CC BY
203
УДК 61:575
ВРОЖДЕННАЯ ДИСФУНКЦИЯ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ: ПОИСК МУТАЦИЙ В ГЕНЕ CYP21A2
© А. А. Рахимкулова1*, В. Л. Ахметова1, О. А. Малиевский2, Э. К. Хуснутдинова1'3
1 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел.: +7 (347) 235 60 88. 2Башкирский государственный медицинский университет Россия, Республика Башкортостан, 450000 г. Уфа, ул. Ленина, 3.
Тел.: +7 (347) 272 11 60.
3Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел.: +7 (34 7) 272 63 70.
E-mail: [email protected]
Мутации в гене CYP21A2, кодирующем фермент 21-гидроксилаза, являются причиной развития одного из наиболее распространенных наследственных заболеваний, врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН). Более 90% случаев данного заболевания связано с нарушениями функционирования данного фермента. Уровень остаточной активности 21-гидроксилазы определят клиническую форму и тяжесть течения заболевания. Нами проведен анализ гена CYP21A2 у 120 больных ВДКН, проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ), в результате которого определен спектр мутаций, характерный для данного региона, и установлено соответствие выявленных мутаций клиническим формам, что в некоторой степени позволяет расширить представление о молекулярно-генетических механизмах развития такого гетерогенного заболевания как ВДКН.
Ключевые слова: ген, 21-гидроксилаза, врожденная дисфункция коры надпочечников, мутация.
Введение
Врожденная дисфункция коры надпочечников — группа заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, обусловленных врожденным дефектом ферментов биосинтеза кортикостероидов [1, 2]. Более 90% случаев ВДКН связано с возникновением мутаций в гене CYP21A2, кодирующем 21-гидроксилазу. Классическая форма ВДКН характеризуется полной или частичной потерей функциональной активности данного фермента, что в первом случае приводит к развитию сольтеряю-щей формы (СТФ), а во втором — простой вириль-ной (ПФ). Частота встречаемости классической формы ВДКН в мире составляет в среднем 1:15000—16000 новорожденных, в России — 1:8662, в Республике Башкортостан — 1:8974 [3, 4]. При неклассической форме (НФ) остаточная активность 21-гидроксилазы составляет 20—60%, а частота в среднем составляет 1:1000 новорожденных [1].
Ген CYP21A2 локализован на коротком плече 6 хромосомы на расстоянии в 30 кЬ от высокогомологичной ему последовательности псевдогена CYP21A1P, неактивного вследствие присутствия в нем 15 мутаций. На сегодняшний день в гене CYP21A2 идентифицировано около 200 мутаций, более 90% из которых являются результатом межгенных рекомбинаций между функциональным геном CYP21A2 и псевдогеном CYP121A1P, при этом список описываемых нарушений гена 21-гидроксилазы непрерывно обновляется [5].
В связи с этим цель настоящей работы заключалась в анализе гена CYP21A2 у больных ВДКН из Республики Башкортостан, определение спектра мутаций, характерных для данного региона и сопоставление идентифицированных мутаций с клиническими формами заболевания.
Материалы и методы
Молекулярно-генетический анализ гена CYP21A2 был проведен у 120 больных ВДКН, состоящих на учете в отделении эндокринологии Республиканской детской клинической больницы г. Уфы и проживающих на территории Республики Башкортостан. Из них 63 больных имели сольтеряющую форму (52.5%), 46 - простую вирильную форму (37.5%), 12 - неклассическую форму ВДКН (10%).
Геномная ДНК больных ВДКН и членов их семей была выделена из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [6].
Наиболее распространенные мутации гена CYP21A2: delA2/LGC, p.Pro30Leu, трЫсе, p.Ile172Asn, ClusterE6, p.Val281Leu, p.Gln318X, p.Arg356Trp и Pro453Ser, идентифицировались путем проведения ПЦР различной модификации с последующим, при необходимости, ПДРФ- анализом. В случае отсутствия у больного распространенных и легко диагностируемых мутаций проводился анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP-анализ), по результатам которого осуществлялось секвенирование. Высокая гомология CYP21A2 и CYP21A1P и присутствие в
* автор, ответственный за переписку
1040
БИОЛОГИЯ
псевдогене исследуемых в активном гене точковых мутаций препятствует проведению анализа гена CYP21A2 путем прямого использования геномной ДНК больных с диагнозом ВДКН и соответствующих праймеров. Однако существующие различия в последовательностях псевдогена и активного гена позволяют получить фрагмент последнего с помощью ПЦР с использованием CYP21A2 специфичных праймеров: BF1 CCCAGGTGGGGGCGGACACTA) и 21BR AATTAAGCCTCAATCCTCTGCAGCG) [7]. Дальнейший анализ осуществлялся с использованием амплификата активного гена.
Результаты и обсуждение
В результате проведенного анализа выявлено 11 мутаций гена CYP21A2. Наиболее распространенной мутацией оказалась делеция/конверсия delA2/LGC, обнаруженная на 29.16% хромосом. Частота данных мутаций в РБ соответствует таковой в европейских странах. Так, во Франции она составляет 25%, Германии — 27.4%, Италии — 26, Нидерландах - 31.9% [8]. Нами данная мутация обнаружена у 35 больных с СТФ, из них у 18 в гомозиготном состоянии, и 14 больных с ПФ заболевания, но только в компаунд-гетерозиготном состоянии с другой мутацией.
Вторая по частоте мутация сплайсинга I2splice (а293-А/0^) гена CYP21A2 определена на 14.58% хромосом, что несколько ниже, чем в популяциях Европы [8]. Согласно данным литературы большинство гомозиготных носителей данной мутации имеют СТФ ВДКН [5], что соответствует полученным нами данным: все 7 больных с мутацией сплайсинга в гомозиготном состоянии имеют СТФ заболевания.
Замена аргинина на триптофан в 356 положении (р.А^356Тгр) выявлена у 22 больных с СТФ, 5 больных с ПФ и 1 больного с НФ ВДКН, что составляет 11.7% и превышает среднюю частоту данной мутации в странах Европы в 1.5-2 раза [8].
Мутация p.Ile172Asn гена CYP21A2 идентифицирована у 1 больного с СТФ заболевания, но в кластере с мутацией p.Gln318X и 12 больных (5%) с ПФ ВДКН, что соответствует литературным данным, согласно которым данная мутации ассоциирована с ПФ заболевания.
У 7 больных с СТФ и 1 больного с НФ ВДКН и только в компануд-гетерозиготном состоянии с другими мутациями нами обнаружена мутация p.Gln318X. В целом, частота данной мутации в РБ (3.3%) сопоставима с европейской, которая варьирует от 2 до 5.9% [8].
Мутация р. Уа128^еи гена CYP21A2 ассоциирована, как правило, с НФ ВДКН. В РБ данная мутация определена только у больных с НФ заболевания с частотой 2.1%.
Также у больных с НФ ВДКН встречается мутация p.Pro30Leu гена CYP21A2. Нами данная му-
тация была обнаружена у 3 больных с ПФ заболевания (1.7%), причем у одного в гомозиготном состоянии.
Кроме того, посредством SSCP-анализа и последующего секвенирования образцов с измененной подвижностью однонитевых фрагментов у 4 больных идентифицировано 4 мутации: deШe384, F307+1nt, pArgR426Cys и p.Pro453Ser. Ранее неописанная мутация deШe384 идентифицирована у 1 больного с СТФ 21-гидроксилазной недостаточности в компаунд-гетерозиготном состоянии с delA2/LGC. Инсерция тимина в 1762 положении F307+1nt также обнаружена у одного больного (0.4%), но в сочетании с мутацией 1172Ы, что привело к развитию ПФ ВДКН. Мутация p.ArgR426Cys гена CYP21A2 была выявлена у одного больного с СТФ заболевания в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией I2splice (0.4%). Замена пролина на серин в 453 положении, p.Pro453Ser, обнаружена у 1 больного с ПФ ВДКН в кластере с мутацией I2splice (P453S+I2splice (0.4%)). Помимо описанного кластера, в гене CYP21A2 выявлено присутствие двух мутаций на одной хромосоме еще у 7 больных: p.Arg356Trp+p.Gln318X (2.1%), de-lA2/LGC+p. Val281Leu (0.4%), p.Ile172Asn+ p.Gln318X (0.4%). Такое сцепление мутаций или кластер унаследован больным либо от матери, либо от отца. Кластеризация мутаций на одной хромосоме внутри нуклеотидной последовательности гена характерна для гена CYP21A2, что возможно, связано с большими генными конверсиями или многократными мутационными событиями.
Анализ распределения частот мутаций в гене CYP21A2 в трех группах пациентов с разными формами заболевания показал статистически значимые отличия. Так, у больных с СТФ делеция/конверсия delA2/LGC гена CYP21A2 выявлена с частотой в 2.4 раза большей, чем у больных с ПФ (41.3% и 17.2%, соответственно, х = 13.7, р = 0.002) и с НФ недостаточности 21-гидроксилазы (41.3% и 17.5%, соответственно, X2 = 6.0, р = 0.007). Мутации I2splice, R356W и Q318X также встречались с более высокой частотой в группе больных с СТФ, чем с ПФ и НФ (23.0%, 9.4% и 0.0%, соответственно, X = 6.4, р = 0.006; 18.3%, 8.3% и 4.2%, соответственно, X = 2.9, р = 0.047 и х2 = 1.6, р = 0.101; 7.5%, 0.6% и 4.2%, соответственно, X = 18, р = 0.091 и X = 0.05, р = 0.414, соответственно). Напротив, мутация П72Ы была характерна для группы больных с ПФ, тогда как в группе с СТФ заболевания она определена в кластере с делецией/конверсией delA2/LGC, а у больных с НФ не идентифицирована (13.3%, 0.4% и 0.0%, соответственно, X = 12.07, р = 0.001). Мутация V281L гена CYP21A2 выявлена только у больных с НФ (20.8%), за исключением одного больного с ПФ, у которого она обнаружена в кластере с делецией/конверсией delA2/LGC (0.6%). Мутация P30L гена CYP21A2 идентифицирована
только у больных с ПФ (3.3%). Таким образом, для сольтеряющей, простой вирильной и неклассической форм недостаточности 21-гидроксилазы показан свой спектр диагностически значимых мутаций.
Помимо мутаций, приводящих к развитию тех или иных форм ВДКН, в гене CYP21A2 выявлено множество полиморфных вариантов, несущих нейтральный характер и фенотипически не проявляющихся (га6449, ^6463, ^2075561, ^6462, S374S, rs6474, rs6455, rs6463, rs6472). С наибольшей частотой определены полиморфные варианты rs6449 (38.7%), га6462 (65.3%), га6474 (56.7%), S374S (17.7%).
Проведенное нами молекулярно-генетическое обследование 120 семей с ВДКН, проживающих в Республике Башкортостан, показало, что 66% изученных ВДКН семей оказались полностью информативными для ДНК-диагностики прямым методом, 14% - частично информативными. 20% семей с ВДКН из РБ - абсолютно неинформативными. Во всех семьях при использовании прямых методов молекулярной диагностики были определены носители мутантных хромосом.
Таким образом, полученные данные представляют научную и практическую значимость для медико-генетического консультирования с целью повышения эффективности молекулярно-генетичес-
кой диагностики ВДКН в РБ в связи с ее высокой
распространенностью в данном регионе и профилактики рождения больных детей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Haider S. et al. Structure-phenotype correlations of human CYP21A2 mutations in congenital adrenal hyperplasia // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013. Т. 110. №7. С. 2605-2610.
2. Lee H. H. CYP21 mutations and congenital adrenal hyperplasia // Clinical genetics. 2001. Т. 59. №5. С. 293-301.
3. Nimkarn S., Lin-Su K., New M. I. Steroid 21 hydroxylase deficiency congenital adrenal hyperplasia // Endocrinology & Metabolism Clinics of North America. 2009. Т. 38. №4. С. 699-718.
4. Рамова З. Ф. Распространенность и клинико-диагностическая характеристика гипокортицизма у детей в Республике Башкортостан //Автореф. дисс. канд. мед. наук. Уфа. 2010.
5. White P. C., Speiser P. W. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency // Endocrine reviews. 2000. Т. 21. №3. С. 245-291.
6. Mathew C. G. The isolation of high molecular weight euka-ryotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J. M. N. Y.; Humana press. 1984. P. 31-34.
7. Charfeddine I. B. et al. Steroid 21-hydroxylase gene mutational spectrum in 50 Tunisian patients: Characterization of three novel polymorphisms // Gene. 2012.
8. Ba§ F. et al. CYP21A2 Gene Mutations in Congenital Adrenal Hyperplasia: Genotype-phenotype correlation in Turkish children // Journal of clinical research in pediatric endocrinology. 2009. Т. 1. №3. С. 116.
Поступила в редакцию 10.09.2013 г.
