CC BY
80
Светлана Сушко Елена Кадукова Татьяна Терпинская Александр Маленченко Евгений Конопля
ведущий научный сотрудник лаборатории комбинированных воздействий Института радиобиологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук
старший научный сотрудник лаборатории комбинированных воздействий Института радиобиологии НАН Беларуси
старший научный сотрудник лаборатории психонейрофизиологии и проблем онкогенеза Института физиологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук
заведующий лабораторией комбинированных воздействий Института радиобиологии НАН Беларуси, доктор медицинских наук
академик НАН Беларуси
Высшие грибы в комплексной терапии злокачественных новообразований
УДК 616-006.66-006.55:582.284
Развитие биотехнологии и микологии привело к появлению новой отрасли этих наук — фармацевтической микологии, основной целью которой стало создание лекарственных препаратов нового поколения. Особый интерес вызывают базидиальные грибы как источник новых эффективных и безопасных противоопухолевых природных веществ [1]. Исследованием их лечебных свойств и практическим применением в медицине активно занимаются ученые многих стран, прежде всего Китая, Японии, Кореи, США.
Следует отметить, что до настоящего времени большинство препаратов из грибов не выпускаются и не имеют разрешения на медицинское применение как в России, так и в Беларуси вследствие недостаточно высокого уровня биотехнологических производств. Поэтому,
прежде чем решать эти проблемы, необходимо развивать само грибоводство, учитывая тот факт, что грибы — это натуральные продукты, содержащие широкий ряд биологически активных веществ, необходимых для сохранения здоровья населения. Так, в базидиомах высших грибов в пуле липидов содержится до 90% линолевой кислоты, которая входит в состав таких известных лечебных препаратов, как «Эссенциа-ле», «Липостабил», получаемых из растительного и животного сырья. В бази-диальных грибах есть все необходимые микроэлементы и витамины, а также антиоксиданты и ценные протекторные соединения (трегалоза и маннит), предохраняющие мембраны при стрессор-ных воздействиях.
Экспериментальные исследования по поиску грибов-базидиомицетов, облада-
ющих противоопухолевой активностью, и оценке эффективности их употребления на различных моделях патологических состояний должны явиться основой для разработки препаратов из природного сырья, которые могут быть использованы в онкологической практике.
Цель работы — изучить радиозащитные свойства водных экстрактов грибов, их влияние на рост и развитие опухолевого процесса в легких у мышей линии А^ а также возможности повышения эффективности цитостатической терапии аде-нокарциномы Эрлиха.
В работе исследовалась функциональная активность грибов — опенка зимнего ^1аттиИпа velutipes) и аурикулярии уховидной (АипсиШа аипси1апа-^ае), выращенных в лаборатории пищевых и лекарственных ресурсов леса Институ-
та леса НАН Беларуси, а также веселки обыкновенной (Phallus impudicus), произрастающей в лесах Гомельской области.
Противоопухолевую активность водных экстрактов грибов исследовали в тесте с определением выхода спонтанных и индуцированных химическим мутагеном — уретаном аденом в легких у мышей линии Af. Эти группы характеризуются наследственной предрасположенностью к опухолеобразованию в легких и высокой чувствительностью легочной ткани к бластомогенному действию уре-тана. В процессе развития у интактных мышей возникают спонтанные опухоли легких, число которых увеличивается под действием мутагенных и канцерогенных факторов. Экспериментальные животные обоего пола были разделены на 6 групп.
1-й группе интактных мышей вводили однократно внутрибрюшинно (в/б) физиологический раствор (10 мл/кг); 2-й — уретан (1 мг/г). Мыши 3-й группы 14 дней принимали водный экстракт аури-кулярии уховидной (4 г/л); животным 4-й группы после приема в течение 14 дней водного экстракта аурикулярии однократно в/б вводили уретан (1 мг/г). По аналогичной схеме мыши 5-й группы принимали на протяжении 14 дней с питьем водный экстракт опенка зимнего (4 г/л), а 6-й — после 14-дневного приема экстракта гриба однократно в/б вводили уретан (1 мг/г).
Через 20 недель после введения уре-тана мышей выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации шейных позвонков с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных. выделенные легкие фиксировались в 10%-ном растворе формалина. После подсчета аденом определялись количество аденом/мышь и частота опухолеобразова-ния (% мышей с аденомами).
Радиозащитные свойства опенка зимнего оценивались частотой индуциро-
ванных аденом в легких у мышей после употребления с питьем водного экстракта этого гриба (12 г/л) и внешнего облучения животных в суммарной дозе 7 Гр (13^) дважды (по 3,5 Гр) с интервалом в месяц: водный экстракт гриба употреблялся в течение 1 месяца до первого облучения и впоследствии до вывода животных из эксперимента.
Радиозащитные и противоопухолевые свойства при приеме мышами водного экстракта веселки обыкновенной исследовались в следующих тестах.
Первый. Мыши линии Af контрольной и опытных групп подвергались общему однократному действию Y-излучения в дозе 7 Гр ^137), после чего находились на стандартном рационе вивария. Мыши опытных групп получали вместо воды без ограничения водный экстракт гриба веселки обыкновенной (4 г/л): 1-я — в течение 7 суток до облучения; 2-я — в течение 7 суток после облучения. Изучалась выраженность клинической картины острой лучевой болезни по параметрам выживаемости облученных мышей и динамике изменения массы тела (взвешивание производилось каждые трое суток, первое взвешивание — через 3 суток после облучения).
Второй. Исследования по изучению влияния водного экстракта веселки обыкновенной на рост опухолей и эффективность цитостатической терапии циклофосфаном (ЦФ) проводились на мышах-самках линии Af весом 19—22 г, которым перевивались под кожу клетки асцитной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) в дозе по 6 млн клеток на мышь. Половине всех животных после перевивки опухолевых клеток ежедневно давали с питьем водный экстракт веселки обыкновенной, остальные получали водопроводную воду. Через 2 недели после перевивки опухолевых клеток половине животных, употреблявших экстракт веселки, и половине животных, получавших водопроводную воду, однократно
Таблица 1. Количество аденом в легких у мышей, употреблявших с питьем экстракты грибов, через 20 недель после введения уретана
в/б вводился цитостатический препарат ЦФ в дозе 100 мг/кг, остальные мыши получали эквиобъемные количества физиологического раствора. О скорости роста опухоли судили по изменению ее объема, определяемого по формуле: V = (а*Ь*с*п)/6, где а, Ь, с — три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли, 1/6 п = 0,52 — постоянная величина, V— объем опухоли (в см3). Торможение роста опухоли (ТРО, %) при раздельном и комбинированном режиме лечения цФ и экстрактом веселки вычисляли по формуле ТРО = (V - / V, х 100%, где Vк—средний объем опухоли в контроле, V,,, — средний объем опухоли в опытной группе. Определяли процент животных, у которых опухоли подвергались практически полной регрессии (были менее 0,07 см3 или не прощупывались при пальпировании).
При исследовании влияния водных экстрактов грибов на уровень спонтанного и индуцированного введением уретана процесса опухолеобразования в легких у мышей линии Af было установлено, что у животных, употреблявших в течение 14 дней водный экстракт аурикулярии уховидной, через 20 недель количество спонтанных аденом в легких соответствовало уровню интактного контроля (табл. 1).
Данные в таблицах представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение (М ± т).
Введение интактным животным урета-на привело к значительному росту числа аденом. Так, количество аденом на мышь в этой группе составило 17,0 ± 2,73, а опухоли регистрировались у всех особей.
Профилактический прием экстракта аурикулярии уховидной перед уретано-вой интоксикацией более чем в 3 раза снизил количество образующихся у одного животного аденом по сравнению с группой «уретан» (р < 0,05). Однако, как и после уретановой интоксикации,
Группа животных Количество животных Аденом на группу Количество аденом/мышь Частота опухолеобразования, %
1. Контроль 12 4 0,33 ± 0,21 33,3
2. Уретан 12 204 17,0 ± 2,73* 100
3. Аурикулярия уховидная 12 4 0,33 ± 0,21* 33,3
4. Аурикулярия уховидная + уретан 16 88 5,5 ± 0,9** 100
5. Опенок зимний 17 2 0,12 ± 0,08* 11,8
6. Опенок зимний + уретан 10 111 11,1 ± 3,11 90
* различие статистически значимо при р < 0,05 по сравнению с контролем ** различие статистически значимо при р < 0,05 по сравнению с группой «уретан»
Таблица 2. Количество аденом легких у мышей, употреблявших с питьем экстракт опенка зимнего до и после внешнего облучения в суммарной дозе 7 Гр
Группа животных Количество животных (б'и?) Количество аденом/мышь Частота опухолеобразования, %
1. Контроль 30 0,13 ± 0,04 13,3
2. Облучение 26 0,36 ± 0,05* 38,5
3. Опенок зимний 28 0,07 ± 0,04 7,1
4. Опенок зимний + облучение 22 0,18 ± 0,06** 18,2
* различие статистически значимо при р < 0,05 по сравнению с контролем ** различие статистически значимо при р < 0,05 по сравнению с группой «облучение»
Таблица 3. Изменение средней массы тела (г) и выживаемости мышей после общего однократного воздействия у-излучения в дозе 7 Гр
Облучение 7 Гр Профилактический прием экстракта веселки +облучение 7 Гр Облучение 7 Гр +лечебный прием экстракта веселки
16,03 ± 1,91 16,51 ± 1,83 16,28 ± 1,62
15,36 ± 2,11 18,12 ± 1,53* 16,32 ± 2,68
14,37 ± 3,08 17,96 ± 2,08* 15,9 ± 2,15
17,1 ± 4,3 20,35 ± 2,16 15,34 ± 1,93
21,55 ± 3,07 21,49 ± 1,85 19,16 ± 1,74
Выживаемость мышей через 30 суток (%)
21,1 83,3 56,5
* различие статистически значимо по сравнению с группой «облучение» при р < 0,05
Таблица 4. Объем аденокарциномы Эрлиха у мышей на фоне приема водного экстракта веселки обыкновенной
Объем опухоли (см3), (количество животных),% торможения
г Время после трансплантации опухоли, сутки
группа г г ч I • I
14 21 31 36 42 48
АКЭ 1,00 ± 0,21 (22) 7,32 ± 1,67 (9) 2,47 ± 1,39 (3) —
АКЭ + веселка 1,2 ± 0,17 (24) 4,77 ± 0,86 (12) 34,8% 1,76 (1) 28,7% 7,16 (1) — —
АКЭ + ЦФ 3,08 ± 0,98* (8) 57,9% 0,91 ± 0,50 (3) 63,2% 0,62 ± 0,45 (3) 0,30 ± 0,21 (3) Полная регрессия (2)
АКЭ + веселка + ЦФ 2,60 ± 0,46* (11) 64,5% 0,33 ± 0,19 (4) 86,6% 0,17 ± 0,02 (3) 0,08 ± 0,02 (3) Полная регрессия (3)
* различие статистически значимо при р < 0,05 по сравнению с группой «АКЭ»
аденомы регистрировались у 100% животных.
У мышей, употреблявших в течение 14 дней водный экстракт опенка зимнего, через 20 недель количество аденом в легких было статистически достоверно снижено по сравнению с уровнем контроля (р < 0,05) (табл. 1). Частота опухолеобразования (процент мышей, у которых были зафиксированы аденомы) также была снижена по сравнению с контролем.
У животных, принимавших в течение 14 дней водный экстракт опенка зимнего, после введения онкогенного промотора уретана среднее количество аденом на одну особь существенно возросло по сравнению с уровнем интактного контроля, однако было ниже, чем у животных, которым уретан вводили на фоне приема питьевой воды (табл. 1). Следует отметить, что после профилактического приема водного экстракта этого гриба частота случаев с новообразованиями снижалась на 10%. Таким образом, водные экстракты изученных грибов оказывают ингибирующее действие на спонтанный (только в опытах с опенком) и индуцированный онкогенез в легких.
Исследованием воздействия Y-излуче-ния на уровень опухолеобразования в легких у мышей линии Af было уста-
новлено, что облучение индуцировало повышение количества аденом/мышь, а также процент животных, у которых определялись аденомы, по сравнению с уровнем интактного контроля (табл. 2).
У облученных мышей, получавших с питьем экстракт исследуемого гриба, начиная за месяц до первого облучения и в дальнейшем до вывода животных из эксперимента, практически вдвое было снижено количество аденом/мышь и частота аденом в легких по отношению к аналогичным значениям у облученных мышей, которые не принимали грибные экстракты (табл. 2).
известно, что клиническая картина острой лучевой болезни характеризуется наличием диспептического, костно-моз-гового и других синдромов. Диспепти-ческий синдром после однократного облучения мышей в дозе 7 Гр проявлялся выраженным снижением массы экспериментальных животных на протяжении 14—18 суток после воздействия. Результаты исследования показали, что этот синдром у мышей, которые с питьем принимали экстракт веселки обыкновенной, как до, так и после облучения был выражен слабее, что отразилось не только в меньшем снижении массы тела, но и более раннем ее восстановлении до уровня нормы (табл. 3).
Кроме того, употребление водного экстракта веселки повысило количество выживших животных. Так, в группе мышей, которые в течение недели после облучения принимали водный экстракт гриба, количество выживших особей было в 2,7 раза выше, чем в группе облученных мышей, пивших воду (табл. 3). Наибольший терапевтический эффект от употребления экстракта веселки на состояние животных, подвергнутых облучению, отмечался при профилактическом приеме — выживаемость при этом увеличивалась в 3,95 раза по сравнению с облученными мышами, которые пили воду. Таким образом, введение животным водного раствора плодовых тел веселки обыкновенной ослабляло выраженность клинической картины развития лучевой болезни, вызванной общим однократным воздействием Y-из-лучения. Это проявлялось в увеличении выживаемости мышей и нормализации массы тела.
В эксперименте с перевиваемой АКЭ показано, что при приеме экстракта веселки наблюдается тенденция к снижению объема опухоли: через 21 день после трансплантации АКЭ ТРО составило 34,8%; различий по выживаемости не выявлено (табл. 4).
Введение мышам ЦФ через две недели после перевивки АКЭ привело к снижению объема опухоли на 57,9% через 21 день после ее прививки (табл. 4). добавление в схему лечения экстракта веселки вызывало более значительное торможение роста опухоли — на 64,5% по сравнению с носителями АКЭ, не получившими лечения, и на 15,6% по сравнению с животными, обработанными ЦФ. У мышей, проживших 31 сутки и более после прививки опухоли, сохранялась та же тенденция: средние значения объема опухоли в группе, получавшей комбинированную терапию, на протяжении всего эксперимента были ниже, чем в группе цитостатического лечения в аналогичный срок (на 63,7; 72,6 и 73,3%
через 31, 36 и 42 суток после инокуляции животным опухоли соответственно). Использование для лечения мышей-опухоленосителей ЦФ в комбинации с приемом водного экстракта веселки обыкновенной увеличило процент вылеченных животных, у которых опухоль подверглась практически полной регрессии, с 17 до 25%.
По механизму действия активные вещества грибов, обладающие противораковой активностью, делят на две основные группы: оказывающие непосредственное воздействие на клетки опухоли и опосредованное, за счет стимуляции иммунитета. Основная часть последних представлена полисахаридами [2], имеющими 1-3-бета-гликановые группы в главной цепи и дополнительные 1-6-бета-гликановые группы в боковых цепях, необходимые для проявления противоопухолевой активности. Результаты исследований, в которых определялась противоопухолевая активность веществ и препаратов из грибов, показали, что они способны подавлять ангиогенез [3], индуцировать апоптоз в культуре клеток рака [4], снижать активность В-клеток и потенцировать активацию Т-хелперов [5], увеличивать число моноцитов и гра-нулоцитов при лейкопении, вызванной введением ЦФ [6].
В противоопухолевом эффекте грибных препаратов значительная роль отводится флавоноидам. Механизм действия последних связывают с их способностью понижать активность цитоплазма-тической и митохондриальной АТФ-аз, что вызывает дефицит АдФ и неорганического фосфата, вследствие чего ингибируется гликолиз и подавляется развитие опухолевых клеток. Биофлаво-ноиды также повышают активность естественных киллерных клеток у мышей и генов-супрессоров, которые вызывают супрессию онкогенов [7]. В настоящее время флавоноиды рассматриваются как один из наиболее перспективных источников получения препаратов, спо-
собных не только проявлять прямое ци-тостатическое воздействие на опухоль, но и стимулировать иммунологические реакции организма [8].
Таким образом, в ходе проведенных исследований выявлено, что профилактический прием водных экстрактов опенка зимнего и аурикулярии уховидной снижает выход спонтанных и индуцированных онкогенным промотором уретаном аденом в легких у мышей линии А! Употребление водного экстракта веселки обыкновенной в профилактическом и лечебном режиме значительно увеличивает выживаемость и улучшает общее состояние мышей, подвергнутых общему однократному облучению в дозе 7 Гр. при приеме экстракта веселки мышами — носителями АКЭ выявлена тенден-
Литература
ция к торможению скорости опухолевого роста и снижению объемов опухоли, а также к усилению эффекта противоопухолевого алкилирующего препарата ЦФ.
Исследуемые виды грибов обладают противоопухолевыми и противолучевыми свойствами и могут служить источником для создания лечебно-профилактических препаратов, применяемых как для стабилизации состояния онкологических больных при лучевой терапии, так и для профилактики опухолеобразования при приеме лекарств, обладающих мутагенным действием. Представляются перспективными дальнейшие исследования по использованию экстрактов изученных грибов в качестве дополнительного компонента в комплексном лечении злокачественных новообразований.
1. Wasser S.P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. Vol. 60. N3. P. 58-74.
2. Monro J.A. Treatment of cancer with mushroom products // Arch. Environ. Health. 2003. Vol. 58. N8. P. 533-537.
4. Kobayashi H. Suppressing effects of daily oral supplementation of beta-glucan extracted from Agaricus blazei Murill on spontaneous peritoneal disseminated metastasis in mouse model // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2005. V. 131. N8. P. 527-538.
5. Inoue A., Kodama N., Nanba H. Effect of maitake (Grifola frondosa) D-fraction on the control of the T lymph node Th-1/Th-2 proportion // Biol. Pharm. Bull. 2002. V. 25. N4. P. 536-540.
6. Harada T., Masuda S., Arii M., at all. Soy isoflavone aglycone modulates a hematopoietic response in combination with soluble beta-glucan: SCG // Biol. Pharm. Bull. 2005. V. 28. N12. P. 2342-2345.
7. Futami H. Flavone acetic acid directly induces expression of cytokine genes in mouse splenic leukocytes but not in human peripheral blood leukocytes // Cancer. Res. 1991. V. 51. P. 6596—6602.
8. Капля О.А., Шерстобоев Е.Ю., Зуева Е.П. и др. Влияние экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном на состояние системы естественной цитотоксичности у мышей с карциномой легких Льюис // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2004. Т. 137. №5. С. 538—541.
Summary
Aqueous extract of Phallus impudicus per os raises survival rate and reduces expressiveness of symptoms of radiation sickness induced a single external 7Gr dose irradiation in mice. 14 days treatment of Flamullina velutipes or Auricularia auricularia aqueous extract decreases quantity of induced uretan adenomas/mouse and mice with uretan adenomas in mice lungs. Extract of Ph. impudicus was shown to result tendency to tumor growth inhibition and increase of cyclophosphan cytostatic therapy efficacy for mice with Ehrlich adenocarcinoma.
