CC BY
166
УДК 579.852.11:577.121:666.03
Л. В. Куис, аспирант; Р. М. Маркевич, доцент
ВЫДЕЛЕНИЕ, ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ BACILLUS MUCILAGINOSUS
The purpose of the given stage of researches consists in allocation, clearing, fractionation and studying exopolysaccharides of Bacillus mucilaginosus. Cultivation carried out on a synthetic nutrient medium. Methods of gel-chromatography, ion-exchange chromatography, definition carboxylic groups on Wilson and IR-spectrophotometry were used for analysis. Researched polysaccharide has complex composition and the big molecular weight, it contains two fractions: F1 and F2. Results of definition carboxylic groups on Wilson and IR-spectrophotometry confirm presence carboxylic groups in fraction F2.
Введение. К настоящему времени способность к деструкции силикатных минералов обнаружена у многих микроорганизмов [1]. Особый интерес с точки зрения практического использования представляют бактерии Bacillus mucilaginosus. Культуральную жидкость этих бактерий используют для обработки глин и технологических смесей на их основе с целью улучшения качественных показателей при производстве керамических изделий [2, 3]. Влияние культуральной жидкости на свойства сырья большинство исследователей связывает с деструктирующим воздействием на минералы метаболитов этих бактерий (экзополисахаридов и органических кислот).
Об участии низкомолекулярных органических кислот в разрушении силикатных материалов накоплен достаточно большой экспериментальный материал. По способности выносить кремний и алюминий из полевых шпатов эти кислоты расположены в следующем ряду: лимонная - щавелевая > салициловая > пирока-техиновая > галловая > и-оксибензойная > ванилиновая > кофейная [4].
С другой стороны, авторами [5] показано, что интенсивность выноса кремния из кварца под действием культуральной жидкости Bacillus mucilaginosus коррелирует с количеством продуцируемого бактериями экзополисахарида.
Вместе с тем выделенный из культуральной жидкости экзополисахарид сам по себе проявил незначительную самостоятельную выщелачивающую способность серицито-хлоритового сланца, причем у диализованного полисахарида эта способность была ниже, чем у образца, не подвергнутого диализу. Кроме того, на интенсивность выноса кремния в присутствии полисахарида оказывает влияние структура последнего, в частности присутствие уроновых кислот [6]. Авторы этой работы полагают, что происходит комплексное воздействие метаболитов культуральной жидкости на минералы: органические кислоты извлекают кремний и другие элементы из состава минералов и переводят их в растворимое состояние. Роль полисахаридов заключается в способности сорбировать органические кислоты и выщелоченные ионы и тем самым выводить их из реакционной смеси, сдвигая
равновесие и способствуя дальнейшему разрушению минералов.
Имеющиеся сведения о моносахаридном составе экзополисахаридов Bacillus mucilagino-sus, молекулярной массе и степени окисленно-сти (соотношении гидроксильных и карбоксильных групп) разрозненны, они зависят от состава среды, в том числе источников углерода и азота, соотношения углерода и азота, значения рН, уровня аэрации и других факторов.
Основная часть. Цель данного этапа наших исследований заключалась в выделении, очистке, фракционировании и изучении экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus.
Бактерии Bacillus mucilaginosus в виде спорового материала получены из лаборатории МолдНИИстромпроект (г. Кишинев, Молдова).
Для глубинного культивирования бактерий применяли синтетическую питательную среду следующего состава, г/л: сахароза - 5;
(NH4)2SO4 - 0,5; K2HPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,1; K2SO4 - 0,1.
Культивирование бактерий проводили, как описано в [7].
К концу процесса культивирования наблюдалось сильное подкисление культуральной жидкости (значение рН снижалось до 3,9-4,0) и накапливались экзополисахариды. При использовании данной культуральной жидкости для биообработки глинистого сырья отмечалось существенное изменение технологических свойств шликерных масс [7].
Схема выделения, очистки и анализа экзополисахаридов представлена на рис. 1.
Определение молекулярной массы полисахаридов осуществляли гель-хроматографией [8]. Предварительно проводили диализ пробы против 0,01 М раствора NaCl, затем исследуемую фракцию наносили на колонку (35^2 см) с сефа-дексом G 200. Элюирование выполняли 0,01 М раствором NaCl со скоростью растворителя 20 мл/ч. Отбирали фракции объемом по 4 мл. Выход полисахаридов из колонки контролировали спектрофотометрически (спектрофотометр СФ-26 при X = 230 нм).
В результате проведения хроматографии исследуемая фракция полисахаридов вышла в объеме исключения. Ее объединяли и диализовали против 1 • 10-3 М раствора трис-HCl (pH 7,5).
Центрифугирование 25 мин при 5000 об/мин
I
(СпернатантТ)
3 объема этилового спирта
с Осадок
Охлаждение до 4°С І ~
Центрифугирование 25 мин при 5000 об/мин
I =
^Супернатант2)
^Фракция 1 ПСХ^>
г дистиллированная вода
Растворение
3 объема г этилового спирта
Охлаждение до 4°С
Центрифугирование 25 мин при 5000 об/мин
I =
(^СупернатантЗ)
(^фракция 2 ПСХ^)
г дистиллированная вода
Растворение
Диализ
Гель-хроматография І
Диализ
Ионообменная хроматография на ББАБ-целлюлозе
I
С^__фракция І
Диализ
С^__фракция Р2_^> І
Ионообменная хроматография ______на КМ-сефадексе________
Диализ
Ионообменная хроматография ______на КМ-сефадексе________
С^_фракция Р1-Г^
С^_фракция Р2-_Т>
* * ИК-спектро- фотометрия
Диализ Диализ *
Определение карбоксильных Определение карбоксильных
групп групп
Рис. 1. Схема выделения, очистки, фракционирования и анализа экзополисахаридов
Для определения степени гомогенности проводили фракционирование экзополисахарида методом ионообменной хроматографии [9] с применением ионнообменных смол на полисахаридной основе: анионите (БЕАЕ-целлю-лоза) и катионите (КМ-сефадекс), в которых функциональные ионообменные группы связаны с гидроксильными группами моносахарид-ных остатков.
В первом случае хроматографию осуществляли на колонке (35^2 см), заполненной БЕАЕ-целлюлозой и уравновешенной 1 • 10-3 М буферным раствором трис-НС1 (pH 7,5).
Полисахарид в уравновешивающем буферном растворе вносили в колонку сверху. Элюирование проводили 1 • 10-3 М раствором трис-НС1 со скоростью растворителя 30 мл/ч. Отбирали фракции объемом по 4 мл. Детектирование осуществляли спектрофотометром СФ-26 при X = 230 нм. После выхода первого хроматографического пика элюирование проводили 0,6 М раствором КС1 (pH 7,5) в элюирующем буферном растворе.
На рис. 2 показана хроматограмма разделения полисахаридов.
В результате выделены две фракции полисахарида: Б1 и Б2. Пробы каждой из них объединяли, диализовали против 1 • 10-3 М раствора трис-НС1 (pH 6,5). Затем фракции разделяли на КМ-сефадексе при тех же условиях, используя растворы с рН 6,5.
Данный эксперимент подтвердил однородность полученных ранее фракций Б1, Б2, после поочередного их разделения были выделены недиссоциирующие при pH 6,5 фракции Б1-1 и Б2-1.
Далее пробы этих фракций объединяли, диа-лизовали против дистиллированной воды и определяли наличие карбоксильных групп по Вильсон [10]. Метод основан на обратном титровании карбоксильных групп гидрокарбонатом натрия.
Результаты анализа подтвердили наличие карбоксильных групп во фракции Б2-1 и их отсутствие во фракции Б1-1.
Полученный ИК-спектр полисахарида представлен на рис. 3.
4
3.5 3
2.5 2
1.5 1
0,5
0
25 50 75 100 125
Объем элюента, мл
150
175
Рис. 2. Хроматограмма разделения полисахаридов
0
Спектр имеет следующие полосы поглощения: в области 3000-2800 см-1 проявляются полосы поглощения валентных колебаний С-С-связей; в области 3600-3200 см-1 имеется широкая полоса гидроксильных групп; ассиметричные валентные колебания С-О-С-связей проявляются в области 1150-1000 см-1; валентные колебания карбонильных групп карбоксила имеют интенсивную полосу 1600-1720 см-1. Исследуемый экзополисахарид является а-сахаром, так как имеет полосу в области 850-860 см-1 [11].
Заключение. Результаты гель-хроматографии указывают на большую молекулярную массу (больше 200 000 Да) анализируемого полисахарида. Основываясь на результатах ионообменной хроматографии, можно говорить о сложном составе исследуемого полисахарида, состоящего из двух фракций: фракция Б1 не содержит функциональных групп, диссоциирующих при pH 7,5; фракция Б2 имеет в своем составе функциональные группы, диссоциирующие при pH 7,5, что свидетельствует об ее анионном характере (полисахарид может содержать карбоксильные группы). Это предположение подтверждают результаты определения карбоксильных групп по Вильсон и ИК-спектрофотометрии.
Литература
1. Каравайко, Г. И. Микробная деструкция силикатных минералов / Г. И. Каравайко // Сб. науч. тр. / Ин-т микробиологии им. Виноградского. - Москва, 2004. - Вып. 12: Юбилейный сборник к 30-летию института. - С. 172-196.
2. Власов, А. С. Биологические методы обогащения минерального сырья и технологических смесей при производстве керамики / А. С. Власов // Химия и технология силикатных и тугоплавких неметаллических материалов. -
1989. - № 3. - С. 155-165.
3. Влияние условий микробиологической обработки глинистого сырья Беларуси на его качественные характеристики / Р. М. Маркевич [и др.] // Материалы. Технологии. Инструменты. - 2005. - № 4. - С. 86-89.
4. Малиновская, И. М. Влияние экзополисахарида Bacillus mucilaginosus на деструкцию хлорита и кварца в растворе органических кислот / И. М. Малиновская, В. С. Подгорский // Микробиологический журнал. - 1988. - Т. 50, № 5. - С. 21-25.
5. Белканова, Н. П. Разрушение силок-санной связи кварца Bacillus mucilaginosus / Н. П. Белканова, Г. И. Каравайко, З. А. Авакян // Микробиология. - 1985. - № 1. -
С.27-30.
6. Роль полисахарида Bacillus mucilaginosus в процессе деструкции силикатных минералов / И. М. Малиновская [и др.] // Микробиология. -
1990. - Т. 59, вып. 1. - С. 70-78.
7. Новый штамм бактерий рода Bacillus и его воздействие на качественные характеристики глины I Л. В. Куис [и др.] // Труды БГТУ Сер. IV, Химия и технология орган. в-в. -2007. - Вып. ХУ - С. 205-207.
8. Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман. - М.: Наука, 1985. - С. 126-137.
9. Методы химии углеводов / пер. с англ.; под ред. Н. К. Кочеткова. - М.: Мир, 1967. -512 с.
10. Оболенская, А. В. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы / А. В. Оболенская, З. П. Ельницкая, А. А. Леонович. - М.: Экология, 1991. - 320 с.
11. Беллами, Л. Инфракрасные спектры мо-
лекул / Л. Беллами; под ред. Д. Н. Шигорина. -М.: Издательство иностранной литературы,
1957. - 444 с.
