CC BY
56
УДК 547.458:577114:615.276
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕКТИНОВЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ ПЛОДОВ КАЛИНЫ САРЖЕНТА Viburnum sargentii KOEHNE
Т.В. ЧЕРНЯК*, В.В. ГОЛОВЧЕНКО**
Дальневосточный государственный медицинский университет Мин-здравсоцразвития РФ, г. Хабаровск
**Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, г.Сыктывкар ctaua@uandex.ru
Из плодов калины Саржента были выделены полисахаридные фракции, содержащие пектиновые полисахариды со значительными областями линейного 1,4-а^-галактуронана. Установлено, что полученные фракции гете-рогенны по составу и представляют собой смесь полимергомологов, различающихся количеством остатков галактуроновой кислоты. Показано, что в состав всех фракций входит белок, часть которого, вероятно, связана с углеводной составляющей.
Ключевые слова: калина Саржента, пектиновые полисахариды, галакту-ронан, арабиногалактаны
T.V. CHERNYAK, V.V. GOLOVCHENKO. ISOLATION AND CHEMICAL CHARACTERIZATION OF PECTIC POLYSACCHARIDES FROM THE FRUITS OF VIBURNUM SARGENTII KOEHNE
The polysaccharide fractions were successively extracted with water, aqueous solutions of hydrochloric acid (pH 4.0) and 0.5% aqueous of ammonium oxalate from Viburnum sargentii fruits. All polysaccharide fractions included the pectic polysaccharides with significant regions of 1,4-a-D-galacturonan. The composition of polysaccharide fractions was heterogeneous. The pectic polysaccharides from V. sargentii were shown to be a mixture of polymer homologues, which differed in the content of the galacturonic acid residues. The fractions were found to contain protein. Protein was supposed to be partly linked to the sugar chains of the carbohydrate macromolecules.
Key words: Viburnum sargentii, pectic polysaccharides, galacturonan, arabino-galactan
Введение
Целлюлоза, гемицеллюлозы и пектиновые полисахариды являются главными компонентами растительной клеточной стенки. Пектиновые полисахариды совместно с гемицеллюлозами образуют матрицу, в которую встроены микрофибриллы целлюлозы. Взаимодействие между полисахаридами обеспечивает не только устойчивые, но и динамичные и гибкие свойства клеточной стенки [1, 2]. Среди полисахаридов клеточных стенок высших растений пектиновые полисахариды являются наиболее сложными и интересными с точки зрения структурной организации и функциональной активности. Они выполняют различные биологические функции в растениях [2] и обладают разноплановой физиологической активностью [3]. Расширение знаний о различии пектиновых полисахаридов растений разных видов и о влиянии условий их произрастания необходимо для понимания функций и роли этих биополимеров в растительной клетке.
В данной работе проведено сравнение пектиновых полисахаридов, выделенных из плодов калины Саржента Viburnum sargentii Koehne (сем. Caprifoliaceae), произрастающей в умеренном муссонном климате Дальнего Востока, и ранее выделенных и охарактеризованных пектиновых полисахаридов плодов калины обыкновенной Viburnum opulus L., произрастающей в континентальном климате Башкортостана [4]. Проведенные сравнительные исследования плодов дальневосточного и европейского видов калины показали сходство качественного и количественного содержания флавоноидов, антоцианов, катехинов, органических, амино- и жирных кислот [5]. Вместе с тем выявлено различие в количественном содержании оксикоричных кислот [5].
Материалы и методы
Растительный материал. Плоды калины Саржента были собраны в сентябре 2011 г. на территории Амурской области в окрестностях г. Бело-горска. После предварительного подвяливания вы-
сушены с применением инфракрасной сушки и измельчены до частиц размером 3 мм.
Общие аналитические методы. Определение количественного содержания белка проведено методом Лоури [6], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА). Общее содержание гликуроновых кислот уточняли спектрофотометрическим методом по реакции с 3,5-диме-тилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты [7]. Для построения калибровочной кривой использовали галактуроновую кислоту. Определение степени метилэтерификации проводили по методу, описанному ранее [8], используя метиловый спирт в качестве стандарта. Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech, England).
Для определения количественного содержания нейтральных моносахаридов в гидролизатах использован метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе Varian 450-GC (США) с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке VF-5 ms (Varian, США; 0.25 мм, 30 м), газ-носитель - гелий. Температурный режим: от 175°C (1 мин) до 250°C (2 мин) со скоростью 3°С/мин.
Для распределительной нисходящей бумажной хроматографии (БХ) использовали систему растворителей н-бутанол : пиридин : вода (6:4:3) бумага Filtrak FN №3 (Германия). Идентификацию моносахаридов проводили с помощью раствора кислого анилинфталата при температуре 105°С. Для сравнения применялся стандарт, содержащий галактуроновую кислоту. Все растворы упаривали на ротационном испарителе марки Laborota 4002 (Heidolph, Germany) при пониженном давлении и температуре 40-45°С. Для лиофилизации водных растворов использовали лиофильную сушку марки VirTis (США).
Выделение вибурнанов. Сырье (700 г) предварительно обрабатывали хлороформом в аппарате Сокслета, сушили, заливали водой (4 л). Экстракцию проводили при 80°С в течение 5 ч. Остаток сырья отделяли центрифугированием. Экстракт концентрировали, диализовали против дистиллированной воды при 10°С в течение трех суток. Полученный диализат центрифугировали, концентрировали до 100 мл и при перемешивании выливали в 95%-ный этиловый спирт (300 мл). Осаждение полисахаридов проводили при 10°С в течение 3 ч. Полисахариды отделяли центрифугированием, осадок растворяли в дистиллированной воде (70 мл) и лиофилизовали. В результате получили фракцию VS1 с выходом 1.55%.
Остаток сырья заливали дистиллированной водой и подкисляли соляной кислотой до рН 4.0. Экстракцию проводили при 50°С в течение 5 ч. Экстракт обрабатывали, как описано выше. В результате получили фракцию VS2 с выходом 0.38%.
Остаток сырья заливали 0.5%-ным водным раствором оксалата аммония. Экстракцию проводили при 70°С в течение 5 ч. Экстракт обрабатывали по вышеописанной методике. В результате получили фракцию VS3 с выходом 0.40%.
Определение гомогенности вибурнанов. Для определения гомогенности выделенных полисахаридных фракций использовали метод ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе (СГфор-ма). Навеску полисахарида (80 мг) растворяли в дистиллированной воде (5 мл), наносили на колонку (40^2.7 см), элюирование проводили в изократи-ческом режиме водными растворами натрия хлорида возрастающей концентрации (0.01, 0.2, 0.3, 1.0 М). Разделение выполняли при скорости элюен-та 48 мл/час, отбирая фракции по 12 мл. Выход полисахаридных фракций контролировали по реакции элюата на углеводы по методу Смита [8]. Фракции, содержащие полисахариды, объединяли, концентрировали, диализовали и лиофилизовали. При разделении фракции VS1 получили полисахариды VS1-1, VS1-2, VS1-3, VS1-4; фракции VS2 - VS2-1 и VS2-2; фракции VS3 - VS3-1, VS3-2.
При определении средневесовой и среднечисловой молекулярной массы образцов использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя хроматографическую систему (Shimadzu, Япония): насос LC-20AD, дегазатор DGU-20A3, рефрактометр RID-10A, термостат СТО-20А, колонку Shodex oHpak SB-804 HQ (8.0 мм x 30 см), предколонку Shodex GS-26 7В (7.6 мм x 5 см). Элюирование проводили 0.15 М NaCl (40°С, 0.3 мл/мин).
Полный кислотный гидролиз. Навеску полисахарида (2.5; 5 мг) нагревали 5 ч при 100°С с 2 М трифторуксусной кислотой (TFA) (1 мл), содержащей мио-инозит (0.5 и 1 мг/мл соответственно) в качестве внутреннего стандарта. Кислоту удаляли многократным упариванием с метанолом. Моносахариды восстанавливали и ацетилировали, после чего их идентифицировали методом ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов.
Ферментативный гидролиз. Навеску полисахарида (20 мг) растворяли в воде (20 мл), добавляли 1,4-а^-полигалактуроназу (Sigma, USA) (5 мг), предварительно растворенную в 0.05 мл дист. воды. Смесь оставляли на ночь при комнатной температуре (25°С). Фермент дезактивировали кипячением при 100°С и удаляли центрифугированием. Раствор концентрировали до 10 мл и выливали в 96%-ный этиловый спирт (30 мл). Осадок отделяли центрифугированием. Спиртовой супернатант концентрировали и вычисляли наличие в нем галакту-роновой кислоты с помощью БХ.
Определение содержания белка, уроновых кислот и нейтральных моносахаридов, а также степени метилэтерификации проводили в трех параллельных измерениях. При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение и среднее квадратичное отклонение. Достоверность результатов оценивали по t-критерию Стъюдента.
Результаты исследований
Из высушенных и обработанных хлороформом ягод калины Саржента последовательной экстракцией выделены фракции, содержащие растворимые пектиновые полисахариды (VS1), и пектиновые полисахариды, входящие в состав протопектинового комплекса
(VS2 и VS3). Пектиновые полисахариды составляют до 30% от сухой биомассы двудольных, голосеменных и однодольных растений [9] и входят в состав растительной клетки в двух формах - растворимой и нерастворимой (в составе протопектинового комплекса). Растворимые пектины локализованы в вакуоли и срединной пластине. Протопектиновый комплекс образует основу первичной клеточной стенки растений [10]. Выход фракции VS1 существенно выше, чем фракций VS2 и VS3 (табл. 1), что свидетельствует о превалирующем содержании в ягодах калины растворимых пектиновых полисахаридов. В онтогенезе растений происходят изменения в содержании пектинов и соотношении растворимых пектинов и протопектинов. В частности, при созревании плодов в них увеличивается количество растворимого пектина [11].
Считается, что пектиновые полисахариды имеют блочный характер строения углеводной цепи и чаще всего содержат три основных блока, в каждом из которых - остатки галактуроновой кислоты GalA в больших или меньших количествах [12]. Для подтверждения наличия 1,4-а^-галакту-ронана в составе углеводных цепей полисахаридов выделенных фракций использовали метод ферментативного гидролиза 1,4-а^-галактопиранозилуро-назой, избирательно гидролизующей 1,4-связи между остатками а^-галактуроновой кислоты. Установлено, что ферментативный гидролиз приводит к значительной деструкции углеводных цепей полисахаридов, входящих в состав всех выделенных фракций (около 50%), которая сопровождается образованием свободной галактуроновой кислоты. Это доказывает принадлежность углеводной части
Таблица 1
Характеристика пектиновых фракций плодов калины Саржента
Фракция Выход, %* СМ**, % Содержание, %***
GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc | Белок
VS1 1.6 22.2±1.4 53.1±1.5 5.9±0.7 4.5±0.З 1.1 ±0.3 2.4±0.5 0.З±0.08 1.0±0.09 41.8±2.1
VS2 0.4 28.9±0.9 56.9±1.4 5.7±0.7 5.8±0.5 1.5±0.З З.1±0.З 0.2±0.05 0.9±0.05 З2.5±1.3
VS3 0.4 25.5±0.8 7З.9±1.6 4.0±0.З 2.8±0.З 1.0±0.2 З.7±0.З 0.5±0.05 0.5±0.05 18.5±1.1
Примечание. * - от массы воздушно-сухого растительного материала; ** - степень метилэтерификации, показывает процент метилэтерифицированных остатков галактуроновой кислоты; *** - весовые проценты.
Выделенные полисахаридные фракции были охарактеризованы по моносахаридному составу, гомогенности и содержанию белка. Определение моносахаридного состава полисахаридов, входящих в состав выделенных фракций, проводили спектрофотометрическим методом и методом ГЖX. Установлено, что из ягод калины Саржента экстрагируются кислые полисахариды, с типичным для пектинов моносахаридным составом, но различаются соотношением остатков галактуроновой кислоты и нейтральных моносахаридов (табл. 1). Спектрофотометрическим методом показано, что главным компонентом углеводной части всех выделенных фракций являются остатки галактуроновой кислоты (табл. 1). Методом ГЖX после полного кислотного гидролиза фракций 2 М TFA и последующего получения ацетатов полиолов установлено, что доминирующими нейтральными моносахаридами всех фракций являются арабиноза (Ara), галактоза (Gal) и ксилоза (Xyl). Сравнение данных по t-критерию Стьюдента доказывает достоверность этого утверждения. В качестве минорных компонентов в составе углеводных цепей пектинов идентифицированы остатки рамнозы (Rha), маннозы (Man), глюкозы (Glc), общее содержание которых составляет менее 3%. Ранее показано, что при последовательной экстракции из ягод калины обыкновенной V. Opulus, наряду с пектиновыми полисахаридами, экстрагируются галактоманнаны, содержание которых составляет 0.1% от массы сухого растительного материала [4].
выделенных фракций к классу пектиновых полисахаридов. Установлено, что часть остатков галактуроновой кислоты, входящих в область галактурона-на, метилэтерифицирована (табл. 1).
Ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе (СГ-форма) показано, что все полученные фракции гетерогенны по составу (табл. 2). Фракция VS1 включает четыре пектиновых полисахарида VS1-1, VS1-2, VS1-3 и VS1-4, которые элюируются 0.01, 0.2, 0.3 и 1.0 М растворами №С1 соответственно. Полученные пектины представляют собой полимергомологи и различаются содержанием остатков галактуроновой кислоты. Фракция VS1-1, элюирующаяся 0.01 М раствором №С1, отличается повышенным содержанием остатков ара-бинозы и галактозы. Фракции VS2 и VS3 включают по два пектиновых полисахарида, характеризующихся высоким содержанием галактуроновой кислоты (табл. 2). Во всех фракциях, полученных ионообменной хроматографией, за исключением VS2-2, содержится белок, что может указывать на наличие ковалентной связи между углеводной и белковой составляющими.
При сравнении полученных результатов исследования полисахаридов, выделенных из ягод калины дальневосточного вида V. sargentii и данных по исследованию полисахаридов, выделенных ранее из ягод калины европейского вида V. opulus [4], установлено, что, экстрагируемые водой фракции включают пектиновые полисахариды со сходным моносахаридным составом, в то время как фрак-
Таблица 2
Характеристика пектиновых полисахаридов, полученных ионообменной хроматографией
на DEAE-целлюлозе
Фракция СиаСІ, М Выход, %* Содержание, %**
ваІА Ага ваі Rha Хуі Мап віс Белок
VS1 VS1-1 0.01 21.7 28.1 ±1.1 12.1 ±0.6 12.1 ±0.6 2.4±0.3 1.9±0.2 0.5±0.06 1.4±0.2 25.6±1.6
VS1-2 0.2 7.4 56.0±1.8 2.2±0.1 3.2±0.2 1.1±0.1 2.8±0.3 0.1±0.05 0.8±0.1 17.1 ±0.8
VS1-3 0.3 12.0 63.6±2.4 1.1±0.06 1. 1 ±0.15 0.7±0.08 0.5±0,1 0.2±0.05 1.0±0.1 3.1±0.1
VS1-4 1.0 3.7 77.6±2.3 2.6±0.1 1.7±0.2 0.6±0.08 0.6±0.1 0.2±0.05 0.6±0.08 10.6±1.2
VS2 VS2-1 0.2 21.5 77.0±2.3 5.2±0.2 4.7±0.3 1.3±0.15 5.8±0.5 0.2±0.05 0.7±0.08 3.1±0.1
VS2-2 0.3 27.9 87.5±2.8 1.4±0.09 1.7±0.15 0.6±0.07 2.7±0.3 0.1±0.05 0.4±0.05 0
VS3 VS3-1 0.1 13.4 62.5±2.1 3.8±0.2 3.9±0.2 0.5±0.05 2.0±0.3 0.2±0.05 0.8±0.09 8.1±0.8
VS3-2 0.2 39.5 73.0±2.3 1.9±0.1 1.9±0.6 0.7±0.05 2.6±0.3 0.3±0.05 0.6±0.08 4.7±0.2
Примечание. * - от массы, нанесенной на колонку навески;
весовые проценты.
ции, полученные экстракцией водным раствором соляной кислоты и оксалата аммония, существенно различаются. В состав фракций, выделенных из плодов калины обыкновенной, входят галактоман-наны [4], в то время как фракции, выделенные из плодов калины Саржента, содержат исключительно пектиновые полисахариды. Установленные различия в полисахаридном составе ягод калины могут быть связаны с видовой принадлежностью растений, условиями их произрастания, и с периодом вегетации и фазой роста калины. Выявление факторов, влияющих на содержание полисахаридов, требует дальнейшего исследования.
В составе всех выделенных фракций - значительное количество белка (до 21%). Присутствие белка во фракциях закономерно, поскольку белки входят в состав клеточной стенки растений наряду с полисахаридами и ароматическими соединениями [10]. Хотя ранее наличие белков в растительной клеточной стенке подвергалось сомнению [13]. К настоящему времени установлено, что белки входят в состав клеточной стенки и как структурные компоненты, и как ферменты [14]. Белки могут быть связаны с пектинами через боковые цепи RG-I посредством связей, образованных через остатки галактозы и арабинозы [15]. Такие сшивки обеспечивают клеточной стенке дополнительную структурную и функциональную прочность.
Для определения средневесовой (Мп) и среднечисловой (Mw) молекулярной массы использовали метод ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в табл. 3. Установлено, что все фракции характеризуются высокой степенью полидисперсности (Mw/Mn). Индекс полидисперсности фракции VS1 составил 43, VS2 - 21, VS3 - 23. На выходных кривых всех фракций наблюдается несколько пиков, характеризующихся различными молекулярными массами, что свидетельствует о гетерогенности выделенных фракций. Несмотря на то, что полученные полисахариды имеют низкую степень метилэтерификации остатков галактуроно-
Таблица 3
Результаты ВЭЖХ анализа полисахаридных фракций
№ пика Площадь пика, % Мп, кДа Mw, кДа Mw/Mn
УБ1 (индекс полидисперсности - 43)
1 52.9 90.7 282.6 3.1
2 10.8 16.6 17.4 1.0
3 21.2 4.7 5.9 1.3
4 15.1 0.7 1.0 1.4
УБ2 (индекс полидисперсности - 21)
1 94.7 22.0 206.9 9.4
2 5.3 0.8 1.0 1.2
УБ3 (индекс полидисперсности - 23)
1 36.2 96.3 253.4 2.6
2 28.6 8.9 16.0 1.8
3 22.8 3.8 4.4 1.2
4 12.4 0.8 1.1 1.3
вой кислоты (табл. 1), относительно невысокая молекулярная масса входящих в состав фракций пектиновых макромолекул определяет их хорошую растворимость в воде.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлены различия полисахаридного состава ягод двух близкородственных видов калины - европейского и дальневосточного. В плодах калины Саржента и калины обыкновенной синтезируются близкие по моносахаридному составу пектиновые полисахариды. Однако в плодах дальневосточного вида не обнаружены галактоманнаны, наличие которых показано ранее в ягодах калины обыкновенной. Выявление факторов, которые определяют различия в содержании полисахаридов близкородственных видов калины, требует дальнейшего детального исследования.
** —
Литература
1. Carpita N.C., Gibeaut D.M. Structural models of primary-cell walls in flowering plants - consistency of molecular-structure with the physi-cal-properties of the walls during growth // Plant J. 1993. Vol. 3. P. 1-30.
2. Горшкова ТА Растительная клеточная стенка как динамичная система. М.: Наука, 2007. 429 с.
3. Попов С.В. Иммуномодулирующее действие
пектиновых полисахаридов: Дис. ... д-ра
биол. наук. Владивосток, 2010. 247 с.
4. Выделение и предварительное исследование строения и физиологической активности водорастворимых полисахаридов из шрота ягод калины обыкновенной Viburnum opulus/ Р.Г. Оводова, В.В. Головченко, С.В. Попов, А.С. Шашков, Ю.С. Оводов // Биоорган. химия. 2000. Т. 26. № 1. С. 61-67.
5. Виды флоры Дальнего Востока России, викарные к официальным / Т.А. Степанова, А.В. Каминская, А.И. Деркач, Н.Ф. Комисарен-ко // Растит. ресурсы. 1998. №3. С. 21-34.
6. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin-Phenol reagents // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.
7. Dubois M., Gilles KA., Hamilton J.K. et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1956. Vol. 28. Р. 350-356.
8. Wood P.Y., Siddiqui I.R. Determination of methanol and its application to measurement of pectic ester content and pectin methyl esterase activity // Analyt. Biochem. 1971. Vol. 39. P. 418-423.
9. Ridley B, O’Neill M., Mohnen D. Pectins: structure, biosynthesis, and oligogalacturo-nide-related signaling // Phytochemistry. 2001. Vol. 57. P. 929-967.
10. Caffall K. H, Mohnen D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides // Carbohyd. Res. 2009. Vol. 344. P. 1879-1900.
11. Донченко Л.В. Технология пектина и пекти-нопродуктов. М.: ДеЛи, 2000. 256 с.
12. Willatsa W.G.T, Knox J.P., Mikkelsen J.D. Pectin: new insights into an old polymer are starting to gel // Trends in Food Science & Technology. 2006. Vol. 17. P. 97-104.
13. Lamport D.T.A. The protein component of primary cell walls // Adv. Bot. Res. 1965. Vol. 2. P. 151-218.
14. Fry S.C. The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis. L.: Lohgman, 1988. 333 p.
15. McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P. Structure of plant cell walls: X. Rhamnogalactu-ronan-I, a structurally complex pectic polysaccharide in the walls of suspension-cultured sycamore cells // Plant Physiol. 1980. Vol. 66. P.1128-1134.
Статья поступила в редакцию 29.05.2012.
