CC BY
35
УДК 612.351.11:577.152.274 doi: 10.25298/2221-8785-2017-15-4-442-446
выделение и радиометрический метод определения активности атр: тиаминдифосфатфосфотрансферазы из митохондрий
головного мозга свиньи
Черникевич И. П. ([email protected]), Хильманович Е. Н, Кравец Е. В.
УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь
Введение. Назначение и биологические пути регуляции уровня трифосфорного эфира тиамина в клетке остаются невыясненными. Связано это с отсутствием надёжной методологической основы оценки активности фермента биосинтеза метаболита - АТР: тиаминдифосфатфосфотрансферазы (КФ 2.7.4.15).
Цель. Разработать адекватный способ разделения ингредиентов трансферазной реакции, выделить частично очищенный препарат фермента.
Материал и методы. В качестве субстрата использовался экзогенный, полученный нами, 14С - тиаминди-фосфат. Образовавшийся продукт - трифосфорный эфир тиамина - отделяли ионообменной хроматографией.
Результаты. Из митохондриальной фракции головного мозга свиньи выделен частично очищенный препарат трансферазы с выходом 14,2%. Установлено, что максимальная ферментативная активность проявляется при pH 7,0-8,5, концентрациях тиаминдифосфата 2,5 - 3,010-5 М.
Выводы. Предложенный изотопный метод обладает достаточной чувствительностью и позволяет фиксировать АТР: тиаминдифосфатфосфо-трансферазную активность в субклеточных фракциях мозга.
Ключевые слова: АТР: тиаминдифосфатфосфотрансфераза, мозг свиньи, радиометрический метод, свойства фермента.
Введение
Наряду с тиаминдифосфатом - коферментом мультиферментных комплексов окислительного декарбоксилирования альфа-кетокислот и тран-скетолазы - в объектах живой природы присутствует другая фофорилированная форма витамина В1 - тиаминтрифосфат, функция которого в жизнедеятельности клетки неизвестна[1]. На протяжении 30 лет возможная биологическая роль трифосфорного эфира рассматривается исключительно в контексте представлений о специфической некоферментной функции В1 в возбудимых тканях, связанной с распространением и передачей нервного импульса [2-4]. Несмотря на то, что надёжных доказательств этой гипотезы так и не получено, на важную роль трифосфорного эфира тиамина для работы нервной системы указывает хотя бы тот факт, что в митохондриальной фракции головного мозга крыс [5], быка [6], спинном мозге свиней [7], ци-тозоле печени крыс [8], пивных дрожжах [9] был обнаружен фермент АТР: тиаминдифосфатфосфотрансфераза, катализирующий превращение коферментной формы тиамина до трифосфор-ного эфира. Несколько позже из головного мозга крыс выделен и белок обратного процесса -расщепления тиаминтрифосфата, с абсолютной специфичностью к субстрату [1, 10, 11]. Вместе с тем к началу 1990-х методами ВЭЖХ было достоверно установлено наличие трифосфорного эфира тиамина не только в мозге и других тканях млекопитающих, но и в бактериях [12, 13]. Это обстоятельство, предполагающее общность роли трифосфорного эфира тиамина в клетках разной специализации, диктует необходимость создания принципиально иной концептуальной основы, которая могла бы послужить прочным базисом для прогресса исследований в области некоферментных функций витамина В раз-
работки и применения новых лекарственных средств. К числу первостепенных задач, требующих решения в свете идеи о фундаментальной роли трифосфата в биологии клетки, относятся вопросы распространения трифосфорного эфира, связанной и/или растворимой АТР: тиамин-дифосфатфосфотрансферазы в объектах разных уровней организации, специфичности, структурно-функциональных и регуляторных свойств фермента синтеза эфира тиамина, механизмов контроля внутриклеточного уровня трифосфата и их совершенствования в ходе эволюционного процесса. Выполнимость подобных изысканий возможна при хорошей методологической базе.
Попытки выделения и очистки АТР: тиаминдифосфатфосфотрансферазы пока безуспешны. Одной из причин этого является отсутствие высокочувствительного метода детекции активности фермента. Предложенный ранее [8] изотопный способ с использованием [32Р] АТР имеет ряд существенных недостатков, поскольку это соединение - короткоживущий изотоп и, кроме того, практически очень трудно отделить [32Р] АТР от [32Р] тиаминтрифосфата методами электрофореза, хроматографией на бумаге и на колонках с катионообменниками. Недостаточно чёткое разделение этих ингредиентов искажает получаемые результаты. Более того, субстратом ферментативной реакции считался только комплекс тиаминдифосфата с каким-либо белком-носителем, из-за чего очистка этого фермента известными в энзимологии методами рассматривалась как процесс невозможный [5, 8].
Целью исследования является разработка радиометрического метода определения активности трансферазы. В настоящей работе представлен адекватный метод определения активности трансферазы и приводятся данные по ее выделению, частичной очистке и некоторым свойствам.
Материал и методы Для получения фермента использовали митохондрии. Около 10 г свежей ткани головного мозга свиньи промывали охлажденной (около 0°С) средой выделения (0,32 М сахароза; 0,15 мМ КС1; 0,2 мМ ЭДТА; 0,01 М трис-НС1 буфер рН 7,4), измельчали, вносили 60 мл исходной среды и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Смесь центрифугировали 3 минуты при 2000 g, а полученную надосадочную жидкость повторно центрифугировали 8 минут при 12500 g. Грубую митохондриальную фракцию ресуспендировали в 10 мл 3% фиколла (3% фиколл; 0,12 М манно-за; 0,03 М сахароза; 25 мкМ КС1; 0,2 мМ ЭДТА; 0,01 М трис-HCl буфер рН 7,4), после чего осторожно наслаивали на 20 мл раствора 6% фикол-ла (6% фиколл; 0,24 М манноза; 0,06 М сахароза; 50 мкМ КС1; 0,2 мМ ЭДТА; 0,02 М трис-НС1 буфер рН 7,4) с последующим центрифугированием 30 минут при 12500 g. Супернатант декантировали, удаляя одновременно мелкий «пух», лежащий на митохондриях. Митохондриальную фракцию повторно ресуспендировали в среде выделения и центрифугировали 10 минут при 12500 g. Перед определением активности АТР: тиаминдифосфатфосфотрансферазы осадок ор-ганелл разбавляли 4 мл Н2О, содержащей тритон Х-100 в конечной концентрации 1%, с двухразовым замораживанием-оттаиванием раствора.
Для контроля чистоты и целостности структур митохондрий полученные при центрифугировании осадки фиксировали 1% четырёхоки-сью осмия на буфере Миллонига и заливали в аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, анализируя органеллы под электронным микроскопом ЭМВ 100ЛМ (Россия).
Активность фермента определяли по количеству образовавшегося трифосфорного эфира тиамина. На начальных этапах выделения и очистки использовали радиометрический метод детекции скорости с применением [14С] тиамин-дифосфата в качестве одного из субстратов. Меченый [14С] тиаминдифосфат получали из [14С] тиамина по схеме: [14С] тиамин + АТР ^ [14С] тиаминдифосфат + АМР в присутствии дрожжевой тиаминкиназы [9]. АТР: тиаминдифос-фатфосфотрансферазную реакцию проводили в стандартных условиях в течение 1 часа при 37° С. Инкубационная смесь в 1 мл содержала (в М): фосфатный буфер рН 7,5 - 5 10-2; АТР -5 10-3; сульфат магния - 210-2; [14С] тиаминдифосфат -5 10-6(15 мкКи/мкмоль) и 0,3 мл су-пернатанта мозга (3-5 мг белка) или 0,5-2,0 мг белка (в зависимости от степени очистки). В качестве контроля использовали те же компоненты и денатурированный кипячением белок. Реакцию останавливали добавлением 0,2 мл 10% ТХУ. После центрифугирования кислоту удаляли двойной экстракцией тремя объёмами эфира. Остаток эфира упаривали и продукты реакции разделяли на колонке с катионообменным сефадексом SP-C-25 (1^20 см), уравновешенной 0,005 М ацетатным буфером рН 4,0. Элюцию
проводили исходным буфером, собирая фракции на коллекторе по 2 мл. Для определения количества трифосфорного эфира тиамина отбирали аликвоты по 0,2 мл и помещали в 6 мл диокса-нового сцинциллятора. Радиоактивность измеряли на сцинцилляционном счетчике «Магк-2» (США) в течение 1 минуты. Концентрацию [14С] тиаминтрифосфата находили, исходя из известной удельной радиоактивности [14С] тиамина.
При работе с более очищенным белком применяли тиохромный метод определения активности. Условия проведения реакции, концентрации всех ингредиентов и разделение продуктов были такими, как описано выше, за исключением концентрации тиаминдифосфата, равнявшейся 5 10-4 М. После хроматографии тиаминтри-фосфат переводили в тиохромтрифосфат с помощью феррицианида калия в щелочной среде аналогично тиамину. Величину флуоресценции замеряли в этиловом спирте на флюориметре ЭФ-3-МА. Калибровочную кривую строили с известным количеством хроматографически чистого трифосфорного эфира.
За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое в условиях определения за 1 час синтезирует 1 нмоль тиамин-трифосфата. Удельную активность выражали числом единиц фермента на 1 мг белка. Белок определяли по методу Лоури и спектрофотоме-трически по Варбургу и Кристиану.
Выделение фермента проводили на холоду. Митохондрии предварительно разрушали двукратным замораживанием-размораживанием в среде с 1% тритоном Х-100, разбавляли в 2 раза 0,32 М раствором сахарозы, центрифугировали в течение 1,5 часа при 105000 g на ультрацентрифуге УАС-601 (Германия), осадок отбрасывали, а супернатант использовали в качестве ферментного препарата.
На этапах очистки супернатант сначала подвергали дробному фракционированию сульфатом аммония в пределах 45-55, 55-65 и 65-75% насыщения. Высоленный белок центрифугировали 10 минут при 18000 об/мин; осадки в виде аммонийной пасты хранили при -10°С. Для определения ферментативной активности и последующей очистки пасту в дальнейшем обессоливали на колонке с сефадексом G-50 (1,5x60 см), уравновешенной 0,01 М трис-НС1 буфером рН 7,5 содержащим 0,05 М №0. Обессоленный белковый препарат наносили на колонку (2x20 см), заполненную анионообменным носителем - сефадексом ДЭАЭ А-50, уравновешенным приведенным выше трис-НС1 буфером рН 7,5 с 0,05 М №С1 и 0,002 М дитиотрейтолом. После адсорбции белка колонку промывали тем же раствором до минимального поглощения при D280. Белок снимали линейным градиентом №С1 от 0,05 до 0,5 М со скоростью тока жидкости 15 мл/ч. Активные фракции использовали для изучения свойств фермента.
Результаты и обсуждение Примененный нами метод радиометрического определения трифосфорного эфира тиамина
позволил показать наличие активности АТР: тиаминдифосфатфосфотрансферазы в митохон-дриальной фракции головного мозга свиньи и возможность синтеза тиаминтрифосфата из экзогенного (не связанного с белком) тиаминди-фосфата (рис. 1).
Результаты очистки приведены в таблице. Активность фермента в супернатанте низка и не превышает 0,021 нмоль на 1 мг белка за 1 ч. Более высокую активность трансферазы, полученную ранее [8], очевидно, можно объяснить методическими недочетами авторов. Основное количество фермента высаливается в пределах 50-70% насыщения сульфатом аммония, а при 55-65% насыщении удельная активность достигает 0,083 ммоль тиаминтрифосфата, превышая исходную в 4 раза.
Рисунок 1. - Профиль элюции тиаминтри- и дифосфа-та на колонке с сефадексом SP-C-25. Источник фермента - супернатант митохондрий головного мозга
1 - тиаминтрифосфат;
2 - тиаминдифосфат
Рисунок 2. - Очистка АТР: тиаминдифосфатфос-фотрансферазы на сефадексе ДЭАЭ А-50
1 - кривая выхода белка (D280);
2 - удельная активность фермента (УА)
После хроматографии на ДЭАЭ А-50 степень очистки возросла в 80-85 раз, относительно су-пернатанта, с выходом около 14%. Линейный градиент в пределах 0,05-0,5 М NaCl позволил получить активность АТР: тиаминдифосфатфос-фотрансферазы, равную 1,7 нмоль тиаминтри-фосфата (рис. 2), что дало возможность изучить отдельные свойства фермента.
Таблица. - Очистка АТР: тиаминдифосфатфос-фотрансферазы из митохондрий головного мозга свиньи
Этап очистки Объём, мл Белок, мг/мл Удельная активность, ед. на 1мг белка Общая активность, ед. Выход, % Степень очистки
Супернатант 360 7 0,021 52,9 100 -
Фракционирование сульфатом аммония с гель-фильтрацией на G-50 16 12 0,083 15,4 29 4
Хроматография на сефадексе ДЭАЭ А-50 4 1,1 1,7 7,5 14,2 85
Наработка тиаминтрифосфата прямо пропорциональна количеству белка в пробе, вплоть до 2,0 мг, а пропорциональность во времени соблюдается первые 2 ч. Полученные результаты указывают на правомерность проведения реакции в описанных выше условиях и одновременно на недостаточную степень чистоты и устойчивость препарата. АТР: тиаминдифосфатфосфотранс-фераза сохраняет активность при 0-4°С всего несколько дней, при комнатной температуре инак-тивируется в течение суток.
Изучение зависимости скорости реакции от рН с разными буферными системами показало наличие двух оптимумов: в кислой (рН 5,0-6,5) и щелочной (рН 7,0-8,5) среде (рис. 3), причём щелочной оптимум более выражен. Ранее в этой области проводились лишь единичные определения активности АТР: тиаминдифосфатфос-фотрансферазы [8]. Очевидно, можно считать обоснованным проведение реакции синтеза три-фосфорного эфира тиамина в пределах рН 7,58,0, что приближает условия оценки активности к оптимальным. Однако не исключено, что данная картина является следствием дополнительного наложения эффекта тиаминтрифосфатазы, обнаруженной нами в ферментном препарате и проявляющей значительную активность при рН, близкой к 7,0 (от 0,24 мкмоль тиаминтрифосфа-та на 1 мг белка за 30 мин. при рН 6,0) и не отражает действительного положения.
Зависимость скорости реакции от концентрации тиаминдифосфата описывается S-образной кривой с выходом на плато при концентрации 2,5 10-5 М (рис. 4). Полученные данные указывают на то, что оптимальные значения субстрата-акцептора при оценке активности фермента лежат в пределах 2,5-3 10-5 М.
УА
1,8
0,4
0 -I-1-1-1-1-1-1-
3456789 рН
Рисунок 3.- Зависимость активности АТР: тиаминдифосфатфосфотрансферазы от рН
1 - ацетатный;
2 - фосфатный;
3 - трис-НС1 буферные растворы
Недостаточная степень очистки препарата и быстрая инактивация АТР: тиаминдифосфатфосфотрансферазы при хранении затрудняют проведение тщательного изучения кинетических параметров фермента, исследование механизма его действия и особенно пространственной организации и динамики каталитического и ре-гуляторного центров. Выполнение такого рода изысканий возможно при наличии гомогенного препарата.
Литература
1. Макарчиков, А. Ф. Тиаминтрифосфат: новый взгляд на некоферментную функцию витамина В1 / А. Ф. Макарчиков. - Минск : Белорусская наука, 2008. - 443 с.
2. Пархоменко, Ю. М. Нейроактивность тиамина: факты и гипотезы / Ю. М. Пархоменко, Г. В. Донченко, З. С. Протасова // Украинский биохимический журнал. - 1996. - Т. 68, № 2. - С. 3-14.
3. Bettendorff, L. Thiamine derivatives in excitable tissues: metabolism, deficiency and neurodegenerative diseases / L. Bettendorff, P. Wins // Recent Res. Devel. Neurochem.
- 1999. - Vol. 2, part 1. - P. 37-62.
4. Itokawa, Y. Thiamine and nervous system function: an historical sketch / Y. Itokawa // Metab. Brain. Dis. - 1996.
- Vol. 11, № 1. - P. 1-7.
5. Itokawa, Y. The enzymatic synthesis of triphosphothiamin / Y. Itokawa, J. R. Cooper // Biochim. Biophys. Acta. -1968. - Vol. 158, № 1. - P.180-182.
6. Murphy, J. V. Leigh's disease: biochemical characteristics of the inhibitor / J. V. Murphy, L. J. Craig, R. H. Glew // Arch. Neurol. - 1974. - Vol. 31, № 4. - P. 220-227. - doi: 10.1001/archneur.1974.00490400034002.
7. Eckert, T. Über eine ATP: Thiamindiphosphat-Phosphotransferasa-Aktivität im Nervengewebe Ein Beitrag zum Mechanismus der nervösen Reizleitung / T. Eckert, W. Möbus // Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem.
- 1964. - Vol. 338, № 1-2. - P. 286-288. - doi: 10.1515/ bchm2.1964.338.1-2.286.
Рисунок 4. - Зависимость скорости АТР: тиаминди-фосфатфосфотрансферазной реакции от концентрации тиаминдифосфата
Выводы
1. Предложен радиометрический метод определения активности АТР: тиаминдифосфатфос-фотрансферазы, ответственной за синтез неко-ферментной формы витамина В
2. На заключительном этапе степень очистки возросла в 85 раз и достигла 1,7 единиц на 1 мг белка.
3. Показано, что свободный, не связанный с гипотетическим белком тиаминдифосфат, может использоваться как субстрат данной реакции.
4. Выяснено, что максимальная скорость биосинтеза трифосфорного эфира тиамина наблюдается при рН 7,0-8,5 и концентрации субстрата 2,5-10"5 М.
8. Ruenwongsa, P. The role ofbound thiamine pyrophosphate in the synthesis of thiamine triphosphate in rat liver / P. Ruenwongsa, J. R. Cooper // Biochym. Biophys. Acta.
- 1977. - Vol. 482, № 1. - P. 64-74.
9. Voskoboyev, A. I. Studies on thiamine diphosphate kinase (EC 2.7.4.15) from brewer's yeast: purification and some properties / A. I. Voskoboyev, I. P. Chernikevich, V. S. Luchko // Biomed. Biochim. Acta. - 1987. - Vol. 46, № 1. - P. 3-13.
10. Hashitani, Y. The partial purification of thiamine triphosphatase from rat brain / Y. Hashitani, J. R. Cooper // J. Biol. Chem. - 1972. - Vol. 247, № 7. - P. 2117-2119.
11. Makarchikov, A. F. Purification and characterization of thiamine triphosphatase from bovine brain / A. F. Makarchikov, I. P. Chernikevich // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol. 1117, № 3. - P. 326-332. -doi: 10.1016/0304-4165(92)90032-P.
12. Content of thiamin phosphate esters in mammalian tissues
- an extremely high concentration of thiamin triphosphate in pig skeletal muscle / Y. Egi [et al.] // Biochem. Int. -1986. - Vol. 12, № 3. - P. 385-390.
13. Nishimune, T. Hydrolysis and synthesis of thiamine triphosphate in bacteria / T. Nishimune, R. Hayashi // J. Nutr. Sci. Vitaminol. - 1987. - Vol. 33, № 2. -P. 113-127.
References
1. Makarchikov AF. Tiamintrifosfat: novyj vzgljad na neko-fermentnuju funkciju vitamina B1 [Thiaminetriphosphate:
a new view on uncoenzyme function of vitamin B1]. Minsk: Belorusskaja nauka; 2008. 443 p. (Russian).
2. Parhomenko YuM, Donchenko GV, Protasova ZS. Nejroaktivnost tiamina: fakty i gipotezy [Neuroactivity of Tiaminum: facts and hypothesis]. Ukrainskij biohi-micheskij zhurnal [The Ukrainian Biochemical Journal]. 1996;68(2):3-14. (Russian).
3. Bettendorff L, Wins P. Thiamine derivatives in excitable tissues: metabolism, deficiency and neurodegenerative diseases. Recent Res. Devel. Neurochem. 1999;2(1):37-62.
4. Itokawa Y. Thiamine and nervous system function: an historical sketch. Metab. Brain. Dis. 1996;11(1):1-7.
5. Itokawa Y, Cooper JR. The enzymatic synthesis oftriphos-phothiamin. Biochim. Biophys. Acta. 1968;158(1):180-182.
6. Murphy JV, Craig LJ, Glew RH. Leigh's disease: biochemical characteristics of the inhibitor. Arch. Neurol. 1974;31(4):220-227. doi: 10.1001/arch-neur.1974.00490400034002.
7. Eckert T, Möbus W. Über eine ATP: Thiamindiphosphat-Phosphotransferasa-Aktivität im Nervengewebe Ein Beitrag zum Mechanismus der nervösen Reizleitung.
Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1964;338(1-2):286-288. doi: 10.1515/bchm2.1964.338.1-2.286. (German).
8. Ruenwongsa P, Cooper JR. The role of bound thiamine pyrophosphate in the synthesis of thiamine triphosphate in rat liver. Biochym. Biophys. Acta. 1977;482(1):64-74.
9. Voskoboyev AI, Chernikevich IP, Luchko VS. Studies on thiamine diphosphate kinase (EC 2.7.4.15) from brewer's yeast: purification and some properties. Biomed. Biochim. Acta. 1987;46(1):3-13.
10. Hashitani Y, Cooper JR. The partial purification of thiamine triphosphatase from rat brain. J. Biol. Chem. 1972;247(7):2117-2119.
11. Makarchikov AF, Chernikevich IP. Purification and characterization of thiamine triphosphatase from bovine brain. Biochim. Biophys. Acta. 1992;1117(3):1326-1332. doi: 10.1016/0304-4165(92)90032-P.
12. Egi Y, Koyama S, Shikata H, Yamada K, Kawasaki T. Content of thiamin phosphate esters in mammalian tissues - an extremely high concentration of thiamin triphosphate in pig skeletal muscle. Biochem. Int. 1986;12(3):385-390.
13. Nishimune T, Hayashi R. Hydrolysis and synthesis of thiamine triphosphate in bacteria. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1987;33(2):113-127.
selection and radiometric method of determining the activity of atp: thiaminediphosphatephosphotransferase from mitochondria of
the pigs brain tissue
Chernikevich I. P., Khilmanovich E. N, Kravec E. V.
Educational Establishment«Grodno State Medical University», Grodno, Belarus
Introduction. The purpose and biological pathways of regulation of level of thiamine triphosphate ester in the cellremain unclear. This is due to the absence of reliable methodological basis for the assessment of the activity of the enzyme of the biosynthesis of this metabolite - ATP: thiaminediphosphatephosphotransferase (EC 2.7.4.15).
Objective. To develop an adequate method of separation of ingredients of transferase reaction, to isolate a partially purified drug of the enzyme.
Material and methods. As substratewas usedan exogenous 14C- thiaminediphosphate, that was obtained by us.Thehaving beenresulted product - thiamine triphosphate ester was separated by ion-exchange chromatography.
Results. From the mitochondrial fraction of the pig's brain was isolated a partially purified transferase preparation with a yield of 14.2%. It was found that the maximum enzymatic activity is manifested at pH 7.0 - 8.5, the concentrations of thiamine diphosphate is 2.5 - 3.010-5 M.
Conclusions. The proposed isotope method has sufficient sensitivity and allows fixing ATP: thiamine diphosphate phosphotransferase activity in subcellular fractions of the brain.
Keywords: ATP: thiaminediphosphatephosphotransferase, pig's brain, radiometric method, properties of enzyme.
Поступила: 29.06.2017 Отрецензирована: 14.07.2017
