CC BY
2
Для корреспонденции
Постников Павел Викторович - кандидат химических наук,
начальник отдела допингового контроля НАДЛ МГУ
Адрес: 105005, Российская Федерация, г. Москва,
Елизаветинский пер., д. 10, стр. 1
Телефон: (499) 267-73-20
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0003-3424-0582
Постников П.В.1, Полосин А.В.1, Мочалова Е.С.1, Орджоникидзе З.Г.2, Никитюк Д.Б.3, Тутельян В.А.3
Выявление мельдония в моче добровольцев методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией после употребления молока коров, прошедших профилактический курс применения ветеринарного препарата Эмидонол®
Identification of meldonium in the urine of volunteers using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry after consumption of milk of cows treated with a preventive course of the veterinary drug Emidonol®
Postnikov P.V.1, Polosin A.V.1, Mochalova E.S.1, Ordzhonikidze Z.G.2, Nikityuk D.B.3, Tutelyan V.A.3
1 Национальная антидопинговая лаборатория (Институт) Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 105005, г. Москва, Российская Федерация
2 Государственное автономное учреждение здравоохранения города Москвы «Московский научно-практический центр медицинской реабилитации, восстановительной и спортивной медицины имени С.И. Спасокукоцкого Департамента здравоохранения города Москвы», 105120, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
1 National Anti-Doping Laboratory (Institute), M.V. Lomonosov Moscow State University, 105005, Moscow, Russian Federation
2 S.I. Spasokukotsky Moscow Centre for Research and Practice in Medical Rehabilitation, Restorative and Sports Medicine of Moscow Healthcare Department, 105120, Moscow, Russian Federation
3 Federal Research Centre for Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Постников П.В.; сбор данных - Постников П.В.; проведение экспериментальных исследований - Постников П.В., Полосин А.В.; обсуждение экспериментов и результатов - Постников П.В., Полосин А.В., Никитюк Д.Б.; написание текста - Постников П.В.; редактирование - Постников П.В., Орджоникидзе З.Г., Никитюк Д.Б., Тутельян В.А.; утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Благодарности. Авторы выражают благодарность ООО «Дельта-Ф» в лице генерального директора Шориковой О.В. и старшего специалиста отдела допингового контроля Воробьевой А.С. за помощь в проведении эксперимента и предоставление образцов молока для исследований.
Для цитирования: Постников П.В., Полосин А.В., Мочалова ЕС., Орджоникидзе З.Г, Никитюк Д.Б., Тутельян В.А. Выявление мельдония в моче добровольцев методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией после употребления молока коров, прошедших профилактический курс применения ветеринарного препарата Эмидонол®// Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 5. С. 94-103. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-5-94-103 Статья поступила в редакцию 02.09.2024. Принята в печать 26.09.2024.
Эмидонол® - отечественный антиоксидантный препарат, широко применяемый в ветеринарии как с профилактической целью, так и при патологических состояниях, связанных с кислородной недостаточностью. Продуктом его биотрансформации в организме животных является мельдоний, относящийся к модуляторам метаболизма и входящий в Запрещенный список Всемирного антидопингового агентства (ВАДА) с 2016 г. В представленной работе добровольцы однократно принимали образцы молока коров, прошедших 15-дневный курс ветеринарным препаратом полученные от одной из ферм
Подмосковья.
Цель исследования - изучение возможности качественного определения мельдония в образцах мочи после однократного употребления больших количеств молока коров, прошедших 15-дневный курс ветеринарным препаратом Эмидонол® 10%, и длительности выведения запрещенного в спорте модулятора метаболизма из организма с учетом критериев идентификации ВАДА методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС).
Материал и методы. Образцы молока отбирали на 15-й (последний) день инъекционного курса коровам лекарственным ветеринарным препаратом Эмидонол® 10%. Для исследований использовали образцы мочи добровольцев до и после однократного приема утром 3 стаканов (900 мл) свежего коровьего молока, собранные в течение 48ч. Добровольцы (n=4, возраст - 35-52 года, масса тела 65-93 кг, пол не учитывался) не принимали ранее препаратов мельдония, каких-либо биологически активных добавок к пище, а также молока, молочных и мясных продуктов за 4-5 дней до сдачи бланкового образца и во время исследований. Пробоподготовку образцов мочи проводили с применением метода «dilute and shoot». Для анализа использовали метод ВЭЖХ-МС/МС. Идентификацию мельдония осуществляли в режиме мониторинга селективных реакций (SRM) по следующим переходам и энергиям соударения: 147.1>147.1 (15), 147.1>132.1 (17), 147.1>59.1 (17), 147.1>58.1 (17), 147.1>42.1 (60).
Результаты. Установлено, что мельдоний достоверно определяется в образцах мочи добровольцев спустя 12 ч при идентификации с использованием 5 вышеуказанных SRM-переходов и в течение 36-40 ч с использованием переходов 147.1>59.1 (17), 147.1>58.1 (17) после однократного употребления 900 мл молока. Пик концентраций приходится на 5-10 ч после приема (оценочная концентрация в моче ~160-400 нг/мл) с последующим снижением до 2,5-5 нг/мл и ниже спустя 36-40 ч. Представлены профили выведения запрещенного модулятора в мочу.
Заключение. Показана принципиальная возможность качественной идентификации мельдония в образцах мочи добровольцев в течение 36-40 ч при разовом употреблении больших количеств молока коров, прошедших курс ветеринарным препаратом Эмидонол® 10%.
Ключевые слова: Эмидонол®; мельдоний; допинг-контроль; употребление молока; высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией
Emidonol is a Russian antioxidant drug, widely used in veterinary medicine both for prophylactic purposes and under pathological conditions associated with oxygen deficiency. The product of its biotransformation in animals is meldonium, which is a metabolic modulator and has been included on the Prohibited List by the World Anti-Doping Agency (WADA) since 2016. In the presented research, volunteers once consumed samples of milk from cows that had undergone a 15-day course of the veterinary drug Emidonol® 10%, obtained from one of the farms in the Moscow region.
Funding. The study had no sponsorship support.
Conflict of interest. The authors declare no conflicts of interest.
Contribution. Concept and design of the study - Postnikov P.V.; collecting the material - Postnikov P.V.; conducting experimental research -Postnikov P.V., Polosin A.V.; discussion of experiments and results - Postnikov P.V., Polosin A.V., Nikityuk D.B.; text writing - Postnikov P.V.; editing -Postnikov P.V., Ordzhonikidze Z.G., Nikityuk D.B., Tutelyan V.A.; approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
Acknowledgments. The authors express their gratitude to Delta-F LLC, represented by its General Director O.V. Shorikova and senior specialist of the
doping control department A.S. Vorobyeva, for their assistance in conducting the experiment and providing milk samples for research.
For citation: Postnikov P.V., Polosin A.V., Mochalova E.S., Ordzhonikidze Z.G., Nikityuk D.B., Tutelyan V.A. Identification of meldonium in the urine
of volunteers using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry after consumption of milk of cows treated with a preventive
course of the veterinary drug Emidonol®. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (5): 94-103. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-
93-5-94-103 (in Russian)
Received 02.09.2024. Accepted 26.09.2024.
The purpose of our research was to study the possibility of qualitative determination of meldonium in urine samples after drinking a large amount of milk using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) and to assess duration of urinary excretion of the prohibited in sport metabolism modulator in accordance with WADA identification criteria.
Material and methods. Milk samples were collected from the cows on the 15th (last) day of the injection course of the veterinary drug Emidonol® 10%. Urine samples from volunteers, collected before and within 48 hours after a single intake of 900 ml of fresh cow's milk have been examined. The volunteers (n=4, aged 35-52 years, body weight 65-93 kg, gender was not taken into account) had not previously taken meldonium, any dietary supplements, as well as milk, dairy and meat products within 4-5 days before submitting a blank sample and during the study. Sample preparation of urine specimens was carried out using the "dilute and shoot" method. The HPLC-MS/MS was used for analysis. Meldonium identification was carried out in selective reaction monitoring (SRM) mode using the following transitions and collision energies: 147.1>147.1 (15), 147.1>132.1 (17), 147.1>59.1 (17), 147.1>58.1 (17), 147.1>42.1 (60). Results. It was found that meldonium is reliably determined in urine samples of volunteers after 12 hours when identified by HPLC-MS/MS using the 5 above-mentioned SRM transitions, and for 36-40 hours using the transitions 147.1>59.1 (17), 147.1>58.1 (17) after a single consumption of 900 ml of milk. The peak concentrations occur at 5-10 hours after administration (estimated concentration in urine from 160 to 400 ng/ml) with a subsequent decrease to 2.5-5 ng/ml and below after 36-40 hours. The excretion profiles of the prohibited modulator in urine are presented. Conclusion. The principal possibility of qualitative determination of meldonium in urine samples of volunteers over 36-40 hours with a single consumption of large quantities of milk from cows that have undergone a course of treatment with the veterinary drug Emidonol® 10% was demonstrated.
Keywords: Emidonol®; meldonium; doping control; milk consumption; high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Змидонол (3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцинат) -отечественный ветеринарный препарат, оказывающий антиоксидантное, мембранопротекторное и антигипок-сическое действие [1]. Он представляет собой сложную химическую структуру, состоящую из дисукцината метилэтилгидроксипиридина (эмоксипина) и мельдония (рис. 1). Его применение у мелкого и крупного рогатого скота, домашних животных и птицы разрешено Россельхознадзором как в профилактических целях, так и при патологических состояниях, сопровождающихся гипоксией, в виде 5, 10 и 20% раствора [2]. Препарат доступен без рецепта в ветеринарных аптеках и зоомагазинах.
Для применения у крупного рогатого скота рекомендованная концентрация препарата составляет 10%. Попадая в организм животного, Эмидонол® подвергается биотрансформации с образованием молекул мельдония и мексидола (эмоксипина). Эффект последнего, как считает ряд авторов [3], может приводить к увеличению производительности у спортсменов и сопоставим с действием допинговых препаратов. Таким образом, молочные и мясные продукты оказываются контаминированными веществом, внесенным в Запрещенный список Всемирного антидопингового агентства (ВАДА) в соответствии со ст. S4 п. 4 «Модуляторы метаболизма» [4].
На сегодняшний момент опубликовано несколько статей, посвященных тематике определения данного запрещенного вещества в пищевых продуктах с целью допинг-контроля методами сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (СВЭЖХ-МСВР) [5] или тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения (ВЭЖХ-МС/МСВР) [6, 7], однако исследуемыми образцами в них были либо мясо и молоко [5], либо моча добровольцев после приема пастеризованного молока с добавлением мельдония [6]. В нашем исследовании добровольцы однократно принимали образцы (900 мл, или 3 стакана) молока коров, прошедших 15-дневный курс ветеринарным препаратом Эми-донол® 10%, полученные с одной из ферм Подмосковья, после чего проводили качественное определение мель-дония в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектроме-трией (ВЭЖХ-МС/МС).
Согласно информации Российского антидопингового агентства «РУСАДА» с 2003 по 2021 г. до 30,3% от общего количества положительных проб спортсменов содержали мельдоний и он являлся самым употребляемым допинговым веществом1 [8, 9]. В связи с этим проблема контаминации пищевых продуктов мельдонием и его определения чрезвычайно важна как для отечественных спортсменов, так и для антидопингового сообщества в целом.
1 РУСАДА: количество положительных проб на мельдоний в 2024 году сократилось. [Интернет-ресурс] URL: https://rsport. ria.ru/20240522/rusada-1947725070.html (дата обращения: 17.07.2024).
Цель исследования - изучение возможности качественного определения мельдония в образцах мочи после однократного употребления больших количеств молока коров, прошедших 15-дневный курс ветеринарным препаратом Эмидонол® 10%, и длительности выведения запрещенного в спорте модулятора метаболизма из организма с учетом критериев идентификации ВАДА методом ВЭЖХ-МС/МС.
Материал и методы
Образцы для анализа и реагенты
Для проведения профилактического инъекционного курса коровам использовали лекарственный ветеринарный препарат Эмидонол® 10% (ООО «НВЦ Агроветза-щита», РФ), приобретенный в аптечной сети. Препарат реализуется через аптечные сети и разрешен к применению в качестве средства безрецептурного отпуска. Дозировки вводили согласно инструкции к препарату в зависимости от массы тела животных в течение 15 дней ежедневно утром. Образцы молока отбирали на 15-й (последний) день курса в пластиковые стерильные бутылки объемом 1 л.
Для исследований использовали образцы мочи добровольцев до и после однократного приема утром 3 стаканов (900 мл) свежего коровьего молока, собранные в течение 48 ч. Добровольцы (п=4, возраст -35-52 года, масса тела 65-93 кг, пол не учитывался) не принимали ранее препаратов мельдония, каких-либо биологически активных добавок к пище, а также молока, молочных и мясных продуктов за 4-5 дней до сдачи бланкового образца и во время исследований. Образцы мочи отбирали в стерильные медицинские контейнеры объемом 100 мл, маркировали их, указывая дату и время сдачи, хранили при температуре +4 °С или замораживали при -20 °С до проведения про-боподготовки.
Работа не противоречит Хельсинкской декларации2, получены письменные разрешения добровольцев на использование их биологического материала для проведения исследований.
В качестве внутреннего стандарта использовали дей-терированный мельдоний (Meldonium-D3, сертифицированный стандарт) (TLC PharmaChem Inc., Канада), из которого готовили раствор с концентрацией 1 мг/мл. Для приготовления положительных контрольных образцов мочи и растворов с концентрацией мельдония 10, 100, 1000 нг/мл использовали референсный стандарт мельдония дигидрата (European Pharmacopoeia, Meldonium Dihydrate CRS batch 1) (EDQM, Франция); из него также готовили сток-раствор с концентрацией 1 мг/мл, который добавляли в отрицательный контрольный образец мочи.
0"
CH
H3C
I
H
3
C"3 N+/C"3
O^O
"O
x2 O -O
>1
O
Рис. 1. Структурная формула препарата Эмидонол® Fig. 1. Structural formula of Emidonol®
Для проведения исследований использовали метанол для хроматографии (чистота не менее 99,8%), ацетони-трил, уксусную кислоту (HPLC grade) (JT Baker™, Нидерланды), воду (HPLC grade) (Thermo Scientific Chemical, США), ацетат аммония (чистота не менее 99,9%) (Sigma-Aldrich, США), аргон сжатый 5.0 с чистотой не менее 99,999%. Для приготовления буферных растворов применяли деионизированную воду, удельное сопротивление 18,2 МОмхсм (Millipore, США).
Вспомогательное оборудование и материалы
Кримпер, декаппер, стеклянные виалы объемом 1,5 мл (Macherey-Nagel GmbH & Co, Duren, Германия), автоматические дозаторы переменного объема 0,5-10, 20-200, 100-1000, 500-5000 мкл (Eppendorf, Германия) и наконечники к ним, настольная центрифуга с бакетным ротором для пробирок объемом 1,5-2 мл Centrifuge 5430 (Eppendorf, Германия), пробирки полипропиленовые 1,5 мл (Eppendorf, Германия), пробирки типа фалькон 15 и 50 мл (Greiner Bio-One, Австрия), аналитические весы OHaus Discovery DV215CD (точность 5 знаков), аппарат для встряхивания жидкости Vortex.
Пробоподготовка
Для исследований отбирали по 100 мкл образцов мочи добровольцев до (бланк) и после приема молока, а также по 100 мкл отрицательного и положительных контрольных образцов мочи в пробирки типа эппен-дорф объемом 1,5 мл. Добавляли 900 мкл дилюента (для приготовления дилюента в мерную колбу объемом 100 мл вносили 22 мкл раствора внутреннего стандарта с концентрацией 0,1 мг/мл (Meldonium-D3) и доводили до метки метанолом). После встряхивали и центрифугировали в течение 10 мин при 14 000 g. Затем отбирали по 900 мкл надосадочной жидкости в стеклянные виалы и закрывали крышками. Пробоподготовку образцов молока коров для оценки концентраций мельдония проводили таким же образом.
2 Всемирная медицинская ассоциация. Хельсинкская декларация. [Интернет-ресурс] URL: https://asmu.ru/upload/iblock/067/ Хельсинкская%20декларация.pdf (дата обращения: 17.07.2024).
Для приготовления подвижной фазы А из бутыли с водой объемом 2,5 л удаляли 15 мл и добавляли 2,5 мл концентрированной уксусной кислоты и 12,5 мл 2М раствора ацетата аммония. Подвижной фазой В являлся ацетонитрил.
Параметры инструментального анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии
Анализ методом ВЭЖХ-МС/МС проводили с использованием жидкостного хроматографа Ultimate 3000, соединенного с тройным квадрупольным масс-спектрометром модели TSQ Vantage (ThermoFisher Scientific, США) с источником ионизации электроспреем с нагреваемым потоком распыляющего газа в режиме регистрации положительных ионов (ESI+). Для анализа использовали колонку для ВЭЖХ Cortecs UPLC HILIC 2.1x100 с размером частиц 1,6 мкм и предколонку для ВЭЖХ Cortecs UPLC HILIC 2.1x5 с размером частиц 1,7 мкм (Waters, США). Скорость потока 0,3 мл/мин. Объем вводимой пробы - 10 мкл. Термостатирование колонки 40 °С. Программа градиентного элюирования представлена в таблице.
Программа градиентного элюирования
Gradient elution program
Регистрация положительных ионов в режиме мониторинга селективных реакций (SRM): время МС-ана-лиза (MS run time) - 9 мин, давление газа (collision gas pressure) - 1,5 мТорр, ширина пика (FWHM, Q1) - 1,0, ширина пика (FWHM, Q3) - 1,0, DCV - 5V, температура капилляра - 300 °С, температура испарителя - 370 °С, время одного полного цикла - 0,3 с, напряжение на капилляре (ESI+) - 4000 В, давление основного распылительного газа (Sheath gas pressure) - 50,0, поток вспомогательного распылительного газа (aux gas flow) - 20,0, давление шторного газа (ion sweep gas pressure) - 0,0.
Результаты и обсуждение
Перед изучением выведения мельдония с мочой вслед за употреблением разовой дозы молока коров, собранного после курсового инъекционного применения пре-
парата Эмидонол® 10%, оценивали концентрации запрещенного модулятора метаболизма в образцах молока. В данном исследовании не принималось во внимание множество факторов, которые могут оказывать влияние на содержание продуктов биотрансформации препарата Эмидонол® в молоке (особенности метаболизма каждой особи, рацион питания, объем потребляемой жидкости и т.д.). Важно отметить, что использованное для исследования молоко не подвергалось пастеризации или воздействию высоких температур. Были получены следующие оценочные концентрации мельдония: образец 1 - 3700 нг/мл, образец 2 - 3200 нг/мл, образец 3 - 1400 нг/мл, образец 4 - 1350 нг/мл. Первые 2 образца молока - утренняя дойка, образцы 3 и 4 - вечерняя дойка.
На рис. 2 приведены графики выведения мельдония с собранной в течение 48 ч после однократного утреннего приема 900 мл молока мочой добровольцев, которые не употребляли в пищу иных молочных продуктов или мяса. По оси абсцисс приводится время выведения, по оси ординат - оценочная концентрация мельдо-ния (в нг/мл). Концентрацию мельдония оценивали по 2 самым долгоживущим и стабильным БЯМ-переходам (147.1 >59.1, 147.1>58.1), предел обнаружения составил около 2,5 нг/мл. Как и в случае с образцами молока, концентрация мельдония в образцах мочи может варьировать в зависимости от индивидуальных особенностей метаболизма, скорости клубочковой фильтрации почек добровольцев, количества употребляемой жидкости и т.д. Из представленных данных видно, что максимальные концентрации мельдония в организме достигаются через 5-10 ч после употребления молока. Так, у добровольца 1 она составила около 400 нг/мл, добровольца 2 - 310 нг/мл, добровольца 3 - 160 нг/мл, добровольца 4 -260 нг/мл. Затем наблюдалось резкое снижение концентрации, и последующие 24 ч она уменьшалась примерно с 20 нг/мл (спустя 12-13 ч после приема) до 2,5-5 нг/мл и ниже (спустя 36-40 ч). У добровольца 2 оценочные концентрации мельдония оставались на уровне ~5 нг/мл чуть более 42 ч.
Мельдоний, будучи метаболическим средством и антигипоксантом, влияет на восстановительные процессы организма, активируя гликолиз, протекающий без дополнительного потребления кислорода, стабилизирует митохондриальный потенциал. Отмечается, что при приеме такой однократной дозы молока добровольцы не почувствовали никакого эффекта, повышения работоспособности или бодрости. Это неудивительно, так как терапевтические дозы мельдония составляют около 500-1000 мг/сут, а количество, полученное при употреблении даже большого объема контаминированного молока, значительно (на порядки) ниже.
Согласно техническому документу ВАДА TD2023IDCR3 для подтверждения идентичности аналита в образце
Время, мин Подвижная фаза А Подвижная фаза В
Time, min Mobile phase A Mobile phase B
0,0 5 95
0,5 5 95
4,0 95 5
5,5 95 5
5,51 5 95
9 5 95
3 Технический документ ВАДА TD2023IDCR. [Интернет-ресурс] URL: https://www.wada-ama.org/sites/default/files/2023-02/ td2023idcrv1.1_eng_final.pdf (дата обращения: 05.08.2024).
Рис. 2. Графики выведения мельдония с мочой в течение 48 ч после разового употребления образцов молока добровольцами (n=4). Подробнее показаны первые 15 ч после приема
Fig. 2. Graphics of urinary meldonium excretion within 48 h after a single consumption of milk samples by volunteers (n=4). The first 15 h after ingestion are shown in more detail
должны выполняться некоторые хроматографические и масс-спектрометрические критерии. Так, время хро-матографического удерживания мельдония (в данном случае 5,00 мин) в образце не должно отличаться более чем на 1%, или ±0,1 мин от такового в рефе-ренсном образце. Для МС/МС-определения необходимо получить как минимум 2 диагностических иона (т.е. 2 S RM-перехода - ион-прекурсор и ион-продукт). Отношение сигнал : шум (S : N) для всех диагностических пиков должно быть более 3:1. Относительная интенсивность пиков каждого диагностического иона не должна отличаться от таковых в референс-ном образце более чем на величину (выражаемую в процентах или в абсолютных значениях), указанную в TD2023IDCR3.
Под воздействием энергии столкновения ион - предшественник мельдония с m/z 147.1 (C6H15N202+) диссоциирует с образованием 4 ионов-продуктов с m/z 42.1 (C2H4N+), m/z 58.1 (C3H8N+), m/z 59.1 (C3H9N+) в результате потери остатка триметиламина и m/z 132.1 (C5H12N2O2+) (рис. 3).
C. Gôrgens и соавт. [7] установили, что при фрагментации в результате потери одной метильной группы также образуется фрагмент с m/z 132.1. Действительно, при анализе чистого препарата или образцов мочи добровольцев после однократной инъекции мельдония (2-5 мл препарата с концентрацией 100 мг/мл) для SRM-перехода 147.1 >132.1 регистрируется пик, интенсивность которого позволяет использовать его для идентификации. Однако при анализе образцов мочи после употребления молока, содержащего продукты биотрансформации препарата Эмидонол®, интенсивность пика данного перехода на 2-3 порядка ниже, чем пиков других переходов; пик регистрируется только
m/z 147.1 Мельдоний
(C6HI5N202) m/z 147.1 Meldonium (C6HI5N2Q2)^
HI
CH,
.r:
XH3 XH,
HO O
CH2 II+/CH3 Nt 3 ^CH
m/z 58.1 Фрагмент 1
(СзН8\)+ m/z 58.1 Fragment 1 (C0N)+
CH
CH
3
1+ 3
CH
HI
m/z 59.1 Фрагмент 2
(СзН9\).+
m/z 59.1 Fragment 2 (С3Н^).+
CH
m/z 132.1
CH3
m/z 42.1 Фрагмент 4
(C2H4N)+ m/z 42.1 Fragment 4
HO
Фрагмент 3 (C2H4N)+
(С5Н12\202).+
m/z 132.1 Fragment 3
(CHuNfi)*
Рис. 3. Фрагментация мельдония Fig. 3. Meldonium fragmentation
в образцах мочи с максимальными концентрациями (от 100-150 нг/мл), отобранных спустя 4-12 ч после употребления больших доз молока, полученного от утренней дойки, и отобранных через 6-9 ч после употребления образцов вечерней дойки. Не исключено, что при употреблении небольших количеств молока пик БЯМ-перехода 147.1 >132.1 будет проблематично регистриро-
N
O
вать или он будет отсутствовать вовсе [10]. Регистрация тех или иных пиков зависит от стадии выведения мельдония.
Если оценивать полученные результаты по критериям ВАДА, то мельдоний, являющийся продуктом биотрансформации препарата Эмидонол®, надежно определяется в образцах мочи добровольцев спустя 4-12 ч после употребления разовой дозы 900 мл молока для следующих 5 SRM-переходов 147.1 >147.1 (15), 147.1 >132.1 (17), 147.1 >59.1 (17), 147.1>58.1 (17), 147.1>42.1 (60) (рис. 4). Спустя более 12 ч пик SRM-перехода 147.1 >132.1 уже не детектируется. Следует отметить, что пики 2 других SRM-переходов 147.1 >147.1 и 147.1>42.1 регистрировались до 14-15 ч (данные не показаны), однако далее их использование для идентификации становится проблематичным из-за высокой интерференции и наличия посторонних пиков. Как уже отмечалось ранее, самыми стабильными и долгожи-вущими переходами являются 147.1>59.1 и 147.1>58.1. Их пики надежно идентифицируются в образцах мочи спустя 36-40 ч после приема больших доз молока (рис. 5), а у одного добровольца даже спустя 42 ч. Для определения мельдония в следовых количествах предпочтительнее использовать метод ВЭЖХ-МС/МСВР.
S. Cristoni и соавт. указывают [10], что согласно директиве Европейского союза 2002/657/EC4 для веществ, относящихся к Группе А (обладающих анаболическим эффектом и запрещенных веществ), таких как мель-доний, вещество должно быть идентифицировано как минимум с использованием 4 точек (SRM-переходов), как приводится в работе C. Görgens и соавт. [7], что противоречит методологии, применяемой в антидопинговом анализе, где используются 3 точки (ионы с m/z 58,0654, m/z 59,0732 и m/z 147,1133). В нашей работе для обнаружения мельдония использовалось 5 SRM-переходов, хотя использование даже 3 не противоречит TD2023IDCR3.
Согласно данным, приведенным A. Temerdashev и соавт. [5], даже термическая обработка молока не гарантирует полного избавления от мельдония. Исходя из результатов исследования авторы отмечают, что и свежее, и пастеризованное молоко содержит мельдо-ний, а его содержание в одном и том же образце молока до и после пастеризации может различаться примерно в 2 раза. Также отмечено, что запрещенный модулятор метаболизма может определяться в образцах молока коров спустя около 7 дней после окончания курса препаратом Эмидонол®.
S. Guddat и соавт. изучали профиль выведения мельдония после употребления добровольцами в течение одного и 5 последовательных дней пастеризованного молока с добавленным мельдонием (50 мкг в 100 мл) [6].
Авторы установили, что эффекты накопления при употреблении низких доз мельдония в течение 5 дней подряд были незначительными (примерно в 2,5 раза по сравнению с однократным приемом) и спустя 24 ч образцы мочи показывали отрицательный результат (сопоставимый с бланковой мочой). Однако, согласно нашим данным, неоднократный прием больших количеств молока, контаминированного мельдонием, может дать существенный эффект.
Результаты проведенных нами исследований показывают, что при употреблении больших количеств конта-минированного молока оценочные концентрации мель-дония в моче превышают минимальный требуемый уровень определения (MRPL) в 100 нг/мл5. Анализируя представленные выше данные, можно с уверенностью сказать, что употребление в больших количествах свежего непастеризованного молока коров, отобранного по окончании 15-дневного курса ветеринарным препаратом Эмидонол® 10%, гарантированно приведет к неблагоприятному результату анализа в соответствии с критериями ВАДА в течение 12 ч [при сканировании в режиме SRM с использованием 5 переходов -147.1>147.1 (15), 147.1 >132.1 (17), 147.1>59.1 (17), 147.1>58.1 (17), 147.1>42.1 (60)] и в течение около 36-40 ч [при сканировании в режиме SRM с использованием 2 переходов -147.1>59.1 (17), 147.1>58.1 (17)].
Заключение
В ходе впервые проведенных исследований по изучению образцов мочи добровольцев после однократного употребления большого количества молока коров, прошедших курс ветеринарным препаратом Эмидонол® 10%, было установлено, что максимальные концентрации мельдония в моче могут достигать 160-400 нг/мл спустя 5-10 ч после однократного приема 900 мл, что значительно превышает уровень MRPL, равный 100 нг/мл. Показано, что неблагоприятный результат анализа в соответствии с критериями ВАДА при определении мельдония методом ВЭЖХ-МС/МС может регистрироваться в зависимости от применяемых условий сканирования в режиме SRM даже спустя 40-42 ч после употребления молока. Полученные данные свидетельствуют о том, что, по-видимому, следует установить некоторый период ожидания для продуктивных сельскохозяйственных животных на период проведения терапевтического или профилактического курса вышеуказанным ветпрепаратом, а профессиональным спортсменам следует воздерживаться от употребления большого количества свежего коровьего молока во избежание сдачи положительного результата допинг-теста на мельдоний.
4 Директива Европейского союза 2002/657/EC. [Интернет-ресурс] URL: https://fishquality.ru/assets/files/Documents%20on%20 activities/Legislation/EU/Решение%202002-657.pdf (дата обращения: 30.08.2024).
5 Технический документ ВАДА TD2022MRPL. [Интернет-ресурс] URL: https://www.wada-ama.org/sites/default/files/2022-01/ td2022mrpl_v1.1_eng_0.pdf (дата обращения: 05.08.2024.
ш
о
-а о о сг
со со
о ю
Б/В
NL: 2.60ЕЗ TIC F: + с ESI SRM ms2 147.100 [42.099-42.101 ] MS [CIS
PCU_250ng_3008
NL: 2.73E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.110 [59.099-59.1011 MS (CIS
PCU_250ng_3008
NL: 5.41E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.120 [58.099-58.101] MS IG IS
PCU_250ng_3008
NL: 3.81E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.125 [131.999-132.001] MS ICIS
PCU_250ng_3008
NL: 6.93E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.130 [147.129-147.131] MS ICIS
PCU_250ng_3008
NL: 4.66E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 150.100 [61.099-61.101] MS ICIS
PCU_250ng_3008
NL: 2.92E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 150.110 [62.099-62.101] MS ICIS
PCU_250ng_3008
30 4.90 4.95 5.00 5.05 5.10
NL: 4.37E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.100 [42.099-42.101]MS Blank 4 3008
NL: 3.92E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.110 [59.099-59.101] MS Blank 4 3008
NL: 2.56E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.120 [58.099-58.101] MS Blank 4 3008
NL: 2.53E2 TIC F: + с ESI SRM ylms2 147.125
[131.999-132.001] MS Blank 4 3008
NL: 3.63E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.130 [147.129-147.131] MS Blank 4 3008
NL: 5.82E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 150.100 [61.099-61.101] MS
NL: 3.56E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 150.110 [62.099-62.101] MS ICIS
Blank 4 3008
4.30 4.90 4.95
5.00
5.05 5.10
Рис. 4. Пики SRM-переходов внутреннего стандарта мельдония 150.1 >61.1 и 150.1>62.1 (2 нижние строки) и мельдония в положительном контрольном образце мочи с содержанием 250 нг/мл (А), в бланковой моче до приема молока (Б) и в образце мочи, отобранном спустя 8 ч после приема молока (В)
Яд. 4. Peaks of SRM transitions of the internal standard Meldonium-D3 150.1>61.1 and 150.1>62.1 (bottom 2 rows) and meldonium in a positive control urine sample containing 250 ng/ml (A), in blank urine before drinking milk (B) and in a urine sample collected 8 hours after drinking milk (C)
о о
го
з
о
-С
О)
ь о га
О)
RT: 4.99 АА:
RT: 5.01 АА: 139430
RT: 5.00 АА: 331437
RT: 5.00 АА: 149531
В/С
RT: 5.00
о
N>
Ш
о
"О
о о
CD Gû
Ю О Ю
50-0
100п 50-0
ЮОп 50-0
NL: 6.68Е2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.100 [42.099-42.101] MS PCU_10_ng_3008
NL: 2.10E3 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.110 [59.099-59.101] MS ICIS
PCU_10_ng_3008
NL: 3.39E3 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.120 [58.099-58.101] MS ICIS
PCU_10_ng_3008
NL: 2.56E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.125 [131.999-132.001] MS
PCU_10_ng_3008
NL: 3.67E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.130 [147.129-147.131] MS
PCU_10_ng_3008
NL: 4.62E4
TIC F: + с ESI SRM
ms2 150.100
[61.099-61.101] MS
ICIS
PCU_10_ng_3008
NL: 2.80E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 150.110 [62.099-62.101] MS ICIS
PCU_10_ng_3008
NL: 4.37E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.100 [42.099-42.101] MS Blank_4_3008
NL: 3.92E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.110 [59.099-59.101] MS Blank 4 3008
NL: 2.56E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.120 [58.099-58.101] MS Blank 4 3008
NL: 2.53E2 511 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.125 [131.999-132.001] MS Blank 4 3008
NL: 3.63E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.130 [147.129-147.131] MS Blank_4_3008
NL: 5.82E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 150.100 [61.099-61.101] MS ICIS Blank_4_3008
NL: 3.56E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 150.110 [62.099-62.101] MS ICIS
Blank_4_3008
NL1.62E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.100 [42.099-42.101] MS 4_10_3008
NL: 3.49E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.110 [59.099-59.101] MS ICIS 4 10 3008
NL: 6.25E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.120 [58.099-58.101] MS ICIS 4 10 3008
NL: 5.64E2 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.125 [131.999-132.001] MS 4 10 3008
NL: 2.56E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 147.130 [147.129-147.131] MS 4_10_3008
NL: 5.57E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 150.100 [61.099-61.101] MS ICIS 4_10_3008
NL: 3.22E4 TIC F: + с ESI SRM ms2 150.110 [62.099-62.101] MS ICIS 4_10_3008
4.90
4.304.90
4.30 4.90 4.95 5.00 5.05 5.10
Рис. 5. Пики SRM-переходов внутреннего стандарта мельдония 150.1 >61.1 и 150.1>62.1 (2 нижние строки) и мельдония в положительном контрольном образце мочи с содержанием 10 нг/мл (А), в бланковой моче до приема молока (Б) и в образце мочи, отобранном спустя 40 ч после приема молока (В)
Fig. 5. Peaks of SRM transitions of the internal standard Meldonium-D3 150.1 >61.1 and 150.1 >62.1 (bottom 2 rows) and meldonium in a positive control urine sample containing 10 ng/ml (A), in blank urine before drinking milk (Bj and in a urine sample collected 40 hours after drinking milk (Bj
> s
S
RT: 4.99 M: 10719
RT: 4.99 M: 88938
RT: 4.99 ДД-119420
Сведения об авторах
Постников Павел Викторович (Pavel V. Postnikov) - кандидат химических наук, начальник отдела допингового контроля НАДЛ МГУ (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3424-0582
Полосин Андрей Вячеславович (Andrey V. Polosin) - главный специалист отдела допингового контроля НАДЛ МГУ (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0009-7362
Мочалова Елена Сергеевна (Elena S. Mochalova) - и.о. директора НАДЛ МГУ (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected]
Орджоникидзе Зураб Гивиевич (Zurab G. Ordzhonikidze) - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный врач РФ, главный внештатный специалист по спортивной медицине, первый заместитель директора ГАУЗ МНПЦ МРВСМ им. С.И. Спасокукоцкого ДЗМ (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4623-0883
Никитюк Дмитрий Борисович (Dmitry B. Nikityuk) - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», профессор кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), профессор кафедры экологии и безопасности пищи ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4968-4517
Тутельян Виктор Александрович (Victor A. Tutelyan) - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», заведующий кафедрой гигиены питания и токсикологии ИПО ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), профессор кафедры экологии и безопасности пищи ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4164-8992
Литература
Васильев А.А., Галатдинова И.А., Жигалова Ю.А. Ихтиотоксикологи-ческие свойства эмидонола 20% // Вестник АПК Ставрополья. 2015. № 1. С. 13-15.
Государственный реестр лекарственных средств для ветеринарного применения (перечень лекарственных препаратов прошедших государственную регистрацию) [Электронный ресурс]. URL: https:// fsvps.gov.ru/files/gosudarstvennyj-reestr-lekarstvennyh-sredstv-dlja-veterinarnogo-primenenija-perechen-lekarstvennyh-preparatov-proshedshih-gosudarstvennuju-registraciju/ (дата обращения: 17.07.2024). J^drejko K., Catlin O., Stewart T., Muszynska B. Mexidol, Cytoflavin, and succinic acid derivatives as antihypoxic, anti-ischemic metabolic modulators, and ergogenic aids in athletes and consideration of their potential as performance enhancing drugs // Drug Test. Anal. 2024. Feb 25. DOI: https:// doi.org/10.1002/dta.3655
The 2024 List of prohibited substances [Электронный ресурс]. URL: http://rusada.ru/upload/iblock/836/drtkaf3eckdo1jrnjxacdwqkbm054m1n/ Запрещенный%20список%202024%20(1)^(дата обращения: 17.07.2024). Temerdashev A., Azaryan A., Dmitrieva E. Meldonium determination in milk and meat through UHPLC-HRMS // Heliyon. 2020. Vol. 6, N 8. Article ID e04771. DOI: https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e04771
10.
Guddat S., Gorgens C., Sobolevsky T., Thevis M. Meldonium residues in milk: a possible scenario for inadvertent doping in sports? // Drug Test. Anal. 2021. Vol. 13, N 11-12. P. 1906-1910. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.3145 Gorgens C., Guddat S., Dib J., Geyer H., Schanzer W., Thevis M. Mildro-nate (Meldonium) in professional sports — monitoring doping control urine samples using hydrophilic interaction liquid chromatography — high resolution/high accuracy mass spectrometry // Drug Test. Anal. 2015. Vol. 7, N 11—12. P. 973—979. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.1788 Stuart M., Schneider C., Steinbach K. Meldonium use by athletes at the Baku 2015 European Games // Br. J. Sports Med. 2016. Vol. 50, N 11. P. 694—698. DOI: https://doi.org/10.1136/bjsports-2015-095906
Puscas A., But M.-G., Vari C.-E., Osz B.-E., Stefanescu R., Filip C. et al. Meldonium supplementation in professional athletes: career destroyer or lifesaver? // Cureus. 2024. Vol. 16, N 7. Article ID e63634. DOI: https://doi. org/10.7759/cureus.63634
Cristoni S., Vitarelli F., Spiti S., Brambilla M., Larini M., Calabrone L. et al. Unraveling the complexity of anti-doping analysis: reassessing meldonium detection and doping verdicts in a case study // Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2023. Vol. 27, N 6. Suppl. P. 114—118. DOI: https://doi.org/10.26355/ eurrev 202312 34695
6
2.
7
8
9
4
References
Vasil'ev A.A., Galatdinova I.A., Zhigalova Yu.A. Ichthyotoxicological properties of Emidonol 20%. Vestnik APK Stavropol'ya [Bulletin of the Agro-Industrial Complex of Stavropol]. 2015; (1): 13—5. (in Russian) State Register of Medicines for Veterinary Use (List of medicines that have passed state registration) [Electronic resource]. URL: https://fsvps.gov. ru/files/gosudarstvennyj-reestr-lekarstvennyh-sredstv-dlja-veterinarnogo-primenenija-perechen-lekarstvennyh-preparatov-proshedshih-gosudarst-vennuju-registraciju/ (date of access July 17, 2024) (in Russian) J^drejko K., Catlin O., Stewart T., Muszynska B. Mexidol, Cytoflavin, and succinic acid derivatives as antihypoxic, anti-ischemic metabolic modulators, and ergogenic aids in athletes and consideration of their potential as performance enhancing drugs. Drug Test Anal. 2024; Feb 25. DOI: https:// doi.org/10.1002/dta.3655
The 2024 List of prohibited substances [Electronic resource]. URL: http:// rusada.ru/upload/iblock/836/drtkaf3eckdo1jrnjxacdwqkbm054m1n/ 3anpe^eHHbifi%20cnHCOK%202024%20(1).pdf (date of access July 17, 2024). Temerdashev A., Azaryan A., Dmitrieva E. Meldonium determination in milk and meat through UHPLC-HRMS. Heliyon. 2020; 6 (8): e04771. DOI: https://doi.org/10.1016Xi.heliyon.2020.e04771
10.
Guddat S., Görgens C., Sobolevsky T., Thevis M. Meldonium residues in milk: a possible scenario for inadvertent doping in sports? Drug Test Anal. 2021; 13 (11-12): 1906-10. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.3145 Görgens C., Guddat S., Dib J., Geyer H., Schänzer W., Thevis M. Mildro-nate (Meldonium) in professional sports - monitoring doping control urine samples using hydrophilic interaction liquid chromatography — high resolution/high accuracy mass spectrometry. Drug Test Anal. 2015; 7 (11—12): 973—9. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.1788
Stuart M., Schneider C., Steinbach K. Meldonium use by athletes at the Baku 2015 European Games. Br J Sports Med. 2016; 50 (11): 694—8. DOI: https:// doi.org/10.1136/bjsports-2015-095906
Puscas A., But M.-G., Vari C.-E., Osz B.-E., Stefänescu R., Filip C., et al. Meldonium supplementation in professional athletes: career destroyer or lifesaver? Cureus. 2024; 16 (7): e63634. DOI: https://doi.org/10.7759/cureus.63634 Cristoni S., Vitarelli F., Spiti S., Brambilla M., Larini M., Calabrone L., et al. Unraveling the complexity of anti-doping analysis: reassessing meldonium detection and doping verdicts in a case study. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2023; 27 (6 suppl): 114—8. DOI: https://doi.org/10.26355/ eurrev_202312_34695
6
2
7
8.
9.
