CC BY
14
УДК 616.981.452
Г.Н.Одиноков, К.А.Никифоров
ВЫЯВЛЕНИЕ НОВЫХ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ДНК ЛОКУСОВ,
ОТЛИЧАЮЩИХ ШТАММЫ СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРА ОТ ШТАММОВ ДРУГИХ БИОВАРОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Проведен поиск вариабельных хромосомных локусов, отличающих штаммы Yersinia pestis средневекового и античного биоваров. У штаммов средневекового биовара выявлено наличие двух делеций размером 183 и 70 п.н. Показано, что первая делеция, локализованная в межгенном участке aceA - aceK после 22490 нуклеотида, присутствует у большинства изученных штаммов средневекового биовара, а вторая делеция в гене y1694 (1869687-1870825 п.н.) выявляется у всех штаммов средневекового биовара, выделенных на территории России и сопредельных стран.
Ключевые слова: возбудитель чумы, биовары, генетические отличия.
G.N.Odinokov, K.A.Nikiforov
Detection of New Variable DNA Loci That Distinguish Medievalis Biovar Strains of Plague Agent from the Strains of Other Biovars
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Variable chromosome loci have been searched, that differentiate Yersinia pestis strains of medievalis from antiqua biovars. The strains of medievalis biovar are shown to possess two deletions - 183 and 70 bps. The first deletion, localized in the inter-gene region aceA - aceK is present in the majority of medievalis biovar strains, the second one, in the gene y1694, is determined in all medievalis biovar strains isolated in the territory of Russia and neighboring countries.
Key words: plague agent, biovars, genetic differences.
Штаммы Yersinia pestis основного подвида делят на три биовара - античный, средневековый и восточный, каждый из которых сформировался в различные периоды внутривидовой эволюции возбудителя чумы. На территории Российской Федерации и сопредельных стран действует 45 природных очагов чумы, в которых циркулируют штаммы Y. pestis античного и средневекового биоваров. Генетические отличия штаммов этих биоваров, циркулирующих в различных ландшафтно-географических зонах, исследованы далеко не достаточно. Дифференциацию штаммов проводят по биохимическому признаку -редукции нитратов, в основе различной экспрессии которого лежит вариабельность единичного нуклеотида в гене периплазматической нитратредук-тазы napA. Штаммы античного биовара активны по этому признаку, в то время как изоляты средневекового биовара неспособны к денитрифицирующей активности.
Для выявления новых полиморфных ДНК локу-сов, отличающих штаммы средневекового и других биоваров возбудителя чумы, нами проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов штаммов Y. pestis средневекового (KIM10), античного (Antiqua, Nepal516 Z176003, D182038, D106004) и восточного (CO92) биоваров, представленных в базе данных NCBI GenBank, с помощью алгоритма BLAST, который позволил выявить наличие двух вариабельных локусов у штамма KIM10, отличных от штаммов других биоваров. Первый локус у
штамма К1М10 содержал делецию размером 183 п.н. после 22490 нуклеотида в межгенном участке асеА (21134-22441 п.н.) - асеК (22514-24241 п.н.). Второй вариабельный локус был расположен в гене у1694 (1869687—1870825 п.н.), который у штамма К1М10 включал делецию 70 п.н. после 811 нуклеотида от начала кодирующей последовательности.
На соответствующие вариабельные участки генома с помощью программы PrimerExpress были рассчитаны две пары праймеров, фланкирующие участки делеций в хромосомной ДНК. Они имели следующий состав: Med(-183)-S - CGTГОAGAAAGTCCAGCA. Med(-183)-As - GGCAGTGACCTCCAGAAA;
Med(-70)-S - AAGACCTTCGCCACCAGA. Med(-70)-As - CCAGGATTCGCCGATTCA. Амплификацию с парами праймеров Med(-183)-S-As и Med(-70)-S-As в ПЦР осуществляли по следующей схеме: 1 цикл при 94 °С - 5 мин. затем 35 циклов при 94 °С - 45 с. 55 °С - 1 мин. 72 °С - 45 си завершающий цикл 3 мин при 72 °С. Ожидаемые размеры образуемых амплификатов с парами праймеров Med(-183)-S-As и Med(-70)-S-As составляли у штаммов средневекового биовара 331 и 397 п.н.. у античного и восточного -514 и 467 п.н.
В дальнейшем анализ двух вариабельных ДНК локусов был проведен у 59 штаммов возбудителя чумы основного подвида (античного. средневекового и восточного биоваров). выделенных в природных очагах на территории России и зарубежных стран. В том числе средневековый биовар был представ-
1-9
ПЦР-анализ вариабельных локусов с парами праймеров Med(-70)-S-As (А) и Med(-183)-S-As (Б):
- штаммы средневекового биовара (М-567, М-956, М-928, С-528, С-781, C-761, С-763, С-765, С-621); 10-14 - штаммы античного биовара (А-744, 1/156, 14/1646, 1/220, 1691); 15-19 - штаммы восточного биовара (Sonche, Marsel, Israel, KM 715, Hamburg 15);
20 - отрицательный контроль
лен 9 штаммами: М-567 и М-956 (Волго-Уральский песчаный очаг), М-928 (Прикаспийский песчаный), С-528 (Северо-Западный Прикаспийский), С-781, C-761 (Центрально-Кавказский высокогорный), С-763, С-765, С-621 (Центрально-Кавказский высокогорный, Кубано-Малкинский район); античный - 5 штаммами: А-744, 1/156, 14/1646 (Аксайский высокогорный), 1/220 (Алайский высокогорный), 1691 (Верхненарынский высокогорный); восточный - 5 зарубежными штаммами: Sonche, Marsel, Israel, KM 715, Hamburg 15 (рисунок).
У большинства использованных в работе штаммов средневекового биовара в ПЦР с парой праймеров Med(-183)-S-As образовывались амплификаты ожидаемого размера - 331 п.н., за исключением изо-лятов (С-763, С-765, С-621) из Кубано-Малкинского района Центрально-Кавказского высокогорного очага, у которых отсутствовала делеция в 183 п.н., а размеры образуемых фрагментов составляли 514 п.н., как и у штаммов античного и восточного биоваров (рисунок, Б). Большую разрешающую способность показала вторая пара праймеров Med(-70)-S-As, с помощью которой характерная делеция выявлялась в ПЦР у всех штаммов средневекового биовара, у которых в ПЦР образовывались амплификаты размером 397 п.н., в то время как у изолятов античного и восточного - 467 п.н. (рисунок, А), что соответствовало ожидаемому результату.
Таким образом. нами были обнаружены новые вариабельные локусы. содержащие делеции размером 183 и 70 п.н.. которые отличают штаммы средневекового от штаммов других биоваров возбудителя чумы. В дальнейшем требуется провести биоинфор-мационный анализ этих сайтов для оценки их эволюционной значимости и возможности использования. совместно с ранее выявленными ДНК-мишенями. для реконструкции молекулярной генеалогии возбудителя чумы. Кроме того. в рамках проведения молекулярно-эпидемиологического мониторинга выделяемых штаммов У. реъиъ совместное использование двух пар праймеров Med(-183)-S-As и Med(-70)-S-As позволит просто. надежно и эффективно разделять штаммы античного и средневекового биоваров методом ПЦР без применения дорогостоящих и трудоемких секвенационных технологий.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12-04-31908.
Authors:
Odinokov G.N., Nikiforov K.A. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia. E-mail: [email protected]
Об авторах:
Одиноков Г.Н., Никифоров К.А. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Поступила 25.10.12.
