CC BY
63
ВЫЯВЛЕНИЕ КОПРОАНТИГЕНОВ ПРИ ТРИХИНЕЛЛЕЗЕ РЕАКЦИЕЙ СЭНДВИЧ-ИФА
Написанова Л.А.
ФГБНУ «Всероссийский НИИ фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И.Скрябина»
Введение. Трихинеллез, один из наиболее опасных гельминтозоонозов, имеет широкое распространение в различных природных зонах. Это инвазионное заболевание представляет собой серьезную медицинскую, ветеринарную и социально-экономическую проблему, поэтому во многих странах с неизменным постоянством проводятся комплексные ветеринарно-медико-биологические исследования по данной проблеме.
Прижизненная диагностика трихинеллеза с помощью иммунологической реакции имеет большое значение при разработке мероприятий по борьбе с этим социально опасным заболеванием. Совершенствование методов очистки антигенов, методик постановки реакций, приготовления реагентов способствует развитию иммунодиагностики, повышению эффективности реакций.
Среди множества тест-систем на основе иммуноферментного анализа (ИФА), которые достаточно часто используются в медицинской, а также и в ветеринарной практике, сэндвич-ИФА позволяет обнаруживать антигены паразита в различных биологических жидкостях зараженных животных и выявлять инвазию на самых ранних стадиях [2, 5, 3].
В связи с вышеизложенным, целью наших исследований была разработка тест-системы сэндвич-ИФА для выявления антигенов в экстракте фекалий (копроантигенов) при трихинеллезе. Это позволит обнаруживать антигены на кишечной стадии развития паразита, а также упростить и сделать более безопасным отбор проб для исследования у животных.
Материалы и методы. Для проведения работы белых беспородных крыс заражали личинками лабораторного штамма Trichinella spiralis разными дозами. Через 45-60 дней методом переваривания в искусственном желудочном соке (ИЖС) получали инвазионных личинок трихинелл. Жизнеспособность проверяли под микроскопом. Часть выделенных личинок использовали для заражения животных. Другую часть выделенных личинок накапливали до необходимого объема, замораживая и сохраняя при температуре минус 20°С до использования. Личинок трихинелл измельчали вручную на холоде до получения гомогенной массы, применяя прием поочередного замораживания-оттаивания. Процесс измельчения
контролировали с помощью бинокуляра при увеличении х32. Экстрагирование проводили в течение 20 часов в физиологическом растворе в соотношении 1:4 на магнитной мешалке при 4°С. По окончании экстрагирования суспензию центрифугировали при 20000 об./мин в течение 30 минут при 4°С, осадок удаляли, а супернатант использовали в качестве экстракта. Концентрацию
284
белка здесь и в последующем определяли по калибровочной кривой (предварительно построенной) на спектрофотометре Ломо-26 при длине волны 280 нм [1].
Очищенный антиген трихинелл готовили из экстракта методом гель-хроматографии. Разделение на фракции проводили на колонке, заполненной сорбентом Superose 12 Prep Grade с учетом замечаний Mayer, 1987. У полученных в процессе разделения фракций измеряли содержание белка и проверяли на активность и специфичность в иммуноферментной реакции. Отобранные фракции сливали вместе, измеряли содержание белка и использовали в дальнейшем для получения антител к антигенам Т. spiralis.
Антитела (IgG) к Т. spiralis получали из гипериммунной кроличьей сыворотки, используя методы осаждения и аффинной хроматографии.
Конъюгат готовили из очищенных аффинной хроматографией кроличьих IgG к T.spiralis, применяя периодатный метод, в качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена.
Экстракты фекалий получали следующим образом: свежесобранные фекалии тщательно смешивали с физиологическим раствором в соотношении 1грамм фекалий и 2 мл физ. раствора, затем центрифугировали при 8 тыс. об./мин в течение 5-10 мин на холоде. Надосадочную жидкость использовали в качестве испытуемого образца. Образец сохраняли до использования при минус 20 °С.
С целью постановки сэндвич-ИФА провели отработку параметров и режимов постановки реакции - определили оптимальную концентрацию антител, режим их фиксации на полистироловых планшетах, буфер для разведения; определили минимальный диагностический титр сывороток, рабочее разведение конъюгата и режимы инкубации сывороток и конъюгата.
Результаты. Для выполнения работы заразили личинками лабораторного штамма T. spiralis 31 беспородную крысу массой 120 г разными дозами. Четырнадцать крыс с дозой заражения по 2,5 тыс. личинок использовали для получения гельминтного материала. Остальные, получившие дозу по 4 личинки/г массы, использовали для сбора фекалий в разные сроки (4,12,20 день п/з) и приготовления из них экстрактов (17 проб). Из выделенных инвазионных личинок трихинелл, приготовили экстракт в количестве 12 мл с содержанием белка 16 мг/мл. В процессе гель-хроматографии экстракта на суперозе 12 Prep Grade получили 71 фракцию. Содержание белка во фракциях колебалось в пределах от 32 до 9000 мкг/мл. Проверили антигенную активность и специфичность фракций в ИФА. Наиболее диагностически эффективные фракции (5 образцов) объединили в пул, объем которого составил 15 мл, а содержание белка 1,8 мг/мл. Этот препарат использовали в качестве соматического очищенного антигена.
Антитела (IgG) к Т. spiralis получали из гипериммунной кроличьей сыворотки выделением гамма-глобулиновой фракции с помощью метода осаждения. Затем из гамма-глобулиновой фракции методом аффинной хроматографии на сорбенте с белком А из S. aureus выделили IgG по методике
285
производителя сорбента. Объем препарата антител составил 8 мл, содержание белка 0,5 мг/мл.
Постановку сэндвич-ИФА для выявления копроантигенов осуществляли на полистироловых планшетах отечественного производства.
Определение чувствительности тест-системы сэндвич-ИФА. При
определении чувствительности использовали пул (смесь) экстрактов фекалий от незараженных трихинеллами лабораторных крыс. Пул разводили раствором для разведения образцов в диагностическом титре 1:2. В качестве положительного контроля использовали этот же пул, добавляя в него известную концентрацию - 800 нг/мл экскреторно-секреторного антигена трихинелл (ЭСАГ1) с последующим титрованием кратно 2 до концентрации 6.25 нг/мл. При автоматическом учете тест-система показала чувствительность 100 нг/мл (рис. 1). При визуальном учете различия между отрицательным и положительным образцом определялись только при концентрации антигенов 150-170 нг/мл. Фон присутствует, по-видимому, из-за использования
конъюгата, приготовленного на основе менее очищенных антител к T. spiralis.
Далее провели предварительную проверку чувствительности на экстрактах фекалий от экспериментально зараженных T.spiralis крыс в дозе 4 лич/г массы животного и следующими сроками инвазии: 4, 12 и 20 дней (табл.).
Таблица
Выявление антигенов трихинелл в экстрактах фекалий экспериментально зараженных крыс при трихинеллезе
Экстракты фекалий (дни п/з T.spiralis) Кол-во образцов Результаты сэндвич-ИФА
положительный сомнительный отрицательный
4 6 3 2 1
12 6 5 1 0
20 5 1 2 2
Итого 17
Как видно из таблицы, из 17 проб от инвазированных трихинеллами животных положительный результат дали 9 образцов, сомнительный - 5 и 3 -отрицательный результат. Отрицательные результаты регистрировали на сроках 4 и 20 дни после заражения. Причиной этого, на наш взгляд, является недостаточный уровень антигенов в образцах в данные сроки.
Таким образом, в опытах по постановке сэндвич-ИФА для выявления копроантигенов при трихинеллезе установили следующие оптимальные параметры и режимы реакции: концентрация очищенных антител для
сенсибилизации полистиролового планшета 10 мкг/мл; титр испытуемых образцов (экстракт фекалий) - 1:2; режим сенсибилизации антител на полистироле - 18-20 часов при 4°С в 0.01М БКБ, рН 9.6; инкубация с образцами
286
40 минут и с конъюгатом 30 минут в термостате при 37°С. Раствор для разведения образцов состоит из 0.01М ФСБ, рН 7.2 с 0.9М NaCl, 0.05% БСА и 0.05% твина-20; конъюгат разводили 1:250 в таком же растворе с добавлением 0.5% БСА. Отмывку после каждого этапа реакции проводили 3 раза по 5 минут 0.01М ФСБ рН,7.2 с 0.9М NaCl и 0.05% твином-20. Субстратную смесь с ортофенилендиамином готовили на цитратном буфере стандартно. Реакцию останавливали стоп-реагентом, который состоял из дистиллированной воды и концентрированной серной кислоты в соотношении 1:1. Учет реакции проводили визуально и на автоматическом ридере при длине волны 492 нм. Чувствительность тест-системы сэндвич-ИФА в данном опыте при
автоматическом учете составила 100 нг/мл антигенов по белку.
Заключение. Использование более очищенных антител для сенсибилизации полистироловых планшетов позволило несколько повысить чувствительность сэндвич-ИФА при выявлении копроантигенов трихинелл, однако, для дальнейшего увеличения чувствительности реакции необходимо использовать конъюгат, также приготовленный с использованием более очищенных специфических антител к Т.spiralis.
Литература: l.Layne E.//Methods Enzymol.-1957.V.3.-P.447-454.
2. Ефремов Е.Е. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М. - 1982. - 217с.
3. Arriaga С., Yepez-Mulia L., Morilla А., Ortega-Pierres G. //Vet. Parasitol.-
1995.-V.58(4).-F.319-326. 4.Mayer R.J., Walker J.H.//Immunochemical
Methods in Cell and Molekular Biology, 1987. 5.Wolters G., Kuikpers L., Kacaki J. and Shuurs A.H.W.M.//J.clin.Path.-1976.-29.-F. 873-879.
Recovery of coproantigens at Trichinella infection using sandwich-IFA.
Napisanova L.A. All-Russian K.I. Skryabin Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants.
Summary. One represent the results of development of regimes and parameters of sandwich-IFA for recovery of coproantigens at Trichinella infection. The sensitivity of this test-system appears to be 100 ng/ml of antigens (according to the protein level) using the automatic recording procedure.
287
