CC BY
115. Пат. 47093 Украша, МПК (2009) G01N 33/487. Споаб прогнозування стоматологiчних захворювань / О. В. Деньга, Е. М. Деньга, А. Е. Деньга ; опубл. 11.01.10, Бюл. №1.
6. Ферментативный метод определения дисбиоза полости рта для скрининга про- и пребиотиков [метод. рекомендации] / А. П. Левицкий, О. А. Макаренко, И. А. Селиванская [и др.]. - Киев, 2007. - 22 с.
7. Деньга О. В. Спектроколориметрическая оценка процессов минерализации в твердых тканях зубов / О. В. Деньга // Вюник стоматологи. — 1999. — № 1. — С. 2—4.
Поступила 29.10.14
УДК 616. 314- 085+577.112+577.115+ 616. 314. 18- 002.4
Г. Д. Семенюк, Г. М. Мельничук, д. мед. н., I. З. Остап'як, к. мед. н.
Державний вищий навчальний заклад ,Двано-Франшвський нацюнальний медичний ушверситет", м. 1вано-Франшвськ
ВПЛИВ КОМПЛЕКСНОГО Л1КУВАННЯ НА ПОКАЗНИКИ ОКИСНЮВАЛЬНО1 МОДИФ1КАЦП Б1ЛК1В I АКТИВНОСТ1 АНТИОКСИДАНТНИХ ФЕРМЕНТ1В У ХВОРИХ НА ГЕНЕРАЛ1ЗОВАНИЙ ПАРОДОНТИТ
Обстежено 33 хворих на генералгзований пародонтит (ГП), без супутнгх захворювань, I 28 здорових в1ком в1д 18 до 35 рок1в. Досл1джували показники окиснювально1 модифгкацИ б1лк1в (ОМБ) ргзних фракцш I актив-нгсть ферментгв супероксиддисмутази (СОД) I каталази (КА) у ротовш р1дин1 до лшування, тсля I через 6 м1-сяц1в. У хворих виявлено статистично значуще пгдвищення IнтенсивностI ОМБ на тл1 зниження активностI СОД I КА. Шд впливом комплексного л1кування суттево знижувалися показники ОМБ та пгдвищувалася актив-нгсть СОД I КА. Отримаш результати утримувалися впродовж твроку, що свгдчить про регуляцт про- та антиоксидантних процесгв у хворих на ГП.
Ключовi слова: генералгзований пародонтит, ротова р1дина, показники окиснювально1 модифгкацИ б1лк1в, супероксиддисмутаза, каталаза.
А. Д. Семенюк, Г. М. Мельничук, И. З. Остапяк
Государственное высшее учебное заведение „Ивано-Франковський национальный медицинский университет",
г. Ивано-Франковск
ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСНОГО ЛЕЧЕНИЯ НА ПОКАЗАТЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ И АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ У БОЛЬНЫХ ГЕНЕРАЛИЗИРОВАННЫМ ПАРОДОНТИТОМ
Обследовано 33 больных генерализированным пародонтитом (ГП) и 28 здоровых в возрасте 18-35 лет. Изучали показатели окислительной модификации белков (ОМБ), активность ферментов супероксиддисмута-зы (СОД) и каталазы (КА) в ротовой жидкости до лечения, после и через 6 месяцев. У больных выявлено статистически значимое повышение интенсивности ОМБ всех исследуемых фракций на фоне снижения активности СОД I КА. Под действием комплексного лечения существенно снижались показатели ОМБ и повышалась активность СОД и КА. Полученные результаты удержывались в течении полгода, засвидетельствовав стойкую регуляцию про- и антиоксидантных процессов у больных ГП.
Ключевые слова: генерализированный пародонтит, ротовая жидкость, показатели окислительной модификации белков, супероксиддисмутаза, каталаза.
© Семенюк Г. Д., Мельничук Г. М., Остап 'як I. З., 2014.
«iHHoeawi e aiw.nanw:uviT», № 4, 2014
G. D. Semeniuk, G. M. Melnychuk, I.Z. Ostap'yak
State Higher Educational Institution „Ivano-Frankivsk National Medical University", Ukraine
INFLUENCE OF COMPLEX TREATMENT ON INDICATORS OF OXIDATIVE MODIFICATION OF PROTEINS AND ACTIVITY OF ANTIOXIDANT ENZYMES IN PATIENTS WITH GENERALIZED PERIODONTITIS
The lack of research on the role ofprotein peroxidation in the pathogenesis of generalized periodontitis (GP) and of dynamics of indicators of antioxidant (AO) enzymes activity and of oxidative modifications ofproteins (OMP) in oral fluid of patients with GP cause the relevance of chosen by us direction of research. The aim of the research was the study of influence of developed by us treatment method on the change of indicators of OMP intensity and activity of AO - enzymes in oral fluid ofpatients with GP. The study involved 33 patients with GP of chronic course of I degree development, aged from 18 to 35 years, without acute and chronic diseases of internal organs, and 28 of healthy individuals of the same age. The intensity of OMP and activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CA) was researched. The changes of these indicators were studied before treatment, immediately and 6 months later. The treatment included initial periodontal therapy, local antibiotic, vitamin-mineral complex drug and symbiotic medications for oral use. There was found the statistically significant increase in the OMP intensity of all studied fractions on the background of decreased SOD and CA activity in the patients with GP. Under the influence of treatment in patients significantly decreased the rates of PPO and increased the activity of AO enzymes. Due to the treatment the results were kept for six months, indicating a stable regulation ofpro- and AO processes.
Keywords: Generalized Periodontitis, oral fluid, indicators of oxidative modification of proteins, superoxidedismutase, catalase.
Оксидативному стресу, як результату пору-шення стану динамiчноI фiзюлоriчноI рiвноваги в системi про- i антиоксиданта (АО), вщводять важливу роль у патогенезi генералiзованого па-родонтиту (ГП) [1]. У науковш лiтературi досить повно висвгглеш загальнобюлопчш закономiр-носп розвитку процешв вшьнорадикального оки-снення, зокрема, перекисного окиснення лшщв (ПОЛ), а також IX вплив на формування гшокси, запалення, iмунного конфлшту та ш., що прита-манш багатьом хворобам, у т.ч. i захворюванням пародонта [2, 3]. Проте, лише поодиною досль дження у пародонтологи привертають увагу до ролi перекисного окиснення бшюв (ПОБ) [4], що спричинясться активними формами кисню пара-лельно з процесами ПОЛ та вщграе провщну роль у деструкци клггинних мембран, структур-них i транспортних бшюв [5, 6, 7]. 1нтегративним показником ПОБ (як структурних молекул, так i бюлопчно активних сполук бшково! природи -фермента, гормошв тощо) вважасться рiвень окиснювально! модифшацп бшюв (ОМБ). 1нтен-сивнють ОМБ вважасться досить чутливим маркером визначення оксидативного стресу, оскшь-ки щ показники бшьш стабшьш, шж дieновi кон'югати чи малоновий диальдепд, як утво-рюються в процесi ПОЛ [8, 9]. Вщомо, що на противагу процесам ПОЛ i ПОБ в органiзмi спрацьовуе антиоксидантний захист (АОЗ), який, за даними багатьох дослщниюв, при посиленш пероксидацiI знижуеться, що проявлясться зме-ншенням активностi АО-ферментiв, зокрема, су-пероксиддисмутази (СОД) i каталази (КА) [2, 3, 4, 10, 11].
Недостатня кшьюсть дослiджень ролi ПОБ у
naToreHe3i ГП та динамши показникiв ОМБ i ак-тивностi АО-ферментiв у ротовiй рщиш хворих на ГП пiд впливом лшування, зумовлюють акту-альнiсть обраного нами напрямку дослщження.
Мета. Вивчити вплив розробленого нами способу комплексного лшування ГП i3 викорис-танням синбютика на змiни показникiв штенсив-ностi ОМБ i активностi АО-фермента у ротовш рiдинi хворих на ГП.
MamepiaM i методи. Обстежено 51 особу, вшом вщ 18 до 35 роюв, соматично здорових, серед яких - 33 хворих на ГП хрошчного переб^у I ступеня (група А) i 28 здорових (група N).
Показники штенсивносп ОМБ дослщжували методикою, яка грунтусться на реакцп взаeмодiï окиснених амшокислотних залишкiв бiлкiв iз 2,4-диштрофеншгщразином з утворенням похщ-них 2,4-динпрофеншгщразону, оптичну щшь-нiсть яких визначають на спектрофотометрi [12]. У результат окиснення бiлкiв залежно вiд пере-важання в ï^ молекулах амшокислот нейтрального (валiн, лейцин, iзолейцин та iн.) або основного ^зин, аргiнiн та iн.) характеру утворюються альдегiдо- або кетонопохiднi нейтрального або основного характеру, як мають рiзнi дiапазони спектру поглинання. При довжиш хвилi 356 нм ми визначали альдегщодиштрофеншгщразони, 370 нм - кетонодиштрофеншгщразони нейтрального характеру, 430 нм i 530 нм - вщповщно альдегщодиштрофеншгщразони та кетонодишт-рофенiлгiдразони основного характеру. Актив-нiсть СОД дослщжували за методом Чевари С. и соавт. [13]. Кшьюсне визначення КА здшснюва-ли за методикою Баха А.Н. i Зубковоï С.В. [14].
Хворим групи А проводили комплексне ль
кування, яке включало базову шщальну пародо-нтальну тератю i застосування: для загального лшування -синбютика „Ацидолак" (по 2 саше всередину 2 рази на добу; курс - 10-14 дшв) та вггамшно-мшерального комплексу „Ол^овгг" (по 1 табл. 1 раз на добу; курс - 20 дшв); для мь сцевого лшування - антибактерiального гелю „Метродент" для аплiкацiй на ясна шд шдивщу-ально виготовлену пародонтальну капу (двiчi на добу по 30 хв; курс - 7-14 дшв) та антисептично-го i протизапального препарату „Септофгг^ет" (по 1 табл. 4 рази на добу, тримати в рот до пов-ного розсмоктування; курс - 7-14 дшв) [15]. Об-стеження здшснювали до лшування, пiсля i через 6 мюящв.
Для оцiнки статистично! значущостi рiзницi показникiв у групах у рiзнi термiни спостере-ження використовували Т-критерш Вiлкоксона для залежних вибiрок (Wilcoxon signed rank test), а для порiвняння незалежних вибiрок мiж собою (груп N, A) - критерш Манна-Уiтнi (U-тест). Математичну обробку отриманих даних проводили з використанням програми Microsoft Office Excel 2007 i спецiалiзованого комп'ютерного се-
редовища статистично! обробки даних R (R Core Team (2014)). Опис кшьюсних показниюв представлено у формата медiана (Ме) i штеркварти-льний розмах (25-й (Q1); 75-й (Q3) процентш). Критичне значення рiвня статистично! значущо-стi приймали рiвним 0,05.
Результати до^дження та ix обговорен-ня. Дослщженнями встановлено, що у хворих на ГП хрошчного перебiгу I ступеня розвитку у ро-товiй рiдинi достовiрно пiдвищувалася штенсив-нiсть ОМБ усiх фракцiй (табл. 1). Так, рiвень ОМБ 356 у хворих за показником Ме становив до лшування 0,076 у.о. (0,055; 0,125) i був на 52,0% вищим вщ даних у здорових (р№1А<0,05), а тсля терапп - достовiрно знижувався (р1А-2А<0,001) i став близьким до даних групи N (pN-2А>0,05). Через 6 мiсяцiв досягнутий показник залишався майже таким, як у здорових (pN-3А>0,05) i вiрогiдно вiдрiзнявся вiд iнтенсивностi ОМБ 356 до лшування (piA-3A<0,001). Порiвнян-ням даних, отриманих через твроку i вiдразу ш-сля терапп, статистично значущого зниження рь вня ОМБ 356 не встановлено (р2А-3А>0,05).
Таблиця 1
Термши спостереження
Показники Групи до лiкувaння (1) пiсля лiкувaння (2) через 6 мiсяцiв (3) Т-критерш
N, 0,050
ОМБ 356, n=28 (0,039; 0,064)
у.а 0,076 0,059 0,055 P1a-2a<0,001
A, (0,055; 0,125) (0,040; 0,066) (0,037; 0,067) P1a-3a<0,001
n=33 р^1а<0,05 Pn-2a>0,05 Pn-3a>0,05 P2a-3a>0,05
N, 0,043
ОМБ 370, n=28 (0,036; 0,054)
у.а A, 0,062 0,046 0,046 P1a-2a<0,001
n=33 (0,052; 0,074) (0,039; 0,052) (0,035; 0,051) P1a-3a<0,001
Pn-1a<0,001 Pn-2a>0,05 Pn-3a>0,05 P2a-3a>0,05
N, 0,013
ОМБ 430, n=28 (0,010; 0,017)
у.о. A, 0,033 0,017 0,018 P1a-2a<0,001
n=33 (0,024; 0,041) Pn-1a<0,001 (0,013; 0,020) Pn-2a<0,05 (0,015; 0,022) Pn-3a<0,05 P1a-3a<0,001 P2a-3a>0,05
N, 0,010
ОМБ 530 n=28 (0,004;0,014)
у.а A, 0,017 0,010 0,011 P1a-2a<0,001
n=33 (0,013; 0,027) (0,008; 0,015) (0,009; 0,015) P1a-3a<0,001
Pn-1a<0,001 Pn-2a>0,05 Pn-3a>0,05 P2a-3a>0,05
Зм1ни 1нтенсивност1 ОМБ у ротовш р1дин1 хворих на ГП шд впливом комплексного лжування (Ме (Q1; Q3))
Прим i тка : вказана BiporiAmcTb рiзницi: pN - до показника групи N; р1А - до показника групи А до лжування; р2А - до показника групи А тсля лжування; р3А - до показника групи А через 6 мюящв тсля лжування.
Таблиця 2
Змши активносп СОД i КА у ротовш рщиш хворих на ГП шд впливом комплексного лiкування
( Ме (01; 03))
Термши спостереження
Показники Групи до лжування (1) тсля лжування (2) через 6 тсящв (3) Т-критерш
N 49,00
СОД, (45,75; 52,25)
МЕ/мг A 41,00 48,00 48,00 PlA-2A<0,001
(38,00; 45,00) PN-1A<0,001 (45,00; 53,00) PN-2A>0,05 (46,00; 51,00) PN-3A>0,05 PlA-3A<0,001 P2A-3A >0,05
N 6,19
КА, (5,73; 7,26)
у.°. A 4,80 6,46 6,24 ^^<0,001
(4,15; 5,45) (5,82; 6,80) (5,76; 6,61) 3А<0,001
р№^<0,001 PN-2A>0,05 PN-3A>0,05 P2A-3A<0,05
Прим i тка : див. примiтку до табл. 1.
За показником Ме штенсивнють ОМБ 370 у ротовш рщиш хворих на ГП становила до лшу-вання 0,062 у.о. (0,052; 0,074) i була на 44,19 % вищою, шж у здорових осiб ^.^<0,001). Вна-слiдок комплексно! терапп показник ОМБ 370 зменшувався практично до рiвня у здорових (р№ 2а>0,05; p1a-2a<0,001) i через твроку не зазнавав нiяких змш (Pn-3a>0,05; pla-зa<0,001; p2a-зa>0,05).
Iнтенсивнiсть ОМБ 430 у ротовш рщиш хворих на ГП до лшування становила 0,033 у.о. (0,024; 0,041) i була у 2,54 раза бшьшою, шж у здорових оаб ^.^<0,001). Пiд впливом терапiI цей показник знижувався вщразу на 48,48 % 2А<0,001), але даних у здорових не досягав (р№ 2А<0,05). Через 6 мiсяцiв рiвень цieI фракцiI ОМБ вiрогiдно в^^знявся вiд показника до лiкування (^-^<0,001), зберiгаючи достовiрну рiзницю з показником групи N (pN-3A<0,05) i недостовiрну -з даними, отриманими вщразу тсля комплексно!' терапiI (р2А-3А>0,05), що свiдчить про збереження досягнутого лшуванням результату.
У ротовiй рiдинi хворих на ГП штенсивнють ОМБ 530 за показником Ме становила 0,017 у.о. (0,013; 0,027) i була на 70 % вищою вщ даних у здорових ^.^<0,001). Завдяки лшуванню рiвень ОМБ 530 досягнув такого у здорових (р№ 2А>0,05), вiрогiдно вiдрiзняючись вiд вихiдних даних (р1^2А<0,001). Отриманий вiдразу пiсля терапи показник ОМБ 530 залишався практично на тому ж рiвнi i через 6 мiсяцiв (pN-3A>0,05; p1A_ 3а<0,001; p2a-зa>0,05).
Отже, комплексне лшування сприяло зни-женню iнтенсивностi ОМБ ушх фракцiй до рiвня у здорових (за виключенням показника ОМБ при довжиш хвилi 430 нм) i утриманню досягнутого протягом пiвроку.
У хворих на ГП тд впливом лшування акти-внiсть AО-ферментiв СОД i КА у ротовiй рiдинi
також зазнавала змш (табл. 2). Зокрема, за показником Ме активнють СОД у хворих становила 41,00 МЕ/мг (38,00; 45,00) i була на 17,33 % ни-жчою вщ тако1' у здорових ^.^<0,001), а пiсля комплексно!' терапi!' практично досягала рiвня у здорових ф№2А>0,05), достовiрно вiдрiзняючись вiд вихiдного показника (р1^2А<0,001). Через 6 мiсяцiв активнють фермента залишалася на тому ж рiвнi, що й пiсля лшування (pN-зA>0,05; p2A-3А>0,05), а рiзниця з даними до терапiI була сут-тевою (plA-зA<0,001).
Aктивнiсть КА за показником Ме у ротовш рщиш хворих на ГП становила 4,80 у.о. (4,15; 5,45) i була достовiрно нижчою вщ тако].' у здорових на 22,4% ^,^<0,001). Комплексна тера-пiя сприяла рiзкому зростанню активностi цього фермента, отримаш данi були дещо вищими, нiж у здорових (pN-2A>0,05), а рiзниця з даними до ль кування залишалася статистично значущою (р^. 2А<0,001). Через 6 мiсяцiв активнють КА невiро-гiдно вiдрiзнялася вщ показника у здорових (р№ 3А>0,05) i вiрогiдно - вiд показника до лшування (p1A-3A<0,001), проте, порiвняння цих даних iз такими вiдразу пiсля лiкування показало статистично достовiрну рiзницю (р2А-3А<0,05). При цьому отриманий через твроку результат був вищим, шж у здорових.
Отже, динамша активностi СОД i КА пiд впливом комплексного лшування свiдчить на ко-ристь застосованого способу лшування.
Aналiзуючи отриманi дат, хочемо зазначи-ти, що у хворих на ГП спостертаються значш вь дхилення у показниках вшьнорадикального оки-снення та АОЗ: на тлi iстотного пiдвищення рiв-ня ОМБ усiх дослiджуваних фракцiй виявлено достовiрне зниження активностi СОД i КА. Це свiдчить про наявнють у хворих на ГП дисбалансу у системi ПОБ-АОЗ та узгоджуеться з даними
шших науковщв [4, 10, 11]. Лшування хворих дозволило нормалiзувати рiвень ОМБ 356, ОМБ 370 i ОМБ 530 та активнють AО-ферментiв, зна-чно знизити штенсивнють ОМБ 430 i утримати досягнуте 6 мюящв, що дозволяе констатувати: шщальна пародонтальна терапiя, поеднана iз за-стосованим нами мiсцевим ^з використанням препаратiв „Метродент" i „Септофгг Дiет") i за-гальним ^з призначенням препаратiв „Ол^овгг" i „Ацидолак") лiкуванням, позитивно впливае на регулящю про- i АО процесiв. Це вщбуваеться, ймовiрно, завдяки тому, що комплексною тераш-ею вдалося досягти контролю над запаленням у тканинах пародонта, регуляци специфiчного i неспецифiчного антибактерiального захисту та метаболiчних процесiв як у тканинах пародонта, так i в органiзмi загалом.
Висновки. 1. У ротовш рiдинi хворих на ГП хрошчного перебiгу I ступеня розвитку виявлено статистично значуще тдвищення штенсивносп ОМБ усiх дослiджуваних фракцiй на тлi знижен-ня активностi фермента СОД i КА.
2. Щд впливом комплексного лiкування у хворих суттево зменшувалися показники ПОБ та збшьшувалася активнiсть AО-ферментiв.
3. Завдяки лшуванню отриманi результати утримувалися впродовж твроку, що свiдчить про регуляцiю про- та АО процесiв у хворих на ГП i дозволяе рекомендувати розроблений нами спошб лiкування для широкого впровадження в практику.
Перспективою подальших дослщжень е ви-вчення динамши показникiв ОМБ, активностi СОД i КА у ротовiй рiдинi хворих на ГП при ви-користанш загальноприйнятих способiв лшуван-ня.
Список лтератури
1. Горбачёва И. А. Окислительный стресс и его особенности у больных генерализованным пародонтитом на фоне заболеваний внутренних органов / И. А. Горбачева, А. И. Кирсанов, Л. Ю. Орехова // Пародонтология. - 2002. -№4. - С. 3-7.
2. Основы шляхи утворення активних форм кисню в норм1 та при шем1чних патолопях (Огляд лггератури) / Ю. I. Губський, I. Ф. Белетчев, С. I. Коваленко [та ш.] // Современные проблемы токсикологии. - 2004. - № 2. - С. 815.
3. Billion Pedro. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? / Pedro Bullon, N. Newman Hubert, Maurizio Battino // Periodontology 2000. - 2014. -February, Vol. 64 (1). - P. 139-153.
4. Мельничук А. С. Показники окисно! модифжацп бшюв та антиоксидантного захисту у ротовш рiдинi хворих на генералiзований пародонтит з частковою втратою 3y6iB / А. С. Мельничук, М. М. Рожко, Г. М. Ерстенюк // Новини стоматологи. - 2012. - №4. - С. 96-98.
5. Активы форми кисню та !х роль у метаболгм клггин / М. I. Колiсник, Г. В. Колюник, G. Нiдзюлка [та ш.] // Бiологiя тварин. - 2009. - Т. 11, № 1/2. - С. 59-70.
6. Чеснокова Н. П. Молекулярно-клеточные механизмы индукции свободнорадикального окисления в условиях патологии / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Современные проблемы науки и образования. -2006. - № 6 - С. 21-26.
7. Effects of obesity on gingival oxidative stress in a rat model / T. Tomofuji, T. Yamamoto, N. Tamaki [et al.] // J Periodontal. - 2009. - № 80. - P. 1324-1329.
8. KapiMOB 13 Окисна модифжащя бшюв i перекис-не окислення лшвдв у розвитку метаболiчноl штоксикацп при патологи / I.3. Карiмов // Лабораторна дiагностика. -2005. - №1. - С. 7-19.
9. Poppek D. Proteasomaldefence of oxidative protein modifications / D. Poppek, T. Grune // Antioxidants y Redox Signaling. - 2006. - Jenuary/February, Vol. 8 (1-2). - P. 173184.
10. Мельничук Г. М. Стан пероксидного окиснення лiпiдiв та антиоксидантно! забезпеченостi органiзму хворих на генералгзований пародонтит / Г. М. Мельничук, В. Ю. Катеринюк // Вюник стоматологи. - 2007. - №4. - С. 141142.
11. Семенюк Г. Д. Стан штенсивносп окиснювально! модифжаци бiлкiв та активностi антиоксидантних ферментiв у ротовiй рiдинi хворих на генералiзований пародонтит / Г. Д. Семенюк, Г. М. Мельничук, Г. М. Ерстенюк // Архiв клшчно! медицини. - 2013. - №2. - С. 68-71.
12. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения / Е. Е. Дубинина, С. О. Бурмистров, Д. А. Ходов [и др.] // Вопр. мед. химии. -1995. - Т.41, № 1. - С. 156-158.
13. Чевари C. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте // С. Чевари, Т. Андял, Я. Штренгер // Лабораторное дело. - 1991. - №1 - С. 9-13.
14. Бабенко Г. О. Бюсфера, антропогенез i здоров'я / Г.О. Бабенко. - 1вано-Франювськ, 1999. - 204 с.
15. Пат. на корисну модель №76258, МПК А61С 7/00. Споаб комплексного лжування хворих на генералiзований пародонтит / Семенюк Г.Д., Мельничук Г.М., Мельничук С.С.; № u2012 07851, заявл. 26.06.2012.; опубл. 25.12.2012, Бюл. № 24.
Надшшла 01.12.14
