CC BY
3
Клинические наблюдения
Выявление клеток Березовского - Рид - Штернберга в лимфатических узлах при классической лимфоме Ходжкина методом проточной цитометрии: серия клинических наблюдений
Аббасбейли Ф.М.1 • Феденко А.А.1' 2 • Зейналова П.А.1 • Мушкарина Т.Ю.3 • Мельникова А.А.3 • Гривцова Л.Ю.3
Аббасбейли Фируза Мазахировна - врач отделения онкогематологии1; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2359-0547
И 143081, Московская область, д. Лапино, 1-е Успенское шоссе, 111, Российская Федерация. E-mail: [email protected]
Феденко Александр Александрович - д-р мед. наук, врач отделения онкогематологии1; заведующий отделом лекарственного лечения опухолей2; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4927-5585. E-mail: [email protected]
Зейналова Первин Айдыновна - д-р мед. наук, заведующая отделением онкогематологии1; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1564-424X. E-mail: [email protected]
Мушкарина Татьяна Юрьевна - науч. сотр. отделения клинической иммунологии3; ORCID: https://orcid. org/0000-0002-1266-1792. E-mail: [email protected] Мельникова Анжелика Александровна - науч. сотр. отделения клинической иммунологии3; ORCID: https:// orcid.org/0000-0001-7229-2813. E-mail: [email protected] Гривцова Людмила Юрьевна - д-р биол. наук, заведующая отделением клинической иммунологии3; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9103-9688. E-mail: [email protected]
Опухолевые клетки Березовского - Рид -Штернберга (БРШ) при классической лимфоме Ходжкина (кЛХ), несмотря на их В-клеточную природу, демонстрируют абсолютно уникальный иммунофенотип. Клетки БРШ при их иммуногистохимической характеристике положительны по антигенам CD15 (в большинстве случаев), CD30, PAX-5, и не экспрессируют Т-клеточный антиген CD3, В-клеточный антиген CD19, в большинстве случаев отрицательны в отношении В-клеточного антигена CD20, а также в отношении экспрессии обще-лейкоцитарного антигена CD45. Учитывая такой однозначный иммунофенотип, клетки БРШ могут быть выявлены методом многопараметровой проточной цитометрии. Так, J.R. Fromm и соавт. (2006, 2014) убедительно показали возможность идентификации клеток БРШ в пунктате и/или биоптате лимфатических узлов при кЛХ, справедливо полагая, что такой достаточно простой и воспроизводимый метод, как проточная цитометрия, может быть дополнительным методом диагностики при кЛХ. Мы апробировали метод, предложенный J.R. Fromm и соавт., в определении поражения лимфатических узлов при кЛХ, применив 8-10-параметровую проточную цитометрию для детекции БРШ при кЛХ в 8 образцах биоп-татов лимфатического узла, и подтвердили возможность выявления клеток методом
проточной цитометрии высокого разрешения. Проведена морфологическая и иммуногисто-химическая оценка биопсийного материала лимфатических узлов пациентов с подозрением на кЛХ. В исследование включены клинические случаи с подтвержденной иммуно-гистохимически кЛХ (8 человек), за образцы сравнения приняты случаи с иным, нежели лимфома Ходжкина, диагнозом. Во всех исследованных случаях при кЛХ нами были выявлены клетки БРШ. В дальнейшем планируется проведение анализа большего количества наблюдений с использованием метода проточной цитометрии.
Ключевые слова: лимфома Ходжкина, проточная цитометрия, клетки Березовского - Рид -Штернберга
Для цитирования: Аббасбейли ФМ, Феденко АА, Зейналова ПА, Мушкарина ТЮ, Мельникова АА, Гривцова ЛЮ. Выявление клеток Березовского -Рид - Штернберга в лимфатических узлах при классической лимфоме Ходжкина методом проточной цитометрии: серия клинических наблюдений. Альманах клинической медицины. 2023;51(2):134-142. аои 10.18786/2072-0505-2023-51-015.
Поступила 09.06.2023; доработана 15.06.2023; принята к публикации 19.06.2023; опубликована онлайн 20.06.2023
1 Клинический госпиталь «Лапино-1» группы компаний «Мать и дитя» (ООО «Хавен»); 143081, Московская область, д. Лапино, 1-е Успенское шоссе, 111, Российская Федерация
2 Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена - филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава России; 125284, г. Москва, 2-й Боткинский пр., 3, Российская Федерация
3 Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава России; 249036, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королева, 4, Российская Федерация
Проточная цитометрия стандартно используется при диагностике острых лейкозов и лейкемизированных лим-фом и зачастую служит единственным методом оценки минимальной остаточной болезни (МОБ) при таких заболеваниях, как множественная миелома, хронический лимфолейкоз, острые лимфобластные и миелоидные лейкозы [13]. Особенно важным представляется то, что проточная цитометрия - метод, позволяющий очень четко выявлять и характеризовать малые клеточные популяции на основании особенностей их иммунофенотипа, даже если эти клетки единичны среди клеток микроокружения [4-5]. Подобная ситуация наблюдается в лимфатических узлах при классической лимфоме Ходжкина, вариант нодулярного склероза (кЛХНС). С приходом в клиническую практику проточной цитометрии высокого разрешения трудности в выявлении и характеристике единичных опухолевых клеток Березовского - Рид - Штернберга (БРШ) среди опухолевого микроокружения, богатого Т-клетками, В-клетками, эозинофилами, гистиоцитами и плазматическими клетками, были преодолены.
В отдельных исследованиях предпринимались попытки идентифицировать клетки БРШ с помощью проточной цитометрии в аспирационном или биопсийном материале лимфатического узла с целью подтверждения или дополнения имму-ногистохимического ИГХ окрашивания при диагностике ЛХ [6-8].
Современные исследования в этой области сосредоточены на определении отличий имму-нофенотипа клеток БРШ от воспалительного фона и на характеристике клеток опухолевого микроокружения как возможного биомаркера. На первом этапе отработки метода проточной цитометрии для идентификации клеток БРШ был использован прием с применением блокирующих антител к молекулам клеточной адгезии опухолевого микроокружения [6]. Однако далее было показано, что нет необходимости блокировать розеткообразование Т-клеток в случае применения проточной цитометрии высокого разрешения с одновременной оценкой на клетках образца 9 специфических параметров (оценка экспрессии на мембране антигенов СБ5, СБ15, СБ20, СБ30, СБ40, СБ45, СБ64, СБ71 и СБ95). Такой подход позволил установить важные для выявления клеток БРШ антигены и несколько упростить протокол диагностики [6, 8-10].
Принципиальными оказались комбинации антигенов СБ30 и СБ64, СБ95 и СБ40, экспрессия антигена Т-клеток СБ3 относительно параметра
бокового светорассеяния SSC (англ. side scatter, неспецифическая характеристика в проточной цитометрии, отражающая степень гранулирован-ности клетки, тип ее ядра), а также CD20 и CD40. Авторам исследования [7] удалось установить, что клетки БРШ без использования антител для блокировки розеткообразования Т-клеток имеют следующие характеристики: повышенное боковое (SSC) и прямое (FSC, англ. forward scatter, второй неспецифический параметр проточной цитоме-трии, отражающий размер клеток) рассеяние, то есть являются более гранулированными и имеют больший размер по сравнению с нормальными лимфоцитами, гетерогенны по экспрессии обще-лейкоцитарного антигена CD45 (частично из-за связанных Т-клеток), в основном отрицательны в отношении антигена В-клеток CD20, также отрицательны в отношении моноцитарного антигена CD64, могут быть положительными для антигена Т-клеток CD3 (из-за связанных Т-клеток) и всегда позитивны по экспрессии маркеров CD30, CD40 и CD95 [9]. Такие важные наблюдения позволяют напрямую реализовать метод проточной цитоме-трии в клинической практике для выявления клеток БРШ.
Материал и методы
Мы апробировали метод проточной цитометрии для выявления клеток БРШ в ткани лимфатических узлов у 8 пациентов с диагнозом кЛХ. За основу нами был принят 9-параметровый протокол, учитывающий данные, представленные зарубежными коллегами [6-8]. Принимая во внимание однозначность методики, подтвержденную методом клеточного сортинга и последующей морфологической верификацией клеток БРШ, клеточный сортинг мы не проводили [6, 11].
В исследовании анализировался биопсий-ный материал лимфатических узлов пациентов с подозрением на ЛХ, проходивших диагностику и лечение в 2021-2022 гг. в клиническом госпитале «Лапино», параллельно этот же материал оценивался морфологически и иммуногистохи-мически. В исследование включен материал 11 пациентов. У 8 пациентов был подтвержден диагноз кЛХНС.
У 2 пациентов данные ИГХ выявили В-клеточную неходжкинскую лимфому (фолликулярная лимфома Grade 1-2 c фолликулярным характером роста и мантийноклеточная лимфо-ма), у одного пациента установлена неорганная забрюшинная саркома, T2N1M1).
Все пациенты, биопсийный материал которых был включен в исследование, подписали
Аббасбейли Ф.М., Феденко А.А, Зейналова П.А., Мушкарина Т.Ю., Мельникова А.А. , Гривцова Л.Ю.
Выявление клеток Березовского - Рид - Штернберга в лимфатических узлах при классической лимфоме Ходжкина методом проточной цитометрии: серия клинических наблюдений
информированное согласие на использование результатов исследования биоматериала в научных целях.
В основной анализ включены случаи с подтвержденным диагнозом ЛХНС (8 человек). Случаи, в которых ИГХ исследование не подтвердило диагноз ЛХ (3 случая), были использованы нами в качестве образцов сравнения для оценки эффективности и специфичности методики выявления клеток БРШ (табл. 1).
Средний возраст пациентов с ЛХ составил 40,1 года, по гендерному признаку пациенты имели распределение 1:1 (4 женщины и 4 мужчин).
Иммунологическое выявление клеток БРШ проводилось в отделении клинической иммунологии Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба. Методика проточно-цито-метрического выявления клеток БРШ заключалась в последовательных этапах пробоподготовки и окраски субстрата прямыми флуорохромами моноклональных антител к антигенам, которые, согласно зарубежному протоколу, полезны для выявления клеток БРШ. На преаналитическом этапе из ткани лимфатического узла приготавливалась клеточная суспензия посредством аккуратного механического растирания ткани в буферном растворе. С полученными клетками проводилась прямая реакция иммунофлуоресценции согласно стандартной методике. При этом клетки окрашивались одномоментно моноклональными антителами к 9 антигенам, аналогично протоколу J.R. Fromm и соавт. [8]. Вместе с тем все принципиальные маркеры были объединены в одну пробу, что унифицировало анализ и позволяло анализировать большее количество клеток одновременно. Диагностическая проба представлена в табл. 2.
После окрашивания моноклональными антителами проба анализировалась на проточном ци-тометре FACS Aria. Проводился одновременный анализ не менее 10 000 000 клеток пробы.
Аналитический этап проводился с применением программного обеспечения Kaluza Analysis 2.2 в соответствии с последовательным алгоритмом гейтирования (точного выбора анализируемой клеточной популяции), предложенного в протоколе J.R. Fromm и соавт.
Таблица 1. Характеристика пациентов
№ п/п Возраст, годы Пол Диагноз
1 32 ж Классическая лимфома Ходжкина, вариант NSI
2 42 м Классическая лимфома Ходжкина, вариант NSII
3 62 ж Классическая лимфома Ходжкина, вариант NSI
4 40 м Классическая лимфома Ходжкина, вариант NSII
5 37 ж Классическая лимфома Ходжкина, вариант NSII
6 46 м Классическая лимфома Ходжкина, вариант NSII
7 33 м Классическая лимфома Ходжкина, вариант NSII
8 29 ж Классическая лимфома Ходжкина, вариант NSII
9 58 м Фолликулярная лимфома Grade 1-2 (фолликулярный тип роста)
10 31 ж Мантийно-клеточная лимфома стадии IIIA
11 18 м Неорганная саркома забрюшинного пространства T2N1M1
NS - нодулярный склероз (англ. nodular sclerosis), ж - женщины, м - мужчины
Результаты
Нами проанализированы возможности проточной цитометрии в отношении выявления клеток БРШ в биоптатах лимфатических узлов у 8 пациентов с подтвержденным методом ИГХ диагнозом кЛХНС, при этом у 6 пациентов из 8 вариант расценен как NSII, а у 2 - как NSI.
Для выявления клеток БРШ мы применяли алгоритм последовательного гейтирования (выбора целевой анализируемой популяции) с целью аккуратного и более точного определения опухолевой популяции. Данный алгоритм представлен на рис. 1. При этом на первом этапе (рис. 1А), согласно иммунофенотипическим характеристикам клеток БРШ, определяются СО-45-негативные клетки образца. Далее в пределах этих клеток оцениваются все CD30+ клетки образца (рис. 1Б). Следующий этап - исключение из анализа примеси миело-моноцитарных клеток, которые могут экспрессировать CD30 (для этой цели был предложен антиген CD64). В дальнейший анализ включаются клетки, попавшие
Таблица 2. Панель прямых флуорохромных конъюгатов моноклональных антител для выявления клеток Березовского - Рид - Штернберга
Проба/флуорохром 1 2 3 4 5 6 7 8 9
FITC PE Pe-cy5 PE-cy7 AF-700 APC-cy7 Bv 605 Bv 711 Bv 786
Моноклональные антитела CD40 CD95 CD45 CD15 CD64 CD19 CD30 CD20 CD3
CD20 FSC-A
[Е] COTÍ / CW0
[F| CD15 ! SSC-A
Gal* Number XToUl KGlt*cj
All 5M 0,01 100,00 F H5 0,00 25,71
CDI5
Gate Number %ToUI %Q*t*d
All 145 0,00 100,00
G 123 0,00 84,83
Рис. 1. Алгоритм проточно-цитометрического выявления клеток Березовского - Рид - Штернберга (БРШ) в клеточной суспензии биоптата лимфатического узла: А - выделение С045-негативных клеток среди всех клеток анализируемого образца; Б - выявление CD30+ клеток в пределах только Сй45-негативных клеток; В - выделение клеток с яркой экспрессией антигена CD30 и исключение из анализа других миело-моноцитарных клеток по экспрессии миело-моноцитарного антигена CD64; Г - исключение из популяции CD30++CD64- примеси В-клеток (CD19+CD20+) на основании экспрессии соответствующих антигенов; Д - исключение из анализа мелких клеток и клеток с низкими показателями бокового светорассеяния SSC (англ. side scatter); Е - выявление популяции клеток БРШ с иммунофенотипом CD30++CD64-CD19-CD95+CD40+ клеток; Ж - оценка количества клеток БРШ (123 клетки из 10 000 000 проанализированных клеток образца) с учетом экспрессии CD15
Аббасбейли Ф.М., Феденко А.А., Зейналова П.А., Мушкарина Т.Ю., Мельникова А.А., Гривцова Л.Ю.
Выявление клеток Березовского - Рид - Штернберга в лимфатических узлах при классической лимфоме Ходжкина методом проточной цитометрии: 137
серия клинических наблюдений
1 'ШЛ шя
е '¿"•Т'ч •
Рис. 2. Иммуногистохимическое исследование. Лимфатический узел с фиброзными септами, ограничивающими нодулярные структуры из лимфоцитов, немногочисленных гистиоцитов и эозинофильных лейкоцитов, а также разрозненных крупных клеток, сходных с клетками Березовского - Рид - Штернберга (БРШ): А - многочисленные клетки БРШ с двумя или более ядер, эозинофильными ядрышками и широкой цитоплазмой. Обнаруживаются также клетки Ходжкина, являющиеся подвидом клеток БРШ, содержащие одно ядро с крупным ядрышком. Гематоксилин и эозин, х 200; Б - две крупные опухолевые клетки в центре изображения проявляют слабое ядерное окрашивание РАХ5 при сильной ядерной экспрессии в фоновых малых В-лимфоцитах, х 400; В - выраженная мембранно-цитоплазматическая экспрессия клетками БРШ, в том числе и в комплексе Гольджи, х 400; Г - выраженная экспрессия опухолевыми клетками CD15, х 200; CD30 - позитивная (выраженная мембранная и очаговая цитоплазматическая экспрессия в крупных клетках); CD15 - позитивная (выраженная мембранная и очаговая цитоплазматическая экспрессия в крупных клетках); PAX5 - позитивная (слабовыраженная ядерная экспрессия в крупных клетках); MUM1 - позитивная (выраженная ядерная экспрессия в крупных клетках); CD3 -негативная; CD45 - негативная
в область С и представляющие собой CD30++CD64-клеточную популяцию (рис. 1В). Затем в пределах популяции CD30++CD64- исключается возможная примесь клеток по экспрессии пан-В-кле-точных антигенов CD19 и CD20 (рис. 1Г). Далее среди CD30++CD64-CD19- клеток на основании характеристик светорассеяния FSC/SSC в анализ включаются только крупные клетки (высокий FSC) со средними и высокими показателями бокового светорассеяния SSC (рис. 1Д), после чего происходит учет CD95+CD40+ клеток, что по совокупности всех шагов определяет искомую популяцию клеток БРШ с иммунофеноти-пом CD45-CD30++CD64-CD19-CD95+CD40+, которая в данном случае составила 145 на 10 000 000 проанализированных клеток полученной нами суспензии клеток лимфатического узла. Наконец, на завершающем этапе в пределах указанной выше популяции учитываются CD15+ клетки (рис. 1Ж), составляющие подавляющее большинство среди CD45-CD30++CD64-CD19-CD95+CD40+ клеток. Таким образом, суммарное количество клеток БРШ с иммунофеноти-пом CD45-CD30++CD64-CD19-CD95+CD40+CD15+
составило 123 на 10000000 проанализированных клеток полученной нами суспензии клеток лимфатического узла. Данный случай продемонстрировал наибольшее количество клеток БРШ, выявленное нами в анализируемой группе образцов ЛХ.
Следует отметить, что отдельные клетки БРШ данного образца обнаруживают экспрессию СБ20 (рис. 1Г).
Иммуногистохимическое подтверждение наличия клеток БРШ в том же биоптате лимфатического узла, из которого выполнялось проточ-но-цитометрическое исследование, представлено на рис. 2, где отчетливо видно наличие крупных с типичной морфологией С030+С015+РАХ5+ клеток БРШ.
Применение указанного протокола позволило нам выявить популяцию клеток БРШ в разном количестве во всех анализируемых образцах с диагнозом ЛХНС, а также установить вариабельность клеток БРШ в отношении экспрессии антигенов СБ15 и СБ20.
В образцах группы сравнения похожей популяции С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015+ клеток нами не выявлено. Так, на рис. 3 представлен пример анализа клеток биоптата лимфатического узла пациента с внеорганной забрюшинной саркомой. Согласно описанному выше алгоритму при оценке СБ45-негативных клеток образца (рис. 3А) выявлены СБ30+ клетки (рис. 3Б). В пределах СБ30+ клеток выделена популяция СБ64-негативных клеток (рис. 3В), но дальнейший анализ показал отсутствие среди данной популяции С095+С040+ клеток (рис. 3Г), что подтверждает правомочность описанного алгоритма в отношении выявления клеток БРШ в лимфатических узлах при кЛХ.
Результаты проведенного исследования им-мунофенотипических особенностей и количества клеток БРШ в лимфатических узлах при кЛХ суммированы в табл. 3.
Обсуждение
Применение данного алгоритма проточно-цито-метрической детекции клеток БРШ и применение проточной цитометрии высокого разрешения дает возможность легко исключить другие заболевания, которые морфологически имитируют кЛХ, например, анапластическую крупноклеточную В-клеточную лимфому или В-клеточную крупноклеточную лимфому, богатую Т-клетками и гистиоцитами [11].
СБ30-позитивная Т-клеточная лимфо-ма / анапластическая крупноклеточная лимфома
[С| С020 / СР19
НА.
1№ 1«? 10" 1№
СР20
[П] с (хо / сгт
1(Р :
1«*-
■п
о
а
1СР- 10" 1Р1 1СР
СГИО
Рис. 3. Оценка иммунофенотипа клеток биоптата лимфатического узла пациента с забрюшинной внеорганной саркомой: А - выделение Сй45-негативных клеток; Б - выделение области СР30+ клеток в пределах Сй45-негативных клеток; В - ограничение области анализа популяций Сй30+С064-; Г - исключение из анализа В-клеток на основании экспрессии СР19- и Сй20-антигенов; Д - оценка количества С095+С040+ клеток среди Сй45-С030+С019-С064- популяции, количество искомых клеток составило 0. Клеток с фенотипом Березовского - Рид - Штернберга не выявлено
может быть исключена на основании того, что опухолевые клетки этой лимфомы имеют более низкие характеристики 88С в сравнении с клетками БРШ, а также более яркую экспрессию СБ45, СБ5, СБ95 и вариабельную экспрессию СБ30 и СБ71 в отсутствие СБ20 [12, 13]. Диффузная В-клеточная крупноклеточная лим-фома может быть исключена из-за отсутствия СБЗО, яркой экспрессии СБ20 и более низких показателей 88С, а также наличия клональных цепей иммуноглобулинов. Опухолевый субстрат метастатической мелкоклеточной карциномы при схожести показателей 88С и Б8С отличает от клеток БРШ негативность в отношении антигенов СБЗО и СБ40. Кроме того, опухоль демонстрирует полное отсутствие СБ45 при проточной цитометрии, что нетипично для клеток БРШ,
где наблюдается слабая экспрессия обще-лейкоцитарного антигена СБ45.
Как показывают наши наблюдения, саркому отличает от кЛХ отсутствие экспрессии на СБ30+ клетках антигенов СБ40 и СБ95 (см. рис. 3).
Вариант ЛХ с нодулярным лимфоидным преобладанием (ЛП) не может быть установлен с применением описанной выше методики, однако подтверждение данного диагноза с применением проточной цитометрии все-таки возможно. Так, установлено, что ЛП-клетки положительны на СБ20 и отрицательны на СБ15 и СБ30. Воспалительный фон при нодулярном ЛП (НЛП) представлен СБ4-позитивными/С057-позитивными Т-клетками [14].
Как уже описано выше, В-клеточная лимфо-ма, богатая Т-клетками, может быть определена
Аббасбейли Ф.М., Феденко А.А, Зейналова П.А., Мушкарина Т.Ю., Мельникова А.А. , Гривцова Л.Ю.
Выявление клеток Березовского - Рид - Штернберга в лимфатических узлах при классической лимфоме Ходжкина методом проточной цитометрии: серия клинических наблюдений
Таблица 3. Количество и иммунофенотип клеток Березовского - Рид - Штернберга в анализируемых образцах
№ п/п Количество клеток Иммунофенотип клеток
1 70 С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015+
2 123 С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015'™С0207-
3 65 С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015+
4 86 С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015'"С0207-
5 97 С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015'™С0207-
6 106 С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015'"С0207-
7 93 С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015+
8 89 С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015+
9 0 Не выявлено
10 0 Не выявлено
11 0 Не выявлено
по яркой и мономорфной экспрессии СБ20 в крупных опухолевых клетках. Опухолевые клетки этой лимфомы также экспрессируют другие В-клеточные маркеры, включая белок 6 В-клеточной лимфомы (БСЬ-6), и не экспресси-руют СБ15 и СБ30, что четко исключает диагноз ЛХ в этом случае. Опухолевое микроокружение данной лимфомы гетерогенно и представлено различными субпопуляциями Т-клеток [14].
Реактивная гиперплазия лимфатических узлов при оценке методом проточной цитометрии может быть исключена на основании сохранения гистологической структуры, присутствия лимфоцитов с нормальным неизмененным иммуно-фенотипом и отсутствия крупных С030+С015+ клеток.
Недавно предложен метод надежного выявления ЛП опухолевых клеток с применением многопараметровой проточной цитометрии [11]. Подход к идентификации ЛП-клеток аналогичен подходу к иммунофенотипированию клеток Ходжкина при кЛХ. Авторами использована комбинация антигенов СБ20, СБ38, СБ40, СБ54, СБ71, а также СБ32 и СБ71 для идентификации ЛП-клеток. Для исключения неопухолевых клеток применена комбинация антигенов СБ5, СБ10 и СБ64. Для оценки образования розеток применяется сочетание антигенов СБ5 и СБ45. Параллельно оценивается содержание ДНК (с использованием ДНК-связывающего красителя
БАР1) и ядерная экспрессия антигена БСЬ-6. Подобно иммунофенотипу, описанному при ИГХ, методом проточной цитометрии было показано, что ЛП-клетки демонстрируют рестрикцию поверхностных легких цепей иммуноглобулинов. Экспрессия В-клеточных антигенов СБ19 и СБ20 в данном случае сопоставима с реактивными В-клетками, также наблюдалась яркая экспрессия СБ40 и БСЬ-6. ЛП-клетки не экспрессируют СБ5, СБ10, СБ15, СБ30 или СБ64.
Такой подход обеспечил выявление опухолевых клеток с высокой чувствительностью и специфичностью, и популяция ЛП-клеток была выявлена во всех оцененных случаях ЛХНЛП (100% чувствительность). Данное исследование подтвердило, что ЛП-клетки взаимодействуют с Т-клетками с меньшей авидностью, чем клетки БРШ, а молекулы адгезии СБ50 и СБ54, вероятно, опосредуют это взаимодействие. Дополнительно установлено, что ЛП-клетки практически не экс-прессируют лиганды программируемой клеточной гибели РБ-Ь1 или РБ-Ь2 [11].
Кроме того, проточная цитометрия - удобный метод для характеристики опухолевого микроокружения, что может оказаться полезным в плане выявления дополнительных прогностических биомаркеров. Так, например, при сопоставлении иммунофенотипа воспалительного фона при ЛХ и реактивной лимфоидной гиперплазии обнаружены существенные различия между ними -при ЛХ наблюдается уменьшение В-клеток, увеличение СБ4-позитивных Т-клеток и СБ25-позитивных Т-регуляторных клеток по сравнению с реактивной гиперплазией [11, 14].
Установлены и некоторые особенности реактивного микроокружения при различных подтипах ЛХ. В частности, соотношение Ти В-клеток самое высокое в подтипах ЛХНС и ЛХДЛ и самое низкое в случае смешанно-клеточного варианта ЛХ. При сравнении имму-нофенотипа Т-клеток в реактивных лимфатических узлах с ЛХ показано, что соотношение СБ4:С08 в случае ЛХ выше, чем при гиперплазии, и при этом СБ4+ Т-клетки ЛХ показывают более яркую экспрессию СБ7 (СБ7++). Данный признак различался и в подтипах ЛХ - ЛХНС характеризует более высокое соотношение СБ4:С08 и присутствие популяции С04+С07++. Смешанно-клеточный вариант ЛХ по данной характеристике оказался схожим с реактивной гиперплазией. Т-клетки микроокружения ЛХНЛП демонстрировали более слабую экспрессию СБ7 по сравнению с кЛХ и реактивной гиперплазией [15, 16].
Заключение
Метод многопараметровой проточной цитоме-трии высокого разрешения может быть использован для выявления клеток БРШ в биоптатах, а при определенном навыке - и в пунктатах лимфатических узлов для подтверждения диагноза кЛХ. Во всех исследованных нами случаях ЛХ мы выявили клетки БРШ, тогда как в материале группы сравнения клеток с иммунофеноти-пом С045-С030++С064-С019-С095+С040+С015+
выявлено не было, что подтверждает правомочность используемого аналитического алгоритма. Использование данного алгоритма в работах J.R. Fromm и соавт. [6, 7] с дальнейшим сортингом и морфологической характеристикой данной популяции подтвердило специфичность представленной методики. Вместе с тем для дальнейшего клинического применения метода необходимо проведение анализа большего количества случаев. Ф
Дополнительная информация
Финансирование
Работа проведена без привлечения дополнительного финансирования со стороны третьих лиц. Конфликт интересов
Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Участие авторов
Ф.М. Аббасбейли - анализ клинических данных, написание текста; А.А. Феденко - общее руководство исследованием в разделе клинических данных, корректировка данных, редактирование текста;
П.А. Зейналова - общее руководство исследованием, корректировка данных, редактирование текста; Т.Ю. Мушкарина - выполнение проточно-цитометрических исследований, редактирование текста; А.А. Мельникова - выполнение преаналитического этапа работы, анализ данных проточной цитометрии, редактирование текста; Л.Ю. Гривцова - разработка дизайна исследования, анализ данных проточной цитометрии, общее руководство работой. Все авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией, согласны нести ответственность за все аспекты работы и гарантируют, что ими надлежащим образом были рассмотрены и решены вопросы, связанные с точностью и добросовестностью всех частей работы.
Список литературы / References
1. Гривцова ЛЮ, Мушкарина ТЮ, Лунин ВВ, Зейналова ПА. Проточная цитометрия при диагностике плазмоклеточных опухолей и оценке минимальной остаточной болезни. Онкогематология. 2021 ;16(3):16-25. doi: 10.17650/1818-8346-2021 -16-3-16-25. [Grivtsova LYu, Mushkarina TYu, Lunin VV, Zeynalova PA. [Flow cytometry in the diagnosis of plasma cell tumors and assessment of minimal residual disease]. Oncohematology. 2021;16(3):16-25. Russian. doi: 10.17650/18188346-2021-16-3-16-25.]
2. Чернышева ОА, Гривцова ЛЮ, Серебрякова ИН, Купрышина НА, Шолохова ЕН, Шервашидзе МА, Палладина АД, Курдюков БВ, Попа АВ, Тупицын НН. Диагностика острых лимфобластных лейкозов из Т-линейных предшественников и подходы к мониторингу минимальной остаточной болезни. Клиническая онкогематология. 2019;12(1 ):79-85. doi: 10.26442/18151434.20 19.4.190745. [Chernysheva OA, Grivtsova LYu, Serebryakova IN, Kupryshina NA, Sholokho-va EN, Shervashidze MA, Palladina AD, Kurdyu-kov BV, Popa AV, Tupitsyn NN. [Diagnosis of Acute Lymphoblastic Leukemia Originating From T-Lineage Precursors and Approaches to Minimal Residual Disease Monitoring]. Clinical Oncohematology. 2019;12(1):79-85. Russian. doi: 10.21320/2500-2139-2019-12-1-79-85.]
3. Grewal RK, Chetty M, Abayomi EA, Tomulea-sa C, Fromm JR. Use of flow cytometry in the phenotypic diagnosis of hodgkin's lymphoma.
Cytometry B Clin Cytom. 2019;96(2):116-127. doi: 10.1002/cyto.b.21724.
4. Гальцева ИВ, Смирнова СЮ, Паровични-кова ЕН. Методические аспекты детекции минимальной остаточной болезни у больных острыми лейкозами. Гематология и трансфузиология. 2022;67(1 ):108-120. doi: 10.35754/0234-5730-2022-67-1 -108-120. [Galtseva IV, Smirnova SY, Parovichnikova EN. [Methodological aspects of the detection of minimal residual disease in patients with acute leukemia]. Russian Journal of Hematology and Transfusiology. 2022;67(1):108-120. Russian. doi: 10.35754/0234-5730-2022-67-1-108-120.]
5. Гальцева ИВ, Давыдова ЮО, Паровични-кова ЕН, Гаврилина ОА, Троицкая ВВ, Капранов НМ, Никифорова КА, Исинова ГА, Зарубина КИ, Соколов АН, Савченко ВГ. Мониторинг минимальной остаточной болезни и В-клеточных субпопуляций у больных острым B-лимфобластным лейкозом, леченных по протоколу «0ЛЛ-2016». Гематология и трансфузиология. 2021;66(2):192-205. doi: 10.35754/0234-5730-2021-66-2-192-205. [Galtseva IV, Davydova YO, Parovichnikova EN, Gavrilina OA, Troitskaya VV, Kapranov NM, Niki-forova KA, Isinova GA, Zarubina KI, Sokolov AN, Savchenko VG. [Minimal residual disease and b-cell subpopulation monitoring in acute b-lym-phoblastic leukaemia patients treated on rall-2016 protocol]. Russian Journal of Hematology and Transfusiology. 2021;66(2):192-205. Russian. doi: 10.35754/0234-5730-2021-66-2-192-205.]
6. Fromm JR, Kussick SJ, Wood BL. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 2006;126(5):764-780. doi: 10.1309/7371-XK6F-6P74-74XX.
7. Fromm JR, Thomas A, Wood BL. Flow cytome-try can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 2009;131(3):322-332. doi: 10.1309/AJCPW3UN9DYLDSPB.
8. Fromm JR, Wood BL. A six-color flow cytom-etry assay for immunophenotyping classical Hodgkin lymphoma in lymph nodes. Am J Clin Pathol. 2014;141 (3):388-396. doi: 10.1309/ AJCP0Q1SV0XBHMAM.
9. Wu D, Wood BL, Fromm JR. Flow cytometry for non-Hodgkin and classical Hodgkin lymphoma. Methods Mol Biol. 2013;971:27-47. doi: 10.1007/978-1-62703-269-8_2.
10. Engert A, Plütschow A, Eich HT, Lohri A, Dörken B, Borchmann P, Berger B, Greil R, Willborn KC, Wilhelm M, Debus J, Eble MJ, Sökler M, Ho A, Rank A, Ganser A, Trümper L, Bokemeyer C, Kirchner H, Schubert J, Kral Z, Fuchs M, Müller-Hermelink HK, Müller RP, Die-hl V. Reduced treatment intensity in patients with early-stage Hodgkin's lymphoma. N Engl J Med. 2010;363(7):640-652. doi: 10.1056/NEJ-Moa1000067.
11. Fromm JR, Thomas A, Wood BL. Characterization and Purification of Neoplastic Cells of Nodular Lymphocyte Predominant Hodgkin
Аббасбейли Ф.М., Феденко А.А., Зейналова П.А., Мушкарина Т.Ю., Мельникова А.А., Гривцова Л.Ю.
Выявление клеток Березовского - Рид - Штернберга в лимфатических узлах при классической лимфоме Ходжкина методом проточной цитометрии: серия клинических наблюдений
Lymphoma from Lymph Nodes by Flow Cytometry and Flow Cytometric Cell Sorting. Am J Pathol. 2017;187(2):304-317. doi: 10.1016/j. ajpath.2016.10.007.
12. Jiang M, Bennani NN, Feldman AL. Lymphoma classification update: B-cell non-Hodgkin lymphomas. Expert Rev Hematol. 2017;10(5):405-415. doi: 10.1080/17474086.2017.1318053.
13. Roshal M, Wood BL, Fromm JR. Flow cyto-metric detection of the classical hodgkin
lymphoma: clinical and research applications. Adv Hematol. 2011;2011:387034. doi: 10.1155/2011/387034.
14. Kelly KM, Sposto R, Hutchinson R, Massey V, McCarten K, Perkins S, Lones M, Villaluna D, Weiner M. BEACOPP chemotherapy is a highly effective regimen in children and adolescents with high-risk Hodgkin lymphoma: a report from the Children's Oncology Group. Blood. 2011 ; 117(9):2596-2603. doi: 10.1182/ blood-2010-05-285379.
15. Bosler DS, Douglas-Nikitin VK, Harris VN, Smith MD. Detection of T-regulatory cells has a potential role in the diagnosis of classical Hodgkin lymphoma. Cytometry B Clin Cytom. 2008;74(4):227-235. doi: 10.1002/cyto.b.20407.
16. Hudnall SD, Betancourt E, Barnhart E, Patel J. Comparative flow immunophenotypic features of the inflammatory infiltrates of Hod-gkin lymphoma and lymphoid hyperplasia. Cytometry B Clin Cytom. 2008;74(1):1-8. doi: 10.1002/cyto.b.20376.
Identification of Reed-Berezovsky-Sternberg cells in lymphatic nodes in classic Hodgkin's lymphoma by flow cytometry: a clinical case series
F.M. Abbasbeyli1 • A.A. Fedenko1' 2 • P.A. Zeynalova1 • T.Yu. Mushkarina3 • A.A. Melnikova3 • L.Yu. Grivtsova3
Despite their B cell origin, Reed-Berezovsky-Sternberg tumor cells (RBS) in classic Hodgkin's lymphoma (cHL) demonstrate an absolutely unique phenotype. Immunohistochemistry of RBS cells is positive for CD15 antigen in most of cases, CD30, PAX-5; they do not express the T cell antigen CD3, B cell CD19, and in most cases are negative for the B cell antigen CD20, as well as for common leukocyte antigen CD45. Taking into account such unequivocal immunophenotype, RBS cells can be identified by multiparameter flow cytometry. Thus, J.R. Fromm et al. (2006, 2014) have convincingly shown the possibility to identify RBS cells in a puncture and/or biopsy sample of lymphatic nodes in cHL and were of the fair opinion that such rather simple and reproducible technique as flow cytometry could be an additional diagnostic instrument in cHL.
We have tested the technique proposed by J.R. Fromm et al. for the assessment of lymphatic node involvement in cHL and used 8 to 10-pa-rameter flow cytometry for detection RBS cells in cHL in 8 biopsy samples of a lymphatic node, and
confirmed the feasibility to identify RBS cells by high performance flow cytometry. We also performed morphological and immunohistochemical assessment of the biopsy samples of lymphatic nodes from patients with suspected cHL. The study included clinical cases with immunohisto-chemically confirmed cHL (n = 8), and the control samples were from those with other diagnoses than Hodgkin's lymphoma. In all cases of cHL we found RBS cells. In future we plan to analyze larger case samples by flow cytometry.
Key words: Hodgkin's lymphoma, flow cytometry, Reed-Berezovsky-Sternberg cells
For citation: Abbasbeyli FM, Fedenko AA, Zeynalova PA, Mushkarina TYu, Melnikova AA, Grivtsova LYu. Identification of Reed-Berezovsky-Sternberg cells in lymphatic nodes in classic Hodgkin's lymphoma by flow cytometry: a clinical case series. Almanac of Clinical Medicine. 2023;51(2):134-142. doi: 10.18786/2072-0505-2023-51-015.
Received 9 June 2023; revised 15 June 2023; accepted 19 June 2023; published online 20 June 2023
Firuza M. Abbasbeyli - Physician, Department of Oncohematology1; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2359-0547
* 1-e Uspenskoe shosse 111, Lapino, Moscow Region, 143081, Russian Federation. E-mail: [email protected] Alexandr A. Fedenko - MD, PhD, Physician, Department of Oncohematology1; Head of Department of Drug Treatment of Tumors2; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4927-5585. E-mail: [email protected]
Pervin A. Zeynalova - MD, PhD, Head of
Department of Oncohematology1; ORCID: https://
orcid.org/0000-0003-1564-424X.
E-mail: [email protected]
Tatyana Yu. Mushkarina - Research Fellow,
Department of Clinical Immunology3;
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1266-1792.
E-mail: [email protected]
Anzhelika A. Melnikova - Research Fellow,
Department of Clinical Immunology3;
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7229-2813.
E-mail: [email protected]
Lyudmila Yu. Grivtsova - Doctor of Biol. Sci., Head
of Department of Clinical Immunology3;
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9103-9688.
E-mail: [email protected]
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article. Authors' contributions
F.M. Abbasbeyli, clinical data analysis; A.A. Fedenko, general study management in its clinical part, data correction, text editing; P.A. Zeynalova, general study management, data correction, text editing; T.Yu. Mushkarina, performance of the flow cytometry, text editing; A.A. Melnikova, pree-analytical step of the study, analysis of the flow cytometry results, text editing; L.Yu. Grivtsova, the study design, analysis of the flow cytometry results, general study management. All the authors have read and approved the final version of the manuscript before submission, agreed to be accountable for all aspects of the work in ensuring that issues related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately considered and resolved.
1 Clinical Hospital "Lapino-1"(000 "Khaven");
1-e Uspenskoe shosse 111, Lapino, Moscow Region, 143081, Russian Federation
2 P.A. Hertsen Moscow Oncology Research Center -Branch of the National Medical Research Center of Radiology; 2-y Botkinskiy proezd 3, Moscow, 125284, Russian Federation
3 A. Tsyb Medical Radiological Research Centre -branch of the National Medical Research Radiological Centre; ul. Koroleva 4, Obninsk, Kaluzhskaya Region, 249036, Russian Federation
