CC BY
129
УДК 58.085:581.16
DOI: 10.20310/1810-0198-2017-22-5-1039-1042
ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO И ОСОБЕННОСТИ РАЗМНОЖЕНИЯ DIOSCOREA NIPPONICA MAKINO
© О.А. Чурикова
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 119234, Российская Федерация, г. Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 E-mail: [email protected]
Отработана технология введения в культуру in vitro и микроклонального размножения Dioscorea nipponica Makino. Проанализировано влияние гормонального состава питательной среды на реализацию морфогенетиче-ского потенциала изолированных эксплантов. Определен оптимальный состав питательной среды для получения растений-регенерантов. Показана целесообразность использования фрагментов микроклубней для размножения D. nipponica in vitro.
Ключевые слова: диоскорея; биологически активные вещества; микроклональное размножение; культура in vitro; экспланты; микроклубни; морфогенетический потенциал
Род Dioscorea ф^согеасеае) включает 600 видов, представляющих собой многолетние травянистые лианы длиной от 2 до 12 м с крупными клубнями или корневищами. Несколько видов диоскорей, известных под собирательным названием ямс, - важные сельскохозяйственные культуры в тропических странах. Некоторые виды являются источником биологически активных веществ, например, диосгенина, накапливающегося в различных тканях и органах растения и обладающего противоопухолевым действием, снижающего содержание холестерина в крови, а также усиливающего устойчивость к действию стрессовых абиотических и биотических факторов окружающей среды [1]. Так, корневища с корнями диоскореи ниппонской содержат до 8 % стероидных сапонинов, главные из которых -протодиосцин, протограциллин и диосцин. Сырье собирают в течение всего вегетационного периода, начиная с конца апреля и до глубокой осени, но для восстановления зарослей корневища с корнями лучше собирать в сентябре-ноябре (после созревания семян), когда они достигают максимальных размеров. Для возобновления популяции необходимо оставлять примерно одну третью часть растений. Повторная заготовка на одном и том же участке возможна лишь через 20 лет. Семенное размножение диоскорей - трудоемкий процесс, так как для них характерна низкая семенная продуктивность. Семена плохо переносят высушивание, для их прорастания необходимо проведение стратификации. У многих видов ярко выражена биологическая разнокачественность семян, сеянцы развиваются очень медленно и т. д. Диоскореи можно размножать также отрезками подземных клубней, однако при многократном делении последних возможно изменение или утрата полезных веществ. Получение клубней затруднено из-за наличия ряда вирусов и грибковых заболеваний [2]. Таким образом, разработка биотехнологических методов размножения редких и угрожаемых растений с целью сохранения биоразнообразия и создания генети-
ческого банка культур является весьма актуальным направлением.
В литературе содержатся данные по размножению in vitro нескольких видов диоскореи на питательных средах с различным содержанием сахарозы, гормональных регуляторов роста и их соотношением. Так, при выращивании эксплантов узлов побегов D. opposita и D. alata на среде с 20 г/л сахарозы наблюдалось формирование максимального количества микроклубней [3]. Для размножения Dioscorea wightii использовали среды, содержащие бензиламинопурин (BAP) и кине-тин, а индукцию каллюсообразования наблюдали на среде по прописи Мурасиге и Скуга (MS) [4] с добавлением BAP, кинетина и Ыб-(2-изопентил) аденина (2-iP) [5]. Работы, касающиеся размножения in vitro диоскореи ниппонской, в известной нам литературе практически не встречались. В статье Т.Т. Доан с соавторами [б] приведены результаты изучения возможности использования нетрадиционных препаратов с ци-токининовой активностью (Цитодеф и Дропп) в процессе микроклонального размножения этого вида. Авторами показано, что для получения стабильного коэффициента размножения в питательную среду целесообразно добавлять препарат Дропп в концентрации 0,5 мг/л в сочетании с 0,5 м/л нафтилуксусной кислоты (NAA), а для формирования микроклубней - индолил-масляную кислоту (IBA) в концентрации 3 мг/л.
Объектом наших исследований послужила Dioscorea nipponica Makino, распространенная в Приморском и Хабаровском краях, Амурской области. Вид занесен в Красную книгу РФ. Встречается в изрежен-ных широколиственных и смешанных лесах, на лесных полянах, опушках, в долинах рек, ручьев и стариц; часто на местах вырубок, пожаров, старых залежах. Это двудомная лиана, вьющиеся стебли которой могут быть длиной 5-7 м и более, с горизонтальным толстым (до 3 см в диаметре), разветвленным корневищем, с многочисленными тонкими и жесткими корнями дли-
ной до 1,5 м. Для введения в стерильную культуру использовали свежие семена урожая 2015 г., полученные в Ботаническом саду МГУ. Согласно данным литературы [7], семена D. nipponica сравнительно быстро теряют всхожесть, которая резко снижается при хранении, и спустя 4,5 года после сбора они становятся невсхожими. Семена характеризуются выраженной гетерогенностью. Для введения в стерильную культуру семена последовательно замачивали в фундазоле на 20-30 мин, в 70 % этиловом спирте на 1-2 мин, после чего подвергали стерилизационной обработке в 3 % растворе лизоформина и промывали 3 раза в стерильной воде. Подготовленные таким образом семена помещали в культуральные сосуды на питательную среду MS половинного состава без сахарозы и гормональных регуляторов роста и подвергали стратификации, согласно рекомендациям М.Г. Николаевой с соавт. [8], при 4 °C в течение 2 месяцев для преодоления покоя и стимуляции прорастания. Для доразвития зародыша после стратификации семян оптимальной температурой является 23 °C.
Семена характеризуются выраженной гетерогенностью, зародыш на момент диссеменации является недоразвитым и заполняет лишь 1/5-1/6 длины семени, причем размеры и степень его дифференциации значительно варьируют [7]. В процессе доразвития происходит разрастание семядоли, пластинка которой заполняет около 2/3 длины эндосперма, и за счет усиленного роста ее срединой части наблюдается прорастание семени.
Наблюдения за развитием почечки зародыша показали, что она представляет собой сильно укороченный клубневидный пазушный стебель (зачаточное корневище), в верхней части которого расположена точка роста [7]. Согласно Л.М. Поздовой с соавт. [9], в пазухе первого настоящего фотосинтезирующего листа последовательно формируется система сериальных боковых почек. Это впоследствии приводит к формированию нескольких побегов.
Для микроклонального размножения диоскореи ниппонской использовали микрочеренки побегов растений, полученных в условиях in vitro, которые выса-
живали на среду MS + 20 г/л сахарозы + 1,5 мг/л 2-1Р, на которой из пазушных почек развивались побеги.
Для некоторых видов диоскореи было показано, что культивирование эксплантов узлов побега на среде без гормональных регуляторов роста является эффективным способом их размножения [10].
При длительном выращивании растений D. трротса на безгормональной среде наблюдалось формирование двух типов микроклубней (до 1,5-2,0 см): в пазухах листьев, а также в основании побегов, что, в целом, характерно для этого вида (рис. 1).
Сформировавшиеся микроклубни делили на фрагменты 0,5 см, содержащие 1-2 почки, и помещали на среды следующего состава:
I. MS + 20 г/л сахарозы;
II. MS + 20 г/л сахарозы + 0,5 мг/л ВАР;
III. MS + 20 г/л сахарозы + 1,5 мг/л 2-1Р;
IV. MS + 20 г/л сахарозы + 1 мг/л 21Р + 1 мг/л NAA.
Рис. 1. Воздушные клубни, формирующиеся в пазухе листьев побегов D. трротса на безгормональной среде
Рис. 2. Развившиеся de novo побеги из фрагментов микроклубней D. nipponica на средах: А) MS + 0,5 мг/л BAP; Б) MS + 1,5 мг/л 2-iP; В) MS + 1 мг/л 2iP + 1 мг/л NAA
На безгормональной среде развивались побеги, в пазухах которых формировались мелкие (1,0-1,5 мм) микроклубни. На среде II наблюдалось развитие побегов из почек и формирование нескольких побегов следующего порядка, микроклубни при этом практически не образовывались (рис. 2А).
Сходные результаты были получены ранее при размножении Dioscorea composite Hemsl. [11]. Так, было показано, что добавление в питательную среду BAP оказывало сильный ингибирующий эффект на формирование и развитие микроклубней, в то время как использование NAA и индолилмасляной кислоты (IBA), наоборот, стимулировало эти процессы.
При культивировании фрагментов микроклубней на среде III в течение 1,5-2 месяцев развивались побеги до 4,0-4,5 см высотой, в пазухах листьев которых формировались микроклубни (рис. 2Б).
На среде IV происходило развитие побегов (до 5-б), достигавших спустя 2,5-3 месяца культивирования 5,5-6,0 см в высоту, успешно укоренявшихся на той же среде, и формирование растений-регенерантов (рис. 2В).
Т.Т. Доан с соавт. [6] отмечено, что реализация морфогенетического потенциала растений диоскореи зависит от генотипических особенностей растения-донора и соответствующей оптимизации питательной среды по гормональному составу.
В ходе наших исследований показано, что использование фрагментов микроклубней является предпочтительным для микроклонального размножения D. nipponica.
В результате анализа влияния питательной среды MS с добавлением различных гормональных регуляторов на рост и развитие диоскореи ниппонской in vitro нами выявлено, что гормональный состав питательной среды оказывает существенное влияние на процесс формирования микроклубней. Наиболее оптимальной для размножения этой культуры in vitro оказалась среда MS с 20 г/л сахарозы, 1 мг/л 2iP и 1 мг/л NAA. Для формирования большего числа микроклубней в основании побегов и в пазухах листьев и увеличения коэффициента размножения D. nipponica целесообразно чередование культивирования эксплантов на среде без добавления гормональных регуляторов роста с выра-
щиванием фрагментов микроклубней на вышеуказанной среде, на которой также происходит укоренение формирующихся de novo побегов. Отработанная технология микроклонального размножения диоскореи ниппонской может послужить основой для получения качественного материала для восстановления популяций и сохранения этого вида в природе, а также депонирования в генетических банках in vitro.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Васильева И.С., Пасешниченко В.А. Стероидные гликозиды растений и культуры клеток диоскореи, их метаболизм и биологическая активность // Успехи биологической химии. 2000. Т. 40. С. 153204.
2. Saleil V., Degras L., JonardR. Obtention de plantes indemmes de virus de la mosaique de l'igname americaine Dioscorea trifida L. // Agronomie. 1990. V. 10. P. 605-615.
3. Mantell S.H., Haque S.Q., Whithall A.P. Clonal propagation of Dioscorea alata L. and Dioscorea rotundata Poir Yams by tissue culture // J. Hortic. Sci. 1978. V. 51. P. 95-98.
4. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioas-say with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. V. 104. P. 473497.
5. Mahesh R., Muthuchelian K., Maridass M., Raju G. In vitro propagation of wild yam, Dioscorea wightii through nodal cultures // Int. J. of Bio. Technol. 2010. № 1. P. 111-113.
6. Доан Т.Т., Калашникова Е.А., Молканова О.И. Клональное микроразмножение редких и исчезающих видов растений // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2012. Вып. 5. С. 48-52.
7. Герасименко И.И., Тропова Е.Ф. О прорастании некоторых видов диоскореи // Растительные ресурсы. 1966. Т. 2. Вып. 3. С. 346-353.
8. Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян. Л.: Наука, 1985. 221 с.
9. Поздова Л.М., Титова Г.Е., Торшилова А.А. Биология прорастания и качество семян Dioscorea nipponica (Dioscoreaceae) // Растительные ресурсы. 2005. Т. 41. Вып. 2. С. 53-64.
10. Okezie C.E.A. Involvement of day length in the tuberization of Dioscorea rotundata minisetts under Nsukka conditions // Terry E.R., Akoroda M., Arene B. (eds.) Tropical Root Crops. Ottawa: International Development Research Center, 1987. 197 p.
11. Alizadeh S., Mantell S.H., Viana A.M. In vitro culture and microtuber induction in the steroidal yam Dioscorea composite Hemsl. // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1998. V. 53. P. 107-112.
БЛАГОДАРНОСТИ: Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-50-00029 (направление «Растения»)).
Поступила в редакцию 7 июля 2017 г.
Чурикова Ольга Альбертовна, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, г. Москва, Российская Федерация, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, е-тай: [email protected]
Для цитирования: Чурикова О.А. Введение в культуру in vitro и особенности размножения Dioscorea nipponica Makino // Вестник Тамбовского университета. Серия Естественные и технические науки. Тамбов, 2017. Т. 22. Вып. 5. С. 1039-1042. DOI: 10.20310/1810-0198-2017-22-5-1039-1042
For citation: Churikova O.A. Vvedenie v kul'turu in vitro i osobennosti razmnozheniya Dioscorea nipponica Makino [Introduction to in vitro culture and peculiarities of reproduction of Dioscorea nipponica Makino]. Vestnik Tambovskogo universiteta. Seriya Estestvennye i tekhnicheskie nauki — Tambov University Reports. Series: Natural and Technical Sciences, 2017, vol. 22, no. 5, pp. 1039-1042. DOI: 10.20310/1810-0198-2017-22-5-1039-1042 (In Russian, Abstr. in Engl.).
UDC 58.085:581.16
DOI: 10.20310/1810-0198-2017-22-5-1039-1042
INTRODUCTION TO IN VITRO CULTURE AND PECULIARITIES OF REPRODUCTION OF DIOSCOREA NIPPONICA MAKINO
© O.A. Churikova
Lomonosov Moscow State University 1 Bldg. 12, Leninskie Gori, Moscow, Russian Federation, 119234 E-mail: [email protected]
The technology of in vitro culture induction and microclonal propagation of Dioscorea nipponica Makino is worked out. The influence of hormonal regulators of nutritive medium on the realization of morphogenic potential of isolated explants is analyzed. The optimum plant medium composition for the obtaining of plants-regenerants is determined. The expediency of using of microtubes fragments for propagation of D. nipponica in vitro is displayed.
Keywords: dioscorea; substances with biological activity; microclonal propagation; in vitro culture; explants; microtubers; morphogenic potential
REFERENCES
1. Vasileva I.S., Paseshnichenko V.A. Steroidnye glikozidy rasteniy i kul'tury kletok dioskorei, ikh metabolizm i biologicheskaya aktivnost' [Steroidal Glycosides of Plants and Culture of Cells of Yam, their Metabolism and Biological Activity]. Uspekhi biologicheskoy khimii — Biological Chemistry Reviews, 2000, vol. 40, pp. 153-204. (In Russian).
2. Saleil V., Degras L., Jonard R. Obtention de plantes indemmes de virus de la mosaique de l'igname americaine Dioscorea trifida L. Agronomie, 1990, vol. 10, pp. 605-615.
3. Mantell S.H., Haque S.Q., Whithall A.P. Clonal propagation of Dioscorea alata L. and Dioscorea rotundata Poir Yams by tissue culture. J. Hortic. Sci., 1978, vol. 51, pp. 95-98.
4. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant, 1962, vol. 104, pp. 473-497.
5. Mahesh R., Muthuchelian K., Maridass M., Raju G. In vitro propagation of wild yam, Dioscorea wightii through nodal cultures. Int. J. of Bio. Technol., 2010, no. 1, pp. 111-113.
6. Doan T.T., Kalashnikova E.A., Molkanova O.I. Klonal'noe mikrorazmnozhenie redkikh i ischezayushchikh vidov rasteniy [Clonal micropropagation of rare and endangered species of plants]. Izvestiya Timiryazevskoy sel'skokhozyaystvennoy akademii — Izvestiya of Timiryazev Agricultural Academy, 2012, no. 5, pp. 48-52. (In Russian).
7. Gerasimenko I.I., Tropova E.F. O prorastanii nekotorykh vidov dioskorei [About germination of some species of yam]. Rastitel'nye resursy — Plant Resources, 1966, vol. 2, no. 3, pp. 346-353. (In Russian).
8. Nikolaeva M.G., Razumova M.V., Gladkova V.N. Spravochnikpo prorashchivaniyu pokoyashchikhsya semyan [A Guide to Germination of Dormant Seeds]. Leningrad, Nauka Publ., 1985, 221 p. (In Russian).
9. Pozdova L.M., Titova G.E., Torshilova A.A. Biologiya prorastaniya i kachestvo semyan Dioscorea nipponica (Dioscoreaceae) [Biology of germination and the quality of seeds Dioscorea nipponica (Dioscoreaceae)]. Rastitel'nye resursy — Plant Resources, 2005, vol. 41, no. 2, pp. 53-64. (In Russian).
10. Okezie C.E.A. Involvement of day length in the tuberization of Dioscorea rotundata minisetts under Nsukka conditions. In: Terry E.R., Akoroda M., Arene B. (eds.). Tropical Root Crops. Ottawa: International Development Research Center. Ottawa, International Development Research Center, 1987, 197 p.
11. Alizadeh S., Mantell S.H., Viana A.M. In vitro culture and microtuber induction in the steroidal yam Dioscorea composite Hemsl. Plant Cell Tissue Organ Cult., 1998, vol. 53, pp. 107-112.
ACKNOWLEDGEMENTS: The work was carried out under the financial support of Russian Scientific Foundation (project no. 14-50-00029 (direction "Plants").
Received 7 July 2017
Churikova Olga Albertovna, Lomonosov Moscow State University, Biology Faculty, Moscow, Russian Federation, Candidate of Biology, Senior Research Worker, e-mail: [email protected]
