CC BY
38Фізика живого, Т. 19, No 1, 2011. С.30-32.
© Цудзевич Б. О., Калінін І. В., Петрук Н. А
УДК 577.1.57.044:152.574.2:615.9
ВПЛИВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ НА ВМІСТ ЦИТОХРОМІВ Р-450 І b5 ТА АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ
Цудзевич Б.О., Калінін І.В., Петрук Н.А.
ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка
e-mail: [email protected]
Надійшла до редакції 15.03.2011
Досліджено вплив важких металів (міді, цинку, кадмію, свинцю) на вміст цитохромів Р-450 і Ь5 та активність ферментів печінки щурів. Встановлено зниження вмісту досліджуваних цитохромів та зменшення активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази і 6-фосфоглюконатдегідрогенази у печінці інтоксикованих щурів.
Ключові слова: цитохром Р-450 і Ь5, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, 6-фосфоглюконатдегідрогеназа, НАДН, НАДФН, міді сульфат, цинку сульфат, кадмію сульфат, свинець азотнокислий.
ВСТУП
На сьогоднішній день в результаті антропогенної діяльності використовується більше 70 тисяч чужорідних для організму речовин, які називають ксенобіотиками. Надійшовши до організму
ксенобіотики, у тому числі і важкі метали, зазнають біотрансформації в печінці завдяки наявності в ендоплазматичному ретикулумі гепатоцитів широкого спектру ферментів. Серед них особливу роль відіграє система гемопротеїнів Р-450. Реакції гідроксилювання ксенобіотиків, які забезпечує система мікросомальних монооксигеназ, спрямовані на захист живих систем від накопичення в них гідрофобних сполук.
Цитохроми Р-450 і Ь5, а також НАДФН- і НАДН-редуктази належать до монооксигеназної системи, що є унікальною за різноманітністю субстратів їхньої дії і типів реакцій [1-3]. З численних компонентів тільки цитохром Р-450 (неспецифічна монооксигеназа, КФ 1.14.14.1) здатен активувати молекулярний кисень за участю електронів, донором яких є НАДФН і цитохром Ь5 (рис.1).
НАДФН
ОЙ
НАДФН-цитохром Р450_редуктаза
цитохром bg
|Fe^|
НАД Н цитохром Р450 рє дук таза
НАДН
Рис. 1. Гідроксилювання субстрату (RH) в НАДФН-цитохром-Р-450-залежній монооксигеназній системі.
Метою досліджень було вивчення впливу важких металів (міді, цинку, кадмію, свинцю) на вміст цитохромів Р-450 і Ь5 та активність НАДФН-генеруючих ферментів (глюкозо-6-
фосфатдегідрогенази - КФ 1.1.1.49 і 6-фосфоглюконатдегідрогенази - КФ 1.1.1.44) печінки щурів.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Досліди проводили на білих нелінійних щурах-самцях, одного віку, масою 180-200 г., впродовж 14 діб. Було утворено п’ять груп тварин: перша -інтактні (контроль), друга - тваринам перорально вводили розчин міді сульфату в дозі 1/10 від ЛД50, третя - щурам перороально вводили розчин цинку сульфату в дозі 1/20 від ЛД50, четверта - тваринам перорально вводили розчин кадмію сульфату в дозі 1/30 від ЛД50, п’ята - тваринам перорально вводили розчин свинцю азотнокислого в дозі 1/50 від ЛД50. Щурів декапітували під ефірним наркозом та відбирали тканини печінки для подальших досліджень. Вся робота проводилась відповідно до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують у наукових цілях.
Для дослідження брали печінку, яку відмивали через воротну вену охолодженим 1% розчином КС1 та гомогенізували в 0,05 М трис-НСІ буфері (рН 7,5), що містив 0,025 М сахарози, 0,005 М MgCl2, 0,025 М КС1,
0,008 М СаС12. Мікросомальну фракцію печінки одержували за методом [4]. Усі процедури виконували з дотриманням холодового режиму (+4°С). Стан монооксигеназної системи печінки оцінювали за вмістом цитохромів Р-450 і Ь5, які визначали за методом [5] та активністю п-нітрофенолгідроксилази -маркеру цитохрому Р-450 [6].
Активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази і 6-фосфоглюконатдегідрогенази визначали за методом
ВПЛИВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ НА ВМІСТ ЦИТОХРОМІВ Р-450 І bs ТА АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ
Стан вільнорадикальних процесів у мікросомальній фракції печінки визначали за швидкістю НАДФН накопичення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) за методом [8]. Вміст білка у мікросомальній фракції печінки визначали згідно [9]. Експериментальні дані обробляли статистично з використанням ^критерію Ст’юдента [10].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Встановлено, що вміст мікросомальних цитохромів Р-450 і Ь5 за умов інтоксикації іонами міді, цинку, кадмію та свинцю (рис.2) знизився у всіх дослідних групах. Зокрема цитохром Р-450 знизився: в другій групі на 14 %, в третій на 12 %, в четвертій на з 2
0
а 1,00
* « 0,90 Н ц 0,80 | ІО 0,70
1- 0,60
1 2 0,60 £ "2 0,40 П 5 0,30 2 і 0,20 о І 0,10
0 0,00
а
*
1
27 %, в п’ятій на 21 %, по відношенню до контрольних тварин. Зниження вмісту цитохрому Ь5 реєструвалось: при введенні міді сульфату на 16 %, при введенні цинку сульфату на 14 %, при введенні кадмію сульфату на 31 %, при введенні свинцю азотнокислого на 25 %, відносно контролю. Більш виразне зниження цитохромів встановлено за умов інтоксикації іонами кадмію.
Таке зменшення ймовірно, зумовлене переважанням швидкості процесів деградації молекул цитохрому Р-450 внаслідок активації процесів ферментативного пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) в мікросомах. Зниження вмісту цитохрому Ь5, можливо, пов’язане із порушеннями у функціонуванні електронно-транспортного ланцюга.
—P-450 Ь5 X 0 65
j=0B3. 0,73 --~0'71 —
■=062 ■ S*06 0,5 — : -0,51
1 1 1 1
Контроль Інтоксиковані міддю Інтоксиковані цинком Інтоксиковані кадмієм Інтоксиковані свинцем
щурі щурі щурі щурі
Групи тварин
Рис. 2. Вміст мікросомальних цитохромів в печінці щурів після інтоксикації іонами міді, цинку, кадмію та свинцю (М±т, п=8).
Таблиця 1
Активність НАДФ-залежних дегідрогеназ в печінці щурів за умов інтоксикації іонами важких металів,
нмоль НАДФН/мг білка за хв. (М±т, п=8)
Групи тварин Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа 6-фосфоглюконатдегідрогеназа
Контроль 22,7±2,3 34,3±2,1
Інтоксиковані CuSO4 20,1±1,8 33,1±2,б
Інтоксиковані ZnSO4 19,8±1,7 32,9±2,4
Інтоксиковані CdSO4 17,2±1,5* 30,5±2,2
Інтоксиковані Pb(NO3)2 18,4±1,9* 31,2±2,8
Примітка: * - P<0,05 - відносно контролю.
Таблиця 2
Швидкість НАДФН накопичення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою в мікросомальній фракції печінки
щурів за умов інтоксикації іонами важких металів (М±т, п=8)
Групи тварин Швидкість НАДФН-залежного утворення ТБК-продуктів, нмоль/ хв^мг білка
Контроль 0,341±0,02
Інтоксиковані CuSO4 0,б89±0,07*
Інтоксиковані ZnSO4 0,б97±0,08*
Інтоксиковані CdSO4 0,793±0,09*
Інтоксиковані Pb(NO3)2 0,824±0,0б*
Примітка: * - P<0,05 - відносно контролю.
Дослідження активності НАДФН-генеруючих ферментів - глюкозо-6-фосфатдегідрогенази і 6-фосфоглюконатдегідрогенази при дії важких металів наведено в табл. 1. Встановлено зниження активності
обох досліджуваних ферментів, що каталізують НАДФ-залежне дегідрування субстратів.
За умов інтоксикації іонами важких металів (всі дослідні групи) спостерігалось зростання НАДФН-
Цудзевич Б.О., Калінін І.В., Петрук Н.А.
залежного ПОЛ (табл. 2) у 2 рази, по відношенню до контрольної групи.
Значне посилення саме ферментативного ПОЛ є очевидним свідченням залучення до процесу монооксигеназної системи. Одержані результати узгоджуються з даними літератури щодо високої оксидазної активності цитохрому Р-450 за рахунок утворення активних форм кисню та ініціації залежного від НАДФН пероксидного окиснення ліпідів [11-12]. Можливо, продукти ПОЛ взаємодіють із вільними аміногрупами апобілків, що
супроводжується зниженням вмісту цитохрому Р-450.
ВИСНОВКИ
В результаті проведених досліджень встановлено зниження вмісту цитохромів Р-450, b5 і активності НАДФ-залежних дегідрогеназ, що може бути причиною гіперпродукції вільних радикалів та активних форм кисню, які створюють передумови для розвитку окисного стресу. Отримані дані підтверджують участь цитохромів у токсичній біотрансформації ксенобіотиків, що призводить до формування захисних реакцій в організмі та запобігає ушкодженню печінки.
Література
1. Bondy, S.C. Contribution of hepatic cytochrome P450 systems to the generation of reactive oxygen species / S.C. Bondy, S. Naderi // Biochem. Pharmacol. — 1994.— Vol. 48. — P. 155-159.
2. Caro, A.A. Oxidative stress, toxicology, and pharmacology of CYP2E1 / A.A. Caro, A.I. Cederbaum // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. — 2004. — Vol. 44. — P. 27-42.
ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА СОДЕРЖАНИЕ ЦИТОХРОМОВ Р-450 И b5 И АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ПЕЧЕНИ КРЫС
Цудзевич Б.А., Калинин И.В., Петрук Н.А.
Исследовали влияние тяжелых металлов (меди, цинка, кадмия, свинца) на содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов печени крыс. Установлено снижение содержания исследованых цитохромов и уменьшение активности глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в печени крыс при интоксикации.
Ключевые слова: цитохром Р-450 и b5, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа, НАДН, НАДФН, меди сульфат, цинка сульфат, кадмия сульфат, свинец азотнокислый.
INFLUENCE OF HEAVY METALS ON CONTENT CYTOCHROME P-450 AND B5 AND RAT LIVER ENZYMES Tsudzevich B.A., Kalinin I.V., Petruk N.A.
Investigated the effect of heavy metals (copper, zinc, cadmium, lead) on the content of cytochrome P-450 and b5 and the enzyme activity of rat liver. A reduction in the content of the study of cytochromes and the decrease in activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconic dehydrogenase in rat liver during intoxication.
Key words: cytochrome P-450 and b5, glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconic dehydrogenase, NADH, NADPH, copper sulfate, zinc sulfate, cadmium sulfate, lead nitrate.
3. Chen, X.-L. Induction of cytoprotective genes through Nrf2/antioxidant response element pathway: a new therapeutic approach for the treatment of inflammatory diseases / X.-L. Chen, C. Kunsch // Curr. Pharm. Des. — 2004. — Vol. 10. — P. 879891.
4. Kamath S.A., Kummerow F.A., Narayan K.A. A simple method for the isolation of rat liver microsomes // FEBS Letters. —1971. —V.17, No1. —P. 90-92.
5. Omura T., Sato R. The carbon monooxidate-binding pigment of liver microsomes // J. Biol. Chem. —19б4. —V. 239. —P. 23792385.
6. Koop D.R. Inhibition of ethanol-inducible cytochrome P-450 2E1 by 3-amino-1,2,4-triazole // Chem. Res. Toxicol. —1990. —№3. —P. 377-383.
7. Bottomley R. H, Pilot H. C, Potter V. R., Morris H. P. Metabolic adaptations in rat hepatomomas. Reciprocal relationship between threonine dehy-drase and glucose-б-phosphate dehydrogenase // Canc. Res. - 19б3. - Vol. 23, N 1. -P. 400-409.
8. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биологии (под ред. В.Н. Ореховича). —М., 1977. —С. бб-б8.
9. Lowry O.H., Rosebroungh H. J., Farr A. L., RandallR. J. Protein measurement with folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. -Vol. 193. - № 1. - P. 2б5-275.
10. Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень.- К.: Фітосоціоцентр, 2001.-С. 109-152.
11. Snyder, R. Microsomal enzyme induction // Toxicological Sciences. - 2000. - Vol. 55. - P. 233-234.
12. Guengerich, F.P. Cytochrome P450 and chemical toxicology / F.P. Guengerich // Chem. Res. Toxicol. - 2008. - Vol. 21. - P. 70-83.
