CC BY
37
■ И. С. КОЗУЛИНА И АР. БОКАВИРУС В ЭТИОЛОГИИ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ V ЛЕТЕЙ РАННЕЮ И ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА
Таблица 2. Клинические симптомы изолированной HBoV-инфекции
Симптомы Возраст (лет)
0-3 3-7 0-7
"(%) «(%) "(%)
Лихорадка 14(100) 8 (88,89) 22 (95,65)
Ринит 11 (78,57) 6 (66,67) 17(73,91)
Фарингит 14(100) 9(100) 23 (100)
Конъюнктивит катаральный 1 (7,14) - 1(4,35)
Кашель 14(100) 9(100) 23 (100)
Осиплость голоса 14(100) 9(100) 23 (100)
Хрипы в легких при аускультации 6 (42,86) 2 (22,22) 8 (34,78)
Дыхательная недостаточность 1 —2 ст. 14(100) 8 (88,89) 22 (95,65)
Диспепсия 5 (35,71) - 4(17,39)
легких при аускультации, дыхательной недостаточности и диспепсических явлений, а также присоединение в 2 случаях острого среднего отита. Кроме того, у двоих детей 2-х и 3-х лет НВоУ-инфекция протекала с одновременным поражением верхних и нижних дыхательных путей (клинический диагноз — острый обструктивный ларинготрахеит и бронхит).
Заключение
Проведенное исследование показало, что НВоУ играет важную роль в этиологии ОРЗ у детей, особенно в раннем детском возрасте. Данный парвовирус идентифицирован у одной пятой части детей (20,12%), госпитализированных с диагнозом ОРВИ в эпидемический сезон года. Наиболее восприимчивы к изучаемому парвовирусу дети в возрасте от 1 до 3 лет. Мальчики чаще болеют данной инфекцией, чем девочки.
Клинически НВоУ-инфекция в большинстве случаев приводит к развитию обструктивного синдрома и нередко характеризуется явлениями диспепсии. Причем треть об-структивных ларинготрахеитов в раннем детском возрасте (32,73%) имеет в основе бокавирусную этиологию. Наиболее тяжелое течение отмечается у детей до 3 лет.
Литература:
1. Cloning of а human bocavirus by molecular screening of respiratory tract samples / T. Allander et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2005.-V. 102.-P. 12891 - 12896.
2. Detection of human bocavirus in hospitalized children / J. Dina et al. //J. of Paediatrics and Child Health. - 2009. - V. 45 (3). -P. 149-153.
3. Human bocavirus and acute wheezing in children / T. Allander et al. // Clin. Infect. Dis. - 2007. - V. 44. - P. 904-910.
4. Эпидемиологические аспекты бокавирусной инфекции у детей / Т. Ю. Кондратьева и др. // Инфекционные болезни. — 2008. — Т. 6 (2).- С. 10-16.
5. http://emedicine.medscape.com/article/! 355393-overview
6. Human bocavirus: prevalence and clinical spectrum at a children's hospital / J. C. Arnold et al. // Clin. Infect. Dis. - 2006. -V. 43. -P. 283-288.
7. Prospectiv study of human bocavirus (HBoV) infection in a Pediatric University Hospital in Germany 2005/2006 / S. Voelz et al. // J. Clin. Virol. - 2007. - V. 40 (3). - P. 229-235.
8. Human Bocavirus Infections in Hospitalized Children and Adults / J. Longtin et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2008,- V. 14 (2).-P. 217-221.
9. Львов Д. К. Медицинская вирусология. — М.: МИА, 2008. — 276-284 с.
10. Epidemiological profile and clinical associations of human bocavirus and other human parvoviruses / A. Manning et al. // J. Infect. Dis. - 2006. - V. 194 (9).-P. 1283-1290.
1 1. Human bocavirus, a respiratory and enteric virus / D. Vicente et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2007. - V. 13 (10). - P. 1620-1621.
12. Seroepidemiology of human bocavirus in Hokkaido prefecture, Japan / R. Endo et al. //J. Clin. Microbiol. - 2007. - V. 45 (10). -P. 3218-3223.
13. Human bocavirus DNA detected by quantitative real-time PCA in two children hospitalized for lower respiratory tract infection / T. Schenk et al. // J. Eur. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2007. -V.26.-P. 147-149.
Выявление маркеров вируса простого герпеса
и 11итомегаловируса в материалах аутопсии плодов и умерших новорожденных
А. А. Алиева1, Л. Л. Нисевич2, 3. С. Гаджиева1, А. С. Пибизов1, R R Климова1, А. Г. Талалаев3, Л. Н. Каск3, А. А. Куш1
нии вирусологии им. Д. И. Ивановского рамн1, Научный центр здоровья детей рамн2, ГОУ ВПО российский государственный медицинский университет росздрава3
Представлены результаты патологоанатомического и вирусологического исследования 252 органов от 88 умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни, а также 104 органов от 34 мертворожденных. Комплексное использование четырех методов лабораторной диагностики (ПЦР, ПЦР in situ, РИФ и БКМ — быстрый культуральный метод) показало высокую частоту обнаружения прямых маркеров ВПГ и ЦМВ в материалах аутопсии: в органах мертворожденных детей прямые маркеры (ДНК или антигены) ВПГ обнаружены в 41,9%, ЦМВ — в 35,4% случаев; в органах умерших новорожденных и детей прямые маркеры ВПГ обнаружены в 20% случаев, ЦМВ — в 61,5%. Отмечено частое одновременное выявление ВПГ и ЦМВ (45,4%).
Выявление инфекционно активного ВПГ у мертворожденных и наличие различных эмбриофетопатий дает основание полагать, что инфицирование ВПГ может происходить не только в перинатальном периоде, но и на стадии эмбрио- и фетогенеза. Впервые использован метод ПЦР in situ на отпечатках органов, позволяющий визуализировать в световом микроскопе не только инфицированную клетку, но и оценить количество вирусной ДНК внутри клетки.
Ключевые слова: врожденная инфекция, цитомегаловирус, вирус простого герпеса, лабораторная диагностика, плоды, умершие новорожденные, дети
УДК 616.022:578.825.11 -07
Detection of markers of hepres simplex virus and cytomegalovirus
in fetus autopsy and deceased newborn children materials
A. A. Adieva1, L. L. Nisevich2, Z. S. Gadzhiyeva1, A. S. Tsibizov1, R. R. Klimova1, A. G. Talalayev3, L. N. Kask3, A. A. Kush1
Scientific and research institute of virology named after D.I.Ivanovski of RAMS1, Scientific Center for Children's Health of RAMS2, State Educational Institution of Higher Professional Education Russian State Medical University of Roszdrav3
The results of postmortem and virological examination of 252 organs taken from 88 deceased newborn children, and children who died during their first year of life as well as 104 organs from 34 stillborn children are presented. The complex application of four methods of laboratory diagnostics (PCR, PCR — in situ, RIF and FCM - fast cultural method) demonstrated high frequency of detection of direct HSV and CMV markers in the autopsy materials: in the organs of stillborn children direct markers (DNA or antigens) of HSV were detected in 41,9% cases, of CMV — 35,4% cases; in the organs of the deceased newborn children and infants direct markers were detected in 20% cases, of CMV — 61,5% cases. Frequent simultaneous detection of HSV and CMV was noted (45,4%). The detection of infectious active HSV in stillborn children and presence of different embriofethopathies affords grounds to think that HSV infection can take place not only during perinatal period, but at the embrio- and fetogenesis as well. For the first time the PCR — in situ method was applied to the prints of the organs. The method allows to visualize in a light microscope not only an infected cell, but to estimate the amount of viral DNA inside the cell.
Key words: congenital infection, cytomegalovirus, herpes simplex virus, laboratory diagnostics, fetuses, deceased newborn children, infants
Значение врожденных вирусных инфекций как одной из причин самопроизвольного прерывания беременности, преждевременных родов, врожденной патологии, перинатальной и младенческой смерти в настоящее время не вызывает сомнения. В 50% случаев инфекционная патология часто скрывается за такими диагнозами, как внутриутробная гипоксия, интранатальная асфиксия, родовая травма, пороки развития [1]. К сожалению, и в настоящее время мы не имеем достоверных данных о распространенности внутриутробных инфекций (ВУИ), также как и о вероятности заражения и заболевания плода от инфицированной матери. Оценка причин смерти плода и новорожденного может существенно искажаться или быть неполной, так как тотального скрининга на внутриутробные инфекции нет ни в одной стране мира [2].
Герпесвирусные инфекции давно привлекают исследователей в связи с широким распространением в человеческой популяции и тяжелыми последствиями для новорожденных. Считается, что цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) выявляется у 0,5—3% всех живых новорожденных при хронической форме ЦМВ инфекции у матери. Вирусом простого герпеса (ВПГ) во время родов инфицируется от 2 до 5% детей при наличии рецидивирующего генитального герпеса у матери [3, 4].
Риск инфицирования плода при первичной инфекции ЦМВ составляет 40—60%, а при первичном генитальном герпесе — 50—75% [3, 4]. Важно подчеркнуть, что абсолютное большинство плодов (70%) инфицируется ВПГ от матерей без проявления генитального герпеса в анамнезе. В большинстве случаев и ЦМВИ во время беременности протекает бессимптомно. Следует отметить, что не только герпесвирусные инфекции, но и большая часть инфекционных заболеваний беременных, приводящих к внутриутробному инфицированию, протекает в субкли-
Адиева Айна Ахмедовна — к. б. н., ст. научный сотрудник НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН; 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16, т. (499) 190-30-49
нической форме, что значительно затрудняет диагностику внутриутробной инфекции в антенатальном периоде.
По данным Trincado и соавторов [5] среди новорожденных с клиническими проявлениями герпесвирусной инфекции умирает 12%, а оставшиеся дети имеют патологию разной степени тяжести, а по данным Нисевич Л. Л. с соавторами [6] подавляющее большинство новорожденных, инфицированных ВПГ незсщолго до родов или непосредственно во время родов, умирает в течение первых 10 суток жизни.
Известно, что диагностика внутриутробных вирусных инфекций у новорожденных детей весьма затруднительна. Это связано с трудностями лабораторной диагностики, сходством и многообразием клинических проявлений, иногда с отсутствием четко выраженных клинических признаков внутриутробного инфицирования. Но даже после проведения патологоанатомического исследования плодов и умерших новорожденных без вирусологических исследований далеко не всегда удается поставить диагноз врожденной вирусной инфекции [7, 8].
Установлено, что в период новорожденности диагностируется только 15—20% врожденной патологии Большая часть врожденной патологии выявляется только на первом году жизни или в более позднем возрасте [9— 11]. Признаки умственной отсталости иногда становятся очевидными только в дошкольном или школьном возрасте. Использование современных молекулярно-биологиче-ских, электронно-микроскопических и культуральных методов лабораторного исследования пока не нашло широкого распространения в практическом здравоохранении для установления посмертного диагноза.
Целью настоящей работы явилось комплексное вирусологическое и молекулярно-биологическое исследование для выявления герпесвирусных инфекций в случаях мертворождения, неонатальной и младенческой смерти.
Материалы и методы исследования
Проведено пагалогоанатомическое и вирусологическое исследование отпечатков 252 органов от 88 новорож-
денных и детей, умерших на первом году жизни, а также отпечатков 104 органов от 34 мертворожденных. Паталогоанато-мические исследования проводились на базе Морозовской детской городской клинической больницы (г. Москва).
Отпечатки органов исследовали в реакции прямой и непрямой иммунофлюоресценции (РИФ) с использованием поликлональных сывороточных антител (ПКА) и моно-клональных антител, специфичных к широкому набору антигенов: энтеровирусы Коксаки А 23 серотипов, Кок-саки В 6 серотипов, энтеровирусы 68—71 серотипов (по старой классификации); краснуха, вирусы гриппа, вирусы парагриппа 1 —3 серотипов, аденовирусы 10 наиболее распространенных серотипов, респираторно-синци-тиальный вирус, а также антигены Mycoplasma pneumoniae и Chlamydia pneumoniae.
Выявление прямых маркеров ВПГ и ЦМВ в клетках проводили в РИФ с помощью ПКА и МКА, а также методом ПЦР in situ. Лизаты органов изучали, используя классический вариант ПЦР.
Для выявления инфекционной активности ВПГ и ЦМВ использовали количественный вариант быстрого культу-рального метода (БКМ), который выполняли в соответствии с Методическими рекомендациями [12]. Материалы аутопсии вносили в клеточные культуры, сокультивировали, затем фиксировали и выявляли зараженные клетки культуры как описано ранее [13]. Для выявления ВПГ использовали клетки Vero и МКА к белкам ВПГ1+ВПГ2 [14]. Для обнаружения белков ЦМВ использовали культуру диплоидных фибробластов человека и МКА к ЦМВ [15]. Кроме того, использовали МКА к белкам ВПГ и ПКА к белкам ЦМВ, полученные из НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК производили с помощью четырех сертифицированных коммерческих наборов двух фирм: «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В», «ДНК-сорб-С» и «Реамикс». ПЦР в качественном варианте проводили с помощью коммерческих наборов ООО НПФ "ГЕНтех»: «Гер-пАм», «ЦМВАм», а также наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнад-зора: «АмплиСенс ЦМВ», «АмлиСенс HSV 1, 2 типов» согласно инструкции фирмы-производителя.
Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология») при определенной температурной программе, согласно рекомендации производителя тест-систем.
Полимеразная цепная реакция в клетках на цитологическом препарате (ПЦР in situ). Отпечатки органов готовились на стеклах Histobond с адгезивным покрытием. Препараты фиксировали в 10% растворе формалина в течение 4 часов; после промывания в 0,05М ТРИС-НС1 буфере 3 раза по 5 минут на стекла наносили 200 мкл 0,01% раствора ТритонХ-1 00 на 90 секунд и стекла промывали в 0,05М ТРИС-НС1 буфере в течение 2 минут. Препараты обрабатывали протеиназой К в разведении 1 : 50 в течение 30 минут в термостате при 37°С, затем препараты промывали в ТРИС-НС1 буфере 0,05М. После промывки стекла высушивали на воздухе. На высушенные стекла наносилось по 20 мкл амлификационной смеси, состоящей из смеси праймеров, ПЦР-буфера, дНТФ, ДНК-полимеразы и деио-низованной воды. Препараты накрывали покровными стеклами для предотвращения испарения амлификационной смеси. В работе были использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ и к консервативному сверхраннему реги-
ону ЦМВ. Амплификация проводилась в амплификаторе Biometra Thermocycler при оптимизированной температурной программе.
Детекцию продукта амплификации проводили с использованием комплекса биотин-стрептавидин-пероксидаза хрена и красителем ДАВ (Sigma, США). Затем препараты докрашивали гематоксилином Карацци в течение 5 минут, высушивали и заключали в бальзам. Визуализацию проводили с помощью светового микроскопа. В препаратах от пациентов, инфицированных ВПГ или ЦМВ, наблюдали черные зерна метки вирусной ДНК в клетках. Далее подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток в препарате.
Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных компьютерных программ STATISTI-СА 6,0. Частоту встречаемости маркеров ВПГ и ЦМВ анализировали с помощью двухстороннего точного критерия Фишера. Различия показателей считали статистически значимыми при р< 0,05.
Результаты и их обсуждение
Выявление маркеров ВПГ и ЦМВ в материалах аутопсии детей, умерших на первом году жизни. В РИФ исследовано 252 отпечатка органов от 88 детей, умерших в течение первого года жизни. Наличие ВПГ 1 и 2 типов в отпечатках умерших новорожденных изучали с помощью двух МКА. Частота выявления антигенов ВПГ была практически одинаковой при использовании МКА, полученных из НИИ вирусологии (г. Москва) и НИИ гриппа (г. Санкт-Петербург) — 16,9 и 18,6% соответственно. Совпадение результатов было отмечено в 70,3% случаев. Методом ПЦР ДНК ВПГ выявлена в 20% случаев при исследовании лизатов органов от тех же детей.
Для выявления ЦМВ было проведено параллельное исследование одних и тех же образцов в РИФ с использованием МКА и ПКА. При использовании поликлональ-ной сыворотки положительные результаты были получены в 94 из 252 исследованных органов (37,3% ± 3,4). При использовании моноклональных антител положительные результаты отмечались достоверно реже: в 48 образцах (19%; р< 0,001). Совпадение по положительным и отрицательным результатам было отмечено при исследовании 156 органов (61,9%).
Более частое выявление положительных результатов при использовании поликлональных сывороток может свидетельствовать о наличии неспецифических реакций и в ряде случаев — о гипердиагностике цитомегаловирус-ной инфекции. Однако, в 3 случаях из 30, отрицательных по результатам с использованием МКА, но положительных при использовании ПКА, при патологоанатомиче-ском исследовании были выявлены ЦМВ метаморфоз, кальцинаты в ткани мозга и сиалоаденит, являющиеся признаками ЦМВИ. В связи с этим необходимо было выяснить, имеются ли при использовании МКА ложноотри-цательные результаты, или же применение поликлональных антител приводит к гипердиагностике ЦМВ.
Серия экспериментов с привлечением дополнительно двух методов (быстрый культуральный метод и ПЦР) была посвящена изучению причин расхождений результатов РИФ, полученных при выявлении ЦМВ с помощью ПКА и
МКА. Двумя методами с помощью двух иммунореагентов дополнительно было исследовано 26 образцов, полученных от детей с подозрением на внутриутробную инфекцию.
Из 26 исследованных образцов положительные результаты при использовании ПКАбыли получены в 23 образцах (88,5%), при использовании МКА — в 8 образцах (30,8%). Методом ПЦР ДНК ЦМВ была выявлена в 16 из 26 исследованных органов (61,5%). Все положительные пробы, выявленные МКА, совпали с результатами ПЦР, тогда как в 10 образцах, положительных по результатам с ПКА, вирусная ДНК методом ПЦР не была обнаружена. Аналогичные данные были получены при исследовании образцов на культуре ткани (БКМ), что по нашему мнению, свидетельствует о наличии гипердиагностики ЦМВ при использовании поликлональных сывороточных антител.
Заслуживает внимания следующий факт: при отрицательных результатах БКМ, полученных как с помощью МКА, так и ПКА, в 27% случаев были получены положительные результаты ПЦР. Это может быть результатом: 1 — большей чувствительности ПЦР относительно БКМ; 2 — отсутствия в клетках экспрессии вирусного генома и, следовательно, — вирусных белков; 3 — потери инфекционной активности вируса при перевозке и хранении материала до исследования. В настоящее время не представляется возможным определить, какой из перечисленных причин следует отдать предпочтение. Не исключено, что все они могут влиять на результаты определения вирусных маркеров. Для ответа на данный вопрос необходимы дальнейшие детальные исследования на молекулярном и клеточном уровнях.
Выявление маркеров ВПГ и ЦМВ в материалах аутопсии плодов и мертворожденных детей. Выявление ЦМВ и ВПГ в материалах детей, умерших на первом году жизни, может свидетельствовать о врожденной инфекции или ее обострении (учитывая положительные результаты быстрого культурального метода, который позволяет выявить ин-фекционно-активный вирус). Но при этом нельзя исключить и факт постнатального инфицирования.
Для оценки вероятности внутриутробного инфицирования ВПГ и ЦМВ мы использовали четыре метода для выявления прямых маркеров этих возбудителей в материалах аутопсии мертворожденных: классический ПЦР, ПЦР in situ, РИФ и БКМ. В РИФ и БКМ использовали МКА.
Следует отметить, что ВПГ и ЦМВ возможно было выявить практически во всех исследованных органах: легкие, сердце, печень, почки, мозг. При этом в материалах аутопсии выявлялись как ДНК вируса, так и инфекционно активные ВПГ и ЦМВ.
Инфицированным считали плод при положительном результате хотя бы одним из методов в любом из иссле-
дованных органов. Как показал анализ, прямые маркеры ВПГ у плодов обнаружены суммарно в 41,9% случаев. Анализ анамнестических данных матерей мертворожденных показал, что у трети женщин были неоднократные рецидивы герпетической инфекции до беременности, а за время беременности они перенесли острые респираторные заболевания, которые могли спровоцировать обострение герпетической инфекции и инфицировать плод.
Как известно, риск вертикальной передачи при рецидивах герпеса крайне низок: вирусемия отсутствует или незначительна (из-за присутствия противовирусных антител в крови). Однако, учитывая большое количество носителей герпесвирусных инфекций в популяции, которое по данным ряда авторов иногда достигает 80—90% [16], можно полагать, что в действительности внутриутробное инфицирование и при хронических или рецидивирующих формах инфекции происходит значительно чаще, чем это предполагалось до настоящего времени. Определенную роль играет функциональное снижение иммунитета во время беременности, а также недостаточно высокий уровень материнских антител, способных нейтрализовать вирус в организме плода в случае несостоятельности плацентарного барьера.
Маркеры ЦМВ были выявлены у плодов в 35,4%. Аналогичные данные по частоте выявления ЦМВ были получены Lu Y et al. [17], которые выявили ДНК ЦМВ в плаценте и отпечатках органов умерших новорожденных с различной патологией в 46,3% случаев. Paradowska Е. [1 8] при исследовании органов умерших новорожденных выявила ДНК ЦМВ в 52,4% случаев, а антигены — у 42,8% умерших новорожденных.
Результаты сравнительного выявления ВПГ и ЦМВ четырьмя методами представлены в таблице 1, из которой видно, что инфекционно активный ВПГ выявлялся несколько реже, чем антигены в РИФ и ДНК ВПГ. Инфекционно активный ЦМВ выявлялся незначительно реже, чем антиген в РИФ, но достоверно реже, чем ДНК (р< 0,001). Это может свидетельствовать об истинном отсутствии инфекционной активности возбудителей или об утрате инфекционной активности при хранении материалов до их анализа.
Выявление ДНК ВПГ и ЦМВ в материалах аутопсии двумя разновидностями ПЦР показало, что ПЦР in situ обладает, по крайней мере не меньшей чувствительностью по сравнению с классическим методом ПЦР.
Анализ количества инфицированных клеток в препаратах методом ПЦР in situ показал, что наиболее интенсивно накопление ДНК герпесвирусов происходит в тканях мозга и почек. Локализация метки ДНК ЦМВ в клетках на препаратах мозга и почки, представлена на рисунке 1.
Преимущество ПЦР in situ заключается в том, что этот метод позволяет не только обнаружить вирус в изучае-
Вирусы Выявление ВПГ Выявление ЦМВ
Методы ПЦР ПЦР in situ РИФ БКМ ПЦР ПЦР in situ РИФ БКМ
Кол-во органов, л= 104 21 (20,2%) 25 (24%) 22 (21,2%) 14(13,5%) 18(18,9%) 22 (23,1%) 8 (7,6%) 2 (1,9%)
Таблица 1. Частота выявления маркеров ЦМВ и ВПГ четырьмя методами в органах мертворожденных
Рисунок 1. Локализация ДНК ЦМВ методом ПЦР in situ на отпечатках плодов и умерших новорожденных. Отпечатки инфицированных тканей: А — почка, В — мозг. Отпечатки неинфициро-ванных тканей (контроль): С — почка, D — мозг
мом органе, но также идентифицировать индивидуальные инфицированные клетки, оценить количество вирусной ДНК в них и выявить внутритканевую и внутриклеточную локализацию вирусов.
Сравнительный анализ частоты обнаружения прямых маркеров герпесвирусов (ДНК и белков) в группе мертворожденных детей и детей, умерших на первом году жизни представлен на рисунке 2, на котором видно, что прямые маркеры ВПГ выявлялись с одинаковой частотой в исследуемых группах. Прямые маркеры цитомегаловируса (ДНК и антигены) у детей, умерших на первом году жизни, обнаруживались значительно чаще, чем у мертворожденных (я <0,005). Эти данные могут свидетельствовать как о постнатальном инфицировании, так и об обострении хронической врожденной ЦМВИ.
Необходимо отметить, что в группе мертворожденных инфекционно активный ВПГ выявлялся существенно чаще, чем инфекционно-активный ЦМВ [р< 0,001), а в группе детей, умерших на первом году жизни, инфекционно активный ЦМВ определялся значительно чаще, чем инфек-
70-60-50-40-
зо-20-ю-о -
ЦМВ
□ плоды и мертворожденные ■ дети, умершие до года
ВПГ
ж
ДНК антиген ДНК антиген
Рисунок 2. Частота выявления прямых маркеров ВПГ и ЦМВ в аутопсийных материалах мертворожденных детей и детей, умерших до года: ДНК — методом ПЦР, антиген — методами РИФ + БКМ
ционно активный ВПГ (/><0,05). Возможно, у обследованных нами умерших новорожденных с внутриутробной герпетической инфекцией ВПГ мог быть одним из факторов или кофакторов врожденной инфекции, и мы выявляли ВПГ, который после завершения репликации сохранялся в организме в неактивном состоянии. У детей с врожденной цитомегаловирусной инфекцией на первом году жизни вероятно чаще возникали обострения инфекции или имело место постнатальное инфицирование.
На рисунке 3 представлена частота выявления ВПГ и ЦМВ в исследованных органах.
ЦМВ наиболее часто выявлялся в отпечатках ткани легкого (р< 0,005) и почки, а ВПГ выявлялся практически с одинаковой частотой в различных органах, несколько чаще — в ткани почек у мертворожденных.
У всех мертворожденных, обследованных 4 методами, кроме диагноза: анте- или интранатальная асфиксия в окончательном заключении после проведения патоло-гоанатомического и вирусологического исследований в качестве основного, конкурирующего, сопутствующего или фонового заболевания указывалась врожденная генерализованная вирусная инфекция (ВУИ) и/ или множественные врожденные пороки развития (МВПР).
В одних случаях в качестве конкурирующих диагнозов в заключении указывалось два диагноза: ВУИ и ВПР; МВПР на фоне генерализованной ВУИ. В других случаях — такие варианты, как: ВУИ с формированием фетодисплазий и/или пороков развития; ВУИ с тератогенным эффектом; ВУИ с аномалиями фетогенеза.
При патологоанатомическом исследовании в 1 8 случаях из 34 (52,9%) были выявлены признаки текущего инфекционного процесса; при этом у двух недоношенных мертворожденных с экстремально низкой массой тела была выявлена только острая вирусная инфекция в виде энцефалита, менингита, миокардита, гепатита. В остальных случаях наряду с признаками текущей инфекции были выявлены и множественные фетодисплазии, свидетельствующие о хроническом персистирующем течении ВУИ, такие как гипоплазия сердца, почек, аорты; микро-полигирия, микрокардия, микрорения, глиоз вещества головного мозга, дисплазия, фиброэластоз эндокарда предсердий, миксоматозное разрастание на створках ат-риовентрикулярных клапанов, преждевременное закрытие овального окна, дисплазия створок клапанов и др.
В 16 случаях из 34 (47,1 %) признаки текущей инфекции отсутствовали, но у мертворожденных были выявлены множественные перечисленные выше дисплазии, характер которых может свидетельствовать о перенесенной ранее внутриутробной инфекции, что нередко и указывается в заключении. Необходимо отметить, что перечисленные выше фетодисплазии выявлялись с одинаковой частотой у мертворожденных как в случаях с текущим инфекционным процессом, так и в случаях, когда признаки текущей инфекции отсутствовали.
Одним из косвенных признаков внутриутробного инфицирования является то или иное поражение тимуса: гипоплазия, гиперплазия, аплазия тимуса, тимомегалия, агене-
зия, преждевременный жировой метаморфоз, различные стадии акцидентальной инволюции тимуса. Различные изменения в тимусе в группе мертворожденных с признаками текущей инфекции и в группе мертворожденных без признаков инфекции к моменту исследования выявлялись с одинаковой частотой (82,4 и 85,7% соответственно).
Полученные данные свидетельствуют как об определенной условности постановки того или иного конкретного диагноза, так и о существенной роли врожденной вирусной инфекции в мертворождении.
Выявленные изменения в тканях и органах в подавляющем большинстве случаев являются следствием ассоциированного (одновременного или последовательного) инфицирования различными возбудителями в разные сроки гес-тации. В результате вирусологического исследования установлено, что смешанное инфицирование было выявлено во всех случаях. При анализе частоты выявления различных патогенов было установлено, что самым частым компонентом смешанной инфекции был один или несколько серовариантов энтеровирусов. В отличие от ВПГ, ЦМВ или краснухи нам не удалось выявить существенных различий в частоте выявления энтеровирусов у плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.
Следует отметить, что выявить и при гистологическом исследовании признаки, специфичные или патогномонич-ные для той или иной инфекции практически невозможно. Лишь в 10—12% возможно было с большой долей вероятности поставить диагноз врожденной генерализованной моно цитомегаловирусной инфекции, ВПГ инфекции, рубе-олярной фетопатии или врожденного токсоплазмоза [8].
Если учитывать только результаты выявления герпесви-русных инфекций, то ВПГ и ЦМВ выявлялись как в виде моноинфекции, так и в сочетаниях между собой. Так из 22 случаев с выявленной ЦМВ или ВПГ инфекцией у
9 мертворожденных (40,9%) выявлена моно ВПГ инфекция, а у 3 мертворожденных (13,6%) — моно ЦМВ инфекция. Смешанная ВПГ и ЦМВ инфекция была выявлена в
10 из 22 случаев у мертворожденных (45,4%); у умерших на первом году жизни одновременно ВПГ и ЦМВ выявлялись в 86%. То есть частота смешанной ВПГ и ЦМВ инфекции с увеличением возраста умерших детей существенно возрастает [р = 0,001).
Результаты, полученные в настоящей работе по выявлению прямых маркеров ВПГ и ЦМВ в материалах аутопсии, в том числе и инфекционно активного вируса, подтверждают полученные нами ранее данные о значении гер-песвирусных инфекций в смерти плода и новорожденного. Данные, представленные в настоящей работе, полностью согласуются с результатами Владимировой Н. Ю. и соавторов [21 ], показывающих даже более высокую частоту (87,6%) выявления герпесвирусных инфекций в материалах аутопсии. Это ставит под сомнение существующее представление о том, что инфицирование ВПГ происходит только во время родов. По данным Серова и соавторов [22], Черкасова и соавторов [23] ряд врожденных аномалий развития является следствием сочетанного инфицирования ВПГ и ЦМВ в эмбриональном и фетальном периодах.
% юо-
90-80" 70-60-50-40-30-20-10-0 -
rtilljTfH
мозг почка печень легкое сердце
□ ВПГ у мертворожденных □ ВПГ у детей, умерших до года ■ ЦМВ у мертворожденных ■ ЦМВ у детей, умерших до года
Рисунок 3. Сравнительный анализ частоты обнаружения ВПГ и ЦМВ в различных органах у мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни
По данным отечественных авторов традиционно отмечается более высокая частота внутриутробного инфицирования ВПГ и ЦМВ по сравнению с данными зарубежных исследователей. Однако в последнее время и в зарубежной литературе появились работы, в которых показано значительное увеличение количества случаев врожденной герпесвирусной инфекции [24].
Таким образом, инфекции, вызванные герпесвирусами, так же как и инфекции иной этиологии, играют существенную роль в перинатальной патологии, а также в смерти плода и новорожденного. Данные, представленные в работе, дают основание полагать, что инфицирование ВПГ в эмбриональном и фетальном периодах не столь редкое явление. Для диагностики врожденных герпесвирусных инфекций необходимо использовать комплекс лабораторных методов, позволяющих оценить и дифференцировать латентное течение инфекции и активный инфекционный процесс.
Литература:
1. Сорокина М. Н. Вирусные энцефалиты и менингиты у детей / М. Н. Сорокина, Н. В. Скрипченко. — М., — 2004. — 424 с.
2. Viruses and other infections in stillbirth: what is the evidence and what should we be doing? / W. Rawlinson et. al. // Pathology. — 2008. - V. 40 (2). - P. 149-160.
3. Preconceptional primary human cytomegalovirus infection and risk of congenital infection / M. Revello et. al. //J. Infect. Dis. — 2006. — Mar 15. - V. 193 (6). - P. 783-787.
4. Sauerbrei A. Herpes simplex and varicella-zoster virus infections during pregnancy: current concepts of prevention, diagnosis and therapy. Part 1: herpes simplex virus infection /А. Sauerbrei, P. Wutzler // Med. Microbiol. Immunol. - 2007. - Jun. - V. 196 (2). - P. 89-94.
5. Trincado D. Congenital and perinatal infections with cytomegalovirus / D. Trincado, W. Eawlinson // J. Paediatr. Child Health. —
2001.-V. 37.-P. 187-192.
6. Значение различных вирусных инфекций в невынашивании, мертворождении, перинатальной и младенческой смерти / Л. Л. Нисе-вич и др.// Педиатрия. - 1999. - № 3. - С.1-10.
7. Squier W. Shaken baby syndrome: the quest for evidence // Dev. Med. Child Neurol. - 2008. - V. 50 (1). - P. 10-14.
8. Нисевич Л. Л. Основные причины смерти новорожденных / Л. Л. Нисевич, А. Г. Талалаев // Руководство по педиатрии. Неонатология. - М., 2006. - С. 432-448.
9. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome / M. A. Gaytant et. al. // Obstet. Gynecol. Surv. —
2002. - V. 57. - P. 245-256.
10. Hassan J. Translational mini-review series on infectious disease: congenital cytomegalovirus infection: 50 years on./ J. Hassan, J. Connell // Clin. Exp. Immunol. - 2007 Aug. - V. 149 (2). - P. 205-210.
11. Kenneson A. Review and meta-analysis of the epidemiology of congenital cytomegalovirus (CMV) infection / A. Kenneson, M. Cannon // Rev. Med. Virol. - 2007. - V. 17 (4). - P. 253-276.
12. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций. Методические рекомендации № 02.030—08, Роспот-ребнадзор. — М, 2008. — 20 с.
13. Сравнение различных методов лабораторной диагностики при выявлении цитомегаловируса в аутопсийном материале умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни / А. А. Меджидова и др. // ЖМЭИ. - Т. 3, №2. - С. 63-69.
14. Получение и свойства моноклональных антител к вирусу герпеса 1 и 2 типа / Р. Р. Климова и др. // ЖМЭИ. - 1999. - № 5. -С. 99-103.
15. Получение моноклональных антител к сверхранним белкам цитомегаловируса человека и их применение для выявления инфицированных клеток / Н. Е. Макарова и др. // Бопр. вирусологии. - 1996.-Т. 41, № 1.-С. 28-32.
16. Malm G. Congenital cytomegalovirus infections / G. Malm, M. Eng-man // Semin. Fetal. Neonatal. Med. - 2007, Jun. -V. 12 (3). -P. 154-159.
17. Lu Y. Human cytomegalovirus infection and congenital malformation / Y. Lu, X. Weng, Z. Gu // J. Infect. Deas. - 2008, Mar. - V. 33 (3).-P. 132-135.
1 8. Paradowska E. Detection of cytomegalovirus in human placental cells by polymerase chain reaction / E. Paradowska, M. Prezikevich, D. Nowakowska // APMIS. - 2006. - V. 114 (11). - P. 764-771.
19. A wider role of congenital cytomegalovirus infection in sensorineural hearing loss / M. Barbi et. al. // Pediatr. Infec. Dis. — 2003. — V. 22. - P. 39-42.
20. Fetal cytomegalovirus infection of the brain: the spectrum of sonographic findings / G. Malinger et. al. // AJNR (Am. J. Neuroradi-ol.). - 2003. - V. 24. - P. 28-32.
21. Владимирова H. Ю. Эпидемиологические аспекты репродуктивных потерь / Н. Ю. Владимирова, Е. Б. Наговицына, А. Л. Сятков-ская // Проблемы репродукции— 2001.— Т. 7, №3.— С. 54-57.
22. Сочетанная внутриутробная герпетическая и цитомегалови-русная инфекция и ее влияние на плод и новорожденного / В. Н. Серов и др. // Мат. Ill съезда Росс, ассоциации специалистов перинатальной медицины. — М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2000. - С. 76-77.
23. Черкасов Н. С. Сочетанное течение некоторых внутриутробных инфекций и врожденных пороков сердца у новорожденных детей / Н. С. Черкасов, П. И. Слобин, О. К. Русанова // Мат. Ill съезда Росс, ассоциации специалистов перинатальной медицины. - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2000. - С. 79-80.
24. Grangeot-Keros L. Diagnosis and prognostic markers of HCMV infection/ L. Grangeot-Keros, D. Cointe //J. Clin. Virol. — 2001. — V.21. — P. 213—221.
Противокраснушный иммунитет у женшин Архангельской области
Н. Л. Рогушина, О. В. Самолова, Л. В. Титова
ГОУ ВПО Северный государственный МЕДииинский университет федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, Архангельск
Статья посвящена изучению специфического гуморального иммунитета к вирусу краснухи у беременных и молодых женщин Архангельской области. Вовлечение в эпидемический процесс взрослых, в том числе женщин детородного возраста, повышает риск рождения детей с синдромом врожденной краснухи. По результатам обследования в Архангельской области группу риска по развитию синдрома врожденной краснухи составили 5,5% беременных и 7,2% молодых женщин. Ключевые слова: краснуха, беременность, женщины, гуморальный иммунитет, Архангельская область
УДК 616.916.1-07
Anti-rubella immunity in women of Arkhangelsk region
N. L. Rogushina, O. V. Samodova, L. V. Titova
State Educational Institution of Higher Professional Education Northern State Medical University of the Federal Agency for Healthcare and Social Development, Arkhangelsk
The article is dedicated to studying of specific humoral immunity to the rubella virus in pregnant and young women of Arkhangelsk region. Involvement of adults, women of childbearing age included, into the epidemic process increases the risk of giving birth to children with the syndrome of congenital rubella. According to the results of examination in Arkhangelsk region, the risk group on development of the congenital rubella syndrome is comprised of 5,5% of pregnant and 7,2% of young women.
Keywords: rubella, pregnancy, women, humoral immunity, Arkhangelsk region
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) казателя менее 1 случая на 100 000 живорожденных [1]. и ЮНИСЕФ разработали стратегическую программу Для достижения этой цели удельный вес восприимчивых к предупреждения врожденной краснухи в Европейском ре- краснухе женщин детородного возраста должен быть не-гионе. К 2010 году поставлена задача снизить уровень за- высоким. Проведение серомониторинга различных групп болеваемосги врожденной краснушной инфекцией до по- населения дает наиболее точную информацию о состоянии
_ противокраснушного иммунитета в популяции [2, 3]. Бес-
Рогушина Наталья Леонидовна-аспирант каф. детских инфек- симптомное течение значительно затрудняет выявление ций ГОУ ВПО Северный государственный медицинский универ- этой инфекции, которая представляет непосредственную ситет; 163022, г. Архангельск, ул. Победы, д. 19 корп. 6 кв. 2, опасность для восприимчивых беременных женщин, так как т. (8182) 22-95-42 до 90% случаев приводит к развитию уродств у плода [1,
