a «RIBO-prep» kit (Central research Institute of Epidemiology (Moscow; Russia)). LAMP was performed in a CFX96 thermocycler (Bio-Rad; USA). Analytical characteristics of LAMP were evaluated using dilutions of standard samples. The clinical sensitivity and specificity of multiplex LAMP were evaluated by testing clinical samples simultaneously with LAMP and RT-PCR.
Results. Primers were selected and conditions were optimized for a LAMP-based detection of SARS-CoV2 RNA and MS2 phage RNA, the latter served as an internal control of RNA isolation and amplification. Multiplexing was based on a melting curves analysis of amplification products. The limit of detection of the multiplex LAMP was 20 copies of SARS-CoV2 RNA per reaction. The concordance with real-time RT-PCR of the 40 clinical samples testing results was 92%.
Conclusion. We have developed a prototype of a multiplex LAMP-based test system for a detecting SARS-CoV2 coronavirus RNA. The developed approach can be used as an alternative to RT-PCR in diagnostic practice for saving of machine and personnel time.
Key words: SARS-CoV2, coronavirus, isothermal loop amplification, LAMP, multiplex amplification.
For citation: Oscorbin I.P., Shevelev G.Yu., Pronyaeva K.A., Stepanov A.A., Pyshny D.V., Filipenko M.L. Detection of a SARS-CoV2 RNA using multiplex reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with melting curve analysis. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2020;23(12):3-10. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-12-01
