CC BY
20
ш
М1ЖНАРОДНИЙ НЕВРОЛОГ1ЧНИЙ ЖУРНАЛ
INTERNATIONAL NEUROLOGICAL JOURNAL |
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НЕВРОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ ОРИГШАЛЬШ ДОСЛЩЖЕННЯ /ORIGINAL RESEARCHES/
УДК617.832-001-089.843-003.93:616-74: [615.46+611.813-018.1]: 57.085.25:541.1/.49
DO110.22141/2224-0713.6.84.2016.83117
ЦИМБАЛЮКВ.1.1, МЕДВЕДЕВ В.В.2, РИБАЧУКO.A.3-5, КОЗЯВК1Н В.1.4, ДРАГУНЦОВА Н.Г.1 1ДУ «1нститутнейрох!рурп/¡м. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра/ни», м. Ки/в, Укра/на 2Нац!ональний медичний унверситет ¡мен! О.О. Богомольця, м. Ки/в, Укра/на 3ДУ «1нститут генетично/ та регенеративно/ медицини НАМН Укра/ни», м. Ки/в, Укра/на 4МЬкнародна кл!н!ка в!дновного лкування, м. Трускавець, Укра/на 51нститут фмолоп/¡мен! О.О. Богомольця НАН Укра/ни, м. Ки/в, Укра/на
ВПЛИВ ¡МПЛАНТАЦП NEUROGEL™ В АСОЦАЦМ 3 КСЕНОГЕННИМИ СТОВБУРОВИМИ КЛАНАМИ KiCTKOBOrO МО3КУ НА В1ДНОВЛЕННЯ РУХОВО1' ФУНКЦИ ЗАДНЬОТ КШВКИ ЩУРА ПЮЛЯ СПНАЛЬНОТ ТРАВМИ
Резюме. Мета — до^дити вплив iMrnaHma^i NeuroGel™ в асощаци 3i стовбуровими клтинами ккткового мозку (СККМ) на вiдновленнярухово'1'функци заднх ктщвок щура тсля експериментальноi травми спинного мозку. Матергали та методи. Тварини — 6mi безпородш щури-самц (5мс, 250 г); групи: 1-ша — травма спинного мозку (n = 16); 2-га — травма спинного мозку + гомототчна iмплантацiя фрагмента NeuroGel™ (n = 20); 3-тя — травма спинного мозку + гомототчна iмплантацiя фрагмента NeuroGel™, асоцшованого з ксеногенними СККМ мишi (n = 16). Модель травми — лiвобiчний перетин половини спинного мозку нарiвнi Т11; термт спостереження — 28тиж, оцтка показника функци задньоi iпсилатеральноi ктщвки (ПФ З1К) — за шкалою Basso — Beattie — Bresnahan. Результати. Ксенотрансплантащя СККМ у комплека з NeuroGel™подовжуе в чаа, однак зменшуе iнтенсивнiсть приросту ПФ З1Ку гострому таранньому перюдах травматичного процесу, пролонгуе фазу значимого збыьшення ПФ З1К до 6-го мшяця включно. У груш 1 значуще (р < 0,05) збльшення ПФ З1Кспостерiгали лише протягом 3-4-го тижня, у групi 2 — протягом 1-2-го та 5— 6-го тижня експерименту, у грут 3 — протягом 1-2-го, 4-5-го та 8-24-го тижня. Станом на 28-й тиждень ПФ З1Ку груп 1 становив 1,6 ± 0,5 бала, у груп 2 — 8,4 ± 0,9 бала, у груп 3 — 11,0 ± 1,5 бала за шкалою Basso — Beattie — Bresnahan. Значущу рЬзницю ПФ З1Кмiж групами 2 та 1 вiдмiчали протягом 2-28-го тижня (р < 0,001), мiж групами 3 та 1 — протягом 1-28-го тижня (р < 0,02). Максимальну р1зницю ПФ З1К мiж групами 3 та 2 на користь першо1' вiдмiчали на 24-му тижнi (р = 0,055). Висновок. Ксенотрансплантащя СККМ змiнюе динамiку вiдновлення рухово'1' функци паретично'1' кiнцiвки за умови iмплантацii NeuroGel™, обумовлюе тенденщю до потенщювання позитивного впливу матриксу на перебiг сптально'г' травми.
Ключовг слова: травма спинного мозку, вiдновнелкування, тканинна нейротженер1я, штучний тканинний матрикс, стовбуровi клтини ксткового мозку.
Адреса для листування з авторами: Цимбалюк Вмалш 1ванович
ДУ «1нститут нейроирурги iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши»,
вул. Платона Майбороди, 32, м. Кив, 04050, Украша E-mail: [email protected]
© Цимбалюк В.1., Медведев В.В., Рибачук О.А., Козявин В.1.,
Драгунцова Н.Г., 2016 © «Мiжнародний невролопчний журнал», 2016 © Заславський О.Ю., 2016
Вступ
Вщновлення функцй спинного мозку е стратег1чною б1омедичною проблемою, вир1шення яко! пов'язують Í3 вдосконаленням засоб1в тканинно! шженери [1—4], б1он1чного протезування [5—7], ф1зично! реабштаци [8—12], х1рург1чних метод1в трансформаци периферш-но! ланки рухово! системи та використанням систем хрошчно! електростимуляцй' [13]. Трансплантацшш нейро1нженерн1 втручання, що використовують для в1дновлення функцй спинного мозку, з урахуванням ю-торичного контексту можна умовно роздтити на калька покол1нь: I — трансплантащя в зону ураження спинного мозку цшьних фрагмент1в тканини (тканинна нейротрансплантащя, у тому числ1 — периферичних нерв1в) [14, 15], II — 1мплантащя аморфних пористих матрикшв р1зного походження [16—20], III — 1мп-лантац1я аморфних пористих матрикс1в в асощацп з одним чи кшькома кл1тинними фенотипами [1, 3], IV — 1мплантащя просторово впорядкованих ма-трикс1в [21], у тому числ1 асоц1йованих 1з незртими кл1тинами, V — 1мплантац1я матрикс1в четвертого покол1ння з внутр1шн1ми чи зовшшшми засобами векторизацй' аксонального росту, наприклад град1ен-тами атрактант1в чи репеленпв, ковалентно з'еднаних 1з матриксом, град1ентами щ1льност1 незр1лих кл1тин у середиш матриксу, засобами хрон1чного введення чи продукцй' атрактант1в каудальн1ше вщ зони травми (за-соби не розроблеш; т1, що певною м1рою в1дпов1дають вказаному принципу — поодиноы [22—25]).
Б1льш1сть сучасних роб1т спрямоваш на пошук за-соб1в вщновлення супрасшнальних проекц1й на мото-нейрони, розташоваш нижче травми; в1дновлення само! популяцй' мотонейрон1в важливе у випадку локал1зацй' травми на р1вн1 шийного чи поперечного потовщення — зон шерваци к1нц1вок та д1афрагми [26—28].
На сьогодш тканинна нейро1нженер1я перебувае в сташ вичерпання потенц1алу III поколшня, розробки та апробацй' IV поколшня перел1чених нейрошженер-них засоб1в. До перел1ку найперспективн1ших вид1в незртих кл1тин, що трансплантують у комплекс з бю-сум1сними матриксами при травм1 спинного мозку, вщ-носять мезенх1мальш стовбуров1 кл1тини (МСК) р1зного походження [29—31], багатогранний позитивний ефект яких [32] пов'язують 1з патотропним хомшгом [32], р1дк1сним in vivo явищем нейрогенного трансдиферен-ц1ювання [14, 32—34], з1 здатн1стю до злиття з клггинами рецишентно! тканини [35], мкровезикулярним [36, 37], факторним [32] чи контактними [32, 37] впливами. При цьому трансплантащя МСК (у зону травми, штрате-кально, штравентрикулярно чи внутр1шньовенно) без використання супутшх нейро1нженерних засоб1в покра-щуе функцш задн1х кшщвок щура на модел1 забиття чи стиснення спинного мозку в середньому на 3,9 бала за шкалою D.M. Basso, M.S. Beattie та J.C. Bresnahan (ВВВ), тобто на 20 % в1д обсягу функцй' штактно! задньо! кшщвки [32]. Анал1з деяких експериментальних робп" такого виду [38] дозволяе стверджувати, що ефектив-н1сть трансплантаци МСК у вигляд1 суспензп е довол1 дискус1йною, для И вериф1каци використовують тен-
денцiйно витонченi, чутливiшi методи функционального тестування, оскiльки звична шкала ВВВ не дозволяе виявити значущу перевагу.
У данш роботi наведено результати дослщження ефективносп втручання III поколшня — iмплантацií фрагментiв аморфного макропористого бюсумюного матриксу NeuroGel™ [16—19, 39, 40], асоцшованого з ксеногенними стовбуровими клггинами кiсткового мозку (СККМ), — сукупносп гемопоетичних та стро-мальних стовбурових клiтин.
Матерiали та методи
Дослщження виконано з дотриманням чинних норм бюетики на бших безпородних щурах-самцях (вiварil 1нституту фiзiологil iменi О.О. Богомольця НАН Украши та ДУ «1нститут нейрохiрургií iменi акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши») вшом 5 мiс., масою 250 г, утримуваних у стандартних умовах. Сформовано 3 експериментальнi групи: контроль — травма спинного мозку (n = 16); «нейрогель» — травма спинного мозку + гомотошчна iмплантацiя фрагмента NeuroGel™ (n = 20); «нейрогель + СККМ» — травма спинного мозку + гомотошчна iмплантацiя фрагмента NeuroGel™, асоцшованого iз СККМ мишi (n = 16).
Макропористий гщрогель NeuroGel™ (полЦ^(2-гiдроксипропiл)-метакриламiд]) е комерцiйним препаратом, синтезований у лаборатори E. Pinet (FISO Technologies Inc., Квебек, Канада) шляхом гетеро-генно'1 полiмеризацií та асощаци, мае пори розмiром 2-300 нм [17].
СККМ отримували вщ мишей-самщв лiнií FVB-Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J (трансгенних за геном зеленого бiлка флуорисценци) вiком 3 мiс., масою 40 г, шляхом вимивання зi стегнових исток середовищем RPMI-1640 (Sigma, США). 1з цiею метою в глибоко анестезовано'1 тварини (внутрiшньоочеревинне введення сумiшi роз-чинiв ксилазину (Sedazin, Biowet, Польща; 15 мг/кг) та кетамшу (Calypsol, «Гедеон Рiхтер А.О.», Угорщина; 70 мг/кг)) видаляли обидвi стегновi кiстки шляхом перетину в дтянках колiнного та кульшового суглобiв, очищали вщ м'яких тканин, помiщали в 70 % розчин етилового спирту, обидва епiфiзарнi кiнцi кожно'1 истки стинали, пiд тиском через дiафiз за допомогою iнсулiно-вого шприца пропускали рщке середовище RPMI-1640, вимиваючи вмiст порожнини кiстки. Для пщрахунку кiлькостi клiтин об'емну одиницю отриманого змиву змшували з 3% розчином оцтово'1 кислоти в пропорц11'
1 : 20 i переглядали в камерi Горяева. Отриману суспензiю вносили в культуральний флакон iз площею поверхнi 25 см2 або на чашку Петрi дiаметром 60 мм, загальна к1ль-кiсть клiтин становила не менше 10 млн. У подальшому клiтини висiвали по 4 • 105 клiтин/см2 та культивували протягом 2 тижнiв, змiнюючи поживне середовище кожш 2-3 доби, в умовах зволоженого повпря з 5% СО2 при температурi 37 °С. Перший пасаж проводили при 80% конфлуентносп моношару, знiмаючи клiтини за допомогою 0,02% розчину трипсину/версену (Sigma, США), та пересаджували 1х у новi флакони зi щiльнiстю
2 • 104 клiтин/см2. СККМ на другий пасаж висаджували
в 4^yHKOBi планшети по 3 • 104 у кожну лунку та куль-тивували протягом 7 даб. Частку життездатних клiтин у суспензи' визначали на лазерному цитофлюориметрь сортерi BD FACSAria (Becton Dickinson, США) за рiвнем накопичення в клггиш з денатурованою, фрагментова-ною чи десшрал1зованою ДНК флуоресцентного ДНК-зонда 7-амшоактиномщину. Вiдсоток життездатних клiтин у культурi становив 94,1 ± 0,6 %.
СККМ культивували за стандартних умов у сере-довищi, що мiстило 42,5 % RPMI-1640 (Sigma, США), 42,5 % DMEM, 15 % FBS, 2 мМ L-глутамшу, 1 нг/мл основного фактора росту фiбробластiв (Sigma, США). Фенотипування клгган за маркерами CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD117 проводили з використан-ням моноклональних антиттл до мембранних антиге-нiв мишi, мiчених флуорохромами (Becton Dickinson, США). Клггани культури дослщжували на здатнiсть до направленого диференцшвання в адипогенному та остеогенному напрямках. Адипогенне диференцш-вання включало культивування в середовищi DMEM iз високим вмiстом глюкози (4,5 г/л; Sigma, США), 5% конячо'1 сироватки та 10% ембрюнально'1 телячо'1 сироватки (Sigma, США), 1 мкл дексаметазону (Sigma, США), 200 мкл шдометацину (Sigma, США), 500 мкл iзо-бутилметилксантину (Sigma, США) та 5 мкг/мл iнсулiну (Sigma, США); середовище змiнювали тричi на тиждень; тривалють диференцiювання — 14 дiб. Середовище для остеогенного диференцiювання включало: DMEM iз низьким вмiстом глюкози (1 г/л; Sigma, США), 10 % ембрюнально'1 телячо'1 сироватки (Sigma, США), 100 нМ дексаметазону (Sigma, США), 10 мМ Р-глщерофосфату (Sigma, США) та 50 мкг/мл аскорбат-2-фосфату (Sigma, США). Середовище змшювали ^mi на тиждень; трива-лiсть диференцшвання — 30 даб. За вивченими ознаками отримана культура вщповщала мшмальним критерiям культури СККМ.
Через 5 дiб культивування у середовище укладали фрагменти NeuroGelTM розмiром 16 мм3, культивували протягом 10 даб, до моменту трансплантаци. Фрагменти розтинали на рiвновеликi частини розмiром 2 мм3, одну з яких фшсували для iмуногiстохiмiчно'i верифiкацii асо-цiйованих кштин у товщi матриксу, iншi використову-вали для трансплантаци'. За даними iмуногiстохiмiчного дослiдження, СККМ добре проникають у товщу гелю, колонiзують наявш в ньому пори, проявляють ознаки активно! життедiяльностi та диференцiювання.
Модель стнально! травми — лiвобiчне перешчення половини спинного мозку на рiвнi Tjj [41]. Оперативнi втручання здшснювали в умовах загального знеболюван-ня (див. вище), пiсля нанесення травми спинного мозку в тварин групи «нейрогель + СККМ» у рану спинного мозку iмплантували фрагмент NeuroGelTM, асоцiйований iз СККМ, розмiром 2 мм3, у тварин групи «нейрогель» — фрагмент нативного NeuroGelTM аналопчного розмiру. У тварин усiх груп вiкно доступу в хребтовий канал при-кривали фрагментом пiдшкiрно'i фасци', м'якi тканини та шкiру з'еднували крученими полiамiдними хiрургiч-ними нитками (ум. № 1, ПАТ «Кш'вммволокно») у два ряди вузлових швiв, дтянку рани обробляли 5% спирто-
вим розчином йоду. У задню шийну дiлянку пiдшкiрно вводили розчин бщилшу-5 (ПАТ «Кш'вмедпрепарат»; ~150-200 тис. ОД на 1 тварину), внутршньоочеревин-но — розчин дексаметазону 6 мг/кг (КККЛ, Словешя). Пiсля вказаних маншуляцш тварин протягом 2—4 годин утримували в примiщеннi з шдвищеною температурою повiтря (30 °С), надалi — у клiтках по 3—6 особин при середнш температурi 21—24 °С.
Показник функцп (ПФ) задньо'' iпсилатеральноi' щодо зони травми кшщвки (З1К) визначали згiдно зi шкалою ВВВ [41, 42] протягом перших 2 мюящв — наприкшщ кожного тижня, у подальшому — наприкшщ кожного мiсяця.
Тривалiсть спостереження для ушх тварин становила 28 тижшв; виведення тварин з експерименту здшснювали шляхом передозування вказаних вище наркотичних препарапв.
Статистичну обробку даних здiйснювали за допо-могою програмного пакета Statistica 10.0, для встанов-лення вiрогiдностi рiзницi середшх значень ПФ З1К мiж групами використовували И-тест Манна — Уггш, ре-зультати оцiнки вiрогiдностi подавали у виглядi значень показника р iз звичним ''х трактуванням. Вiрогiднiсть змiн середнiх значень ПФ З1К у межах групи впродовж експерименту ощнювали за Вiлкоксоном.
Результати та Тх обговорення
Iмплaнтaцiя NeuroGelTM станом на 28-й тиждень експерименту призводить до формування тдгруп у роз-подiлi значень ПФ З1К iз квaзiнормaльним розподiлом у нaйбiльшiй iз них (рис. 1а, б); iмплaнтaцiя NeuroGelTM у комплексi з СККМ не нормaлiзуe розподiл ПФ З1К (рис. 1в).
Для динaмiки ПФ З1К, середнього по груш контролю (рис. 2), характерна наявнють двох фаз: протягом 1-го мюяця спостеркали збiльшення ПФ З1К до 1,7 ± 0,5 бала за ВВВ (прирют вiрогiдний упродовж 3-го тижня, р < 0,01 порiвняно зi значеннями наприкшщ 1-го та 2-го тижшв), рiвновеликий невiрогiдний регрес протягом 5-8-го тижня, повторне збтьшення протягом 12-16-го тижня (р < 0,05 порiвняно зi значенням на 8-му та 16-му тижнях) та ста-бiлiзaцiю. Станом на 28-й тиждень експерименту ПФ З1К становив 1,6 ± 0,5 бала за ВВВ, що пщ час локомоцй по го-ризонтальнш поверхнi вiдповiдae нaявностi поширених румв лише в одному iз суглобiв З1К за нaявностi слабких румв у ще одному суглобi З1К [41, 42].
Для динaмiки ПФ З1К, середнього по групi «нейрогель» (рис. 2), теж характерна наявшсть двох фаз: протягом 1-3-го тижня спостер^али значуще (р < 0,001) збiльшення, що до кшця 5-го тижня част-ково швелювалося (р > 0,05); протягом 6-12-го тижня спостерiгaли повторне збiльшення (значуще протягом 7-8-го тижня, р < 0,05), яке з 16-го тижня змшювалося стабшзащею. ПФ З1К станом на 28-й тиждень становив 8,4 ± 0,9 бала за ВВВ (р < 10-4 порiвняно з групою контролю), що шд час локомоцй' по горизонтaльнiй поверхш вiдповiдae нaявностi крокових синергiй З1К пiдошвою вниз (плантарна установка) без шдтриму-вання маси тiлa [41, 42].
Двофазнють е властивою ознакою також i для ПФ З1К, середнього по груш «нейрогель + СККМ»: перша фаза тривае протягом 1-2-го тижня, друга — протягом 3-28-го тижня. Протягом 2-го тижня спостериали най-iнтенсивнiший значущий прирiст ПФ З1К (з 2,5 ± 0,5 до 5,7 ± 1,0 бала за ВВВ, р = 0,001), протягом 4-5-го тижня — менш штенсивне, проте значуще збiльшення (р = 0,014; р = 0,002), протягом 6-7-го тижня — не-вiрогiдне збiльшення, протягом 8-24-го — поступове значуще збтьшення ПФ З1К до 11,0 ± 1,5 бала за ВВВ (р < 0,05). Значення ПФ З1К станом на 28-й тиждень вiдповiдае руховiй активностi, при якш тварина при русi по горизонтально поверхнi часто або постшно (> 50 %
а)
Контроль, 24 тиж.
10
б)
.0
J
Ii 5
t 4
i 3 сх
I 2
ё1 ■2
£ 0
Фунщя 31 К, бали за ВВВ Нейрогель, 24 тиж.
i-JLL
0123456789 10111213141516 Функц1я 31 К, бали за ВВВ
в)
Нейрогель + СККМ, 24 тиж.
1
1ГЪп пШ
0123456789 101112131415161718 Функц1я 31 К, бапи за ВВВ
Рисунок 1. Розподл значень показника функцИ З1К в експериментальних групах на 28-му тижнi спостереження
Прим1тка: у випадку нецлого значення ПФ З1К тварину зараховували до обох сум1жних цлих значень.
часу) пщтримуе масу тта, наявна плантарна постановка стопи, однак координашя крокового ритму передшх i задшх кшщвок втсутня [41, 42].
Значущою особливютю динамiки ПФ З1К у груш «нейрогель + СККМ» е лшшний характер збтьшення як протягом першо!, так i протягом друго! фази, швидтсть приросту протягом друго! фази стала, втричi поступаеться швидкостi приросту, характернш для першо! фази.
Значущу рiзницю ПФ З1К мiж групами «нейрогель» та «контроль» втачали протягом 2-28-го тижня (р < 4*10-5), мiж групами «нейрогель + СККМ» та контролю — протягом 1-28-го тижня (р < 0,02). Максимальну фактичну рiзницю мiж групами «нейрогель + СККМ» та «нейрогель» на користь першо! втачали на 24-му тижш (р = 0,055).
Для висунення прийнятних припущень щодо меха-нiзмiв змiни впливу iмплантацi! NeuroGel™ на перебiг сшнально! травм за наявностi ксеногенних СККМ слщ ураховувати, що будь-який клгганний нейротран-сплантат, зокрема мезенхiмально! генеалоги, е тригером низки iмунних реакцш, потенцiюе i подовжуе тканинне запалення в перифокальнiй зонi [43—45], причому результат таких реакцш щодо рецитентно! тканини спинного мозку неоднозначний. Позитивний ефект СККМ пов'язують з !х здатнiстю модулювати iмуннi реакцн в зонi травми шляхом продукци низки цитокiнiв, акти-вувати антиоксидантш системи (глутатiонасоцiйованих ферментiв, каталази та супероксиддисмутази) клiтин перифокально! зони, чинити захисний вплив на аксони, потенцшвати !х спраутинг та мiелiнiзацiю [46]. З ура-хуванням того, що NeuroGel™ чинить подiбний вплив на переби спiнально! травми, що включае обмеження травматично! геморагй', запальних реакцiй, активацiю цитопротекторних систем, зокрема експресш бiлкiв теплового шоку [40], потенцшвання спраутингу та росту нервових волокон [17, 19], видаеться обГрунтованим висновок щодо синерги обох нейрошженерних засобiв за сумiсним !х застосуванням. Для детального вивчення механiзмiв взаемодл необхiднi подальшi дослiдження iз залученням електрофiзiологiчного, iмуногiстохiмiч-ного та молекулярно-генетичного методiв.
m m
OD
со «
s Ц
го ю
bi
00
к ' j
^
1 ©
14 12 10
S 4
■ Контроль Нейрогель -Нейрогель + СККМ
1 2 3 4 5 6 7 8 12 16 20 24 28 Тривалють спостереження, тижы
Рисунок 2. Динамка ПФ З1К у р/зних експериментальних групах протягом перюду спостереження (пояснення в текстi)
8
6
2
0
Висновки
1. Ксенотрансплантащя СККМ у комплекс з NeuroGel™ подовжуе в 4aci, однак зменшуе штен-сивнiсть приросту ПФ З1К у гострому та ранньому перь одах травматичного процесу, пролонгуе фазу значимого збтьшення рухово1 функцй' до 6-го мiсяця включно.
2. Незважаючи на подовження фази значущого збiльшeння, станом на 28-й тиждень експерименту ПФ З1К групи «нейрогель + СККМ» сягав 11 батв за ВВВ, нeвipогiдно переважаючи показник групи «нейрогель» на 2,6 бала за ВВВ.
3. СККМ загалом змшюе динамiку вiдновлeння рухово! функцй' паретично! кiнцiвки за умови iмплан-тацй' NeuroGel™, формуе тенденцш до потeнцiювання позитивного впливу апробованого матриксу на переби спiнальноï травми.
Список лiтератури
1. Hydrogels and cell based therapies in spinal cord injury regeneration [Text]/ R.C. Assunçao-Silva et al. // Stem Cells International. - 2015. - Vol. 2015, Article 948040. - P. 1-24.
2. Siebert J.R. Biomaterial approaches to enhancing neuroresto-ration after spinal cord injury: strategies for overcoming inherent biological obstacles [Text]/ J.R. Siebert, A.M. Eade, D.J. Osterhout// BioMed Res. Int. - 2015. - Vol. 2015, Article 752572. - P. 1-20.
3. Tsintou M. Advances in regenerative therapies for spinal cord injury: a biomaterials approach [Text] / M. Tsintou, K. Dalamag-kas, A.M. Seifalian // Neural. Regen. Res. — 2015. — Vol. 10, № 5. - P. 726-742.
4. Using extracellular matrix for regenerative medicine in the spinal cord [Text]/ Volpato F.Z. et al. // Biomaterials. — 2013. — Vol. 34, № 21. - P. 4945-4955.
5. Gait speed using powered robotic exoskeletons after spinal cord injury: a systematic review and correlational study / D.R. Louie, J.J. Eng, T. Lam, SCIRE Research Team //J. Neuroeng. Rehabil. — 2015. - Vol. 12, Article 82. - P. 1-10.
6. Control of an ambulatory exoskeleton with a brain-machine interface for spinal cord injury gait rehabilitation / E. Lopez-Larraz, et al. //Front. Neurosci. — 2016. — Vol. 10, Article 359. — P. 1-15.
7. Miller L.E. Clinical effectiveness and safety of powered exoskeleton-assisted walking in patients with spinal cord injury: systematic review with metaanalysis/L.E. Miller, A.K. Zimmermann, W.G. Herbert//Med. Devices (Auckl). - 2016. - Vol. 9. - P. 455466.
8. Changes in locomotor muscle activity after treadmill training in subjects with incomplete spinal cord injury [Text]/M.A. Gorassini et al. // J. Neurophysiol. - 2009. - Vol. 101, № 2. - P. 969-979.
9. Nogo-A antibodies and training reduce muscle spasms in spinal cord-injured rats [Text]/R.R. Gonzenbach et. al. //Ann. Neurol. — 2010. - Vol. 68, № 1. - P. 48-57.
10. Fouad K. Rehabilitative training and plasticity following spinal cord injury [Text]/K. Fouad, W. Tetzlaff //Exp. Neurol. — 2012. - Vol. 235. - P. 91-99.
11. Knikou M. Neural control oflocomotion and training-induced plasticity after spinal and cerebral lesions [Text]/ M. Knikou // Clin. Neurophysiol. - 2010. - Vol. 121, № 10. - P. 1655-1668.
12. Recovery of neuronal and network excitability after spinal cord injury and implications for spasticity [Text] / J.M. D'Amico et al. // Front. Int. Neurosci. — 2014. — Vol. 8, Article 36. — P. 1-24.
13. Цимбалюк B.I. Реконструктивно-eidHoena хiрургiя спинного мозку [Текст]/B.I. Цимбалюк, Ю.Я. Ямтський. — К.: Авцена, 2009. — 248с.
14. Цымбалюк В.И. Нейрогенные стволовые клетки [Текст] / В.И. Цымбалюк, В.В. Медведев. — К.: Коваль, 2005. — 596 с.
15. Neurorehabilitation with neural transplantation [Text]/ M. Döbrössy, et al. //Neurorehabil. Neural. Repair. — 2010. — Vol. 24, № 8. — P. 692-701.
16. Spinal cord reconstruction using NeuroGel implants and functional recovery after chronic injury [Text]/ S. Woerly et al. // J. Neurosci. Res. — 2001. — Vol. 66, № 6. — Р. 1187-1197.
17. Reconstruction of the transected cat spinal cord following NeuroGel implantation: axonal tracing, immunohistochemical and ultrastructuralstudies [Text]/S. Woerly et al. //Int. J. Dev. Neurosci. — 2001. — Vol. 19, № 1. — Р. 63-83.
18. Spinal cord repair with PHPMA hydrogel containing RGD peptides (NeuroGel) [Text]/ S. Woerly et al. // Biomaterials. — 2001. — Vol. 22, № 10. — Р. 1095-1111.
19. Цымбалюк В.И. Спинной мозг. Элегия надежды: монография [Текст] / В.И. Цымбалюк, В.В. Медведев. — Винница: Нова Книга, 2010. — 944 с.
20. Kaneko A.A. 3D nanoflbrous hydrogel and collagen sponge scaffold promotes locomotor functional recovery, spinal repair, and neuronal regeneration after complete transection of the spinal cord in adult rats [Text]/A. Kaneko, A. Matsushita, Y. Sankai// Biomed Mater. — 2015. — Vol. 10, № 1. — ID: 015008, doi: 10.1088/1748-6041/10/1/015008.
21. Multichannel silk protein/laminin grafts for spinal cord injury repair [Text] / Q. Zhang et al. // J. Biomed. Mater. Res. A. — 2016, Jul. 30 [Epub ahead of print]. — doi: 10.1002/ jbm.a.35851.
22. Neurotrophin-3 gradients established by lentiviral gene delivery promote short-distance axonal bridging beyond cellular grafts in the injured spinal cord [Text] / L. Taylor, L. Jones, M.H. Tuszynski, A. Blesch // J. Neurosci. — 2006. — Vol. 26, № 38. — P. 9713-9721.
23. Vector-induced NT-3 expression in rats promotes collateral growth of injured corticospinal tract axons far rostral to a spinal cord injury [Text]/N. Weishaupt et al. //Neuroscience. — 2014. — Vol. 272. — P. 65-75.
24. Exogenous neuritin promotes nerve regeneration after acute spinal cord injury in rats [Text] / R. Gao et al. // Hum. Gene Ther. — 2016. — Vol. 27, № 7. — P. 544-554.
25. Sustained release of Neurotrophin-3 via calcium phosphate-coated sutures promotes axonal regeneration after spinal cord injury [Text]/A. Hanna et al. // J. Neurosci. Res. — 2016. — Vol. 94, № 7. — P. 645-652.
26. Human iPS cell-derived astrocyte transplants preserve respiratory function after spinal cord injury [Text] / K. Li et al. // Exp. Neurol. — 2015. — Vol. 271. — P. 479-492.
27. Respiratory outcomes after mid-cervical transplantation of embryonic medullary cells in rats with cervicalspinal cord injury [Text] / B.J. Dougherty et al. // Exp. Neurol. — 2016. — Vol. 278. — P. 22-26.
28. Functional recovery after cervical spinal cord injury: role of neurotrophin andglutamatergic signaling in phrenic motoneurons [Text]/L.C. Gill, H.M. Gransee, G.C. Sieck, C.B. Mantilla// Respir. Physiol. Neurobiol. — 2016. — Vol. 226. — P. 128-136.
29. Ex-vivo expanded human blood-derived CD133+ cells promote repair ofinjured spinal cord [Text] / N. Kamei et al. //J. Neurol. Sci. - 2013. - Vol. 328, № 1-2. - P. 41-50.
30. Safety and neurological assessments after autologous transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells in subjects with chronic spinal cord injury [Text]/Mendon^a M.V.P. et al. // Stem Cell Res. Ther. - 2014. - Vol. 5, Art. 126. - P. 1-11.
31. Transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells promotes functional recovery in a rat model of traumatic spinal cord injury [Text] / H.-L. Zhou et al. // Neurochem. Res. — 2016, Jun 28[Epub ahead of print]. — doi: 10.1007/s11064-016-1987-9.
32. Oliveri R.S. Mesenchymal stem cells improve locomotor recovery in traumatic spinal cord injury: Systematic review with meta-analyses of rat models [Text]/R.S. Oliveri, S. Bello, F. Biering-Sarensen // Neurobiol. Dis. — 2014. — Vol. 62. — P. 338-353.
33. Dennie D. Migration of bone marrow progenitor cells in the adult brain ofratsandrabbits[Text]/D. Dennie, J. — P. Loubouün, D.S. Stray-er//World J. Stem Cells. - 2016. - Vol. 8, № 4. - P. 136-157.
34. Huang B. Fate determination in mesenchymal stem cells: a perspective from histone-modifying enzymes [Text] / B. Huang, G. Li, X.H. Jiang// Stem Cell Res. Ther. - 2015. - Vol. 6, Article 35. - P. 1-9.
35. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation [Text] / N. Noiseux et al. //Mol. Ther. - 2006. - Vol. 14, № 6. - P. 840-850.
36. Xin H. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke [Text]/H. Xin, Y. Li, M. Chopp //Front. Cell. Neurosci. —
2014. - Vol. 8, Article 377. - P. 1-11.
37. Karantalis V. Use of mesenchymal stem cells for therapy of cardiac disease [Text]/ V. Karantalis, J.M. Hare // Circ. Res. —
2015. - Vol. 116, № 8. - P. 1413-1430.
38. Bone marrow mesenchymal stromal cells and olfactory en-sheathing cells transplantation after spinal cord injury — a morpho-
logical and functional comparison in rats [Text]/ A. Torres-Espin, E. Redondo-Castro, J. Hernandez,, X. Navarro //Eur. J. Neurosci. — 2014. — Vol. 39. — P. 1704-1717.
39. Prevention ofglioticscarformation by NeuroGelallows partial endogenous repair of transected cat spinal cord [Text] / S. Woerly et al. // J. Neurosci. Res. — 2004. — Vol. 75, № 2. — P. 262-272.
40. Expression of heat shock protein (HSP)-25 and HSP-32 in the rat spinal cord reconstructed with Neurogel [Text] / S. Woerly et al. //Neurochem. Res. — 2005. — Vol. 30, № 6-7. — P. 721-735.
41. Модель переЫчення половини поперечника спинного мозку. I. Технiчнi, паmоморфологiчнi та клiнiко-експериментальнi особливостi[Текст]/В.1. Цимбалюк та т. //Укр. нейрохiрург. журнал. — 2016. — № 2. — С. 18-27.
42. Basso D.M. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats [Text] /D.M. Basso, M.S. Beattie, J.C. Bres-nahan // J. Neurotrauma. — 1995. — Vol. 12, № 1. — P. 1-21.
43. Early inflammatory responses following cell grafting in the CNS trigger activation of the subventricular zone: a proposed model of sequential cellular events [Text] / J. Praet et al. // Cell Transplant. — 2015. — Vol. 24, № 8. — P. 1481-1492.
44. Immunosuppression of allogenic mesenchymal stem cells transplantation after spinal cord injury improves graft survival and beneficial outcomes [Text]/ A. Torres-Espin, E. Redondo-Castro, J. Hernandez,, X. Navarro// J. Neurotrauma. — 2015. — Vol. 32. — P. 367-380.
45. Immune remodelling of stromal cell grafts in the central nervous system: therapeutic inflammation or (harmless) side-effect? [Text] / D. Le Blon et al. // J. Tissue Eng. Regen. Med. — 2016 [Epub ahead of print].
46. Concise review: spinal cord injuries — how could adult mesenchymal and neural crest stem cells take up the challenge? [Text] / V. Neirinckx et al. // Stem Cells. — 2014. — Vol. 32, № 4. — P. 829-843.
Отримано 28.08.16 ■
ЦымбалюкВ.И.1, Медведев B.B.2, Рыбачук O.A.3,5, Козявкин В.А.4, Драгунцова Н.Г.1
1ГУ «Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины», г. Киев, Украина
2Национальный медицинский университет имени A.A. Богомольца, г. Киев, Украина
3ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины», г. Киев, Украина
"Международная клиника восстановительного лечения, г. Трускавец, Украина
5Институт физиологии имени A.A. Богомольца НАН Украины, г. Киев, Украина
ВЛИЯНИЕ ИМПЛАНТАЦИИ NEUROGEL™ В АССОЦИАЦИИ С КСЕНОГЕННЫМИ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ КОСТНОГО МОЗГА НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ ДВИГАТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ЗАДНЕЙ КОНЕЧНОСТИ КРЫСЫ
ПОСЛЕ СПИНАЛЬНОЙ ТРАВМЫ
Резюме. Цель — изучить влияние имплантации №игоОе1™ в ассоциации со стволовыми клетками костного мозга (СККМ) на восстановление двигательной функции задних конечностей крысы после экспериментальной травмы спинного мозга. Материалы и методы. Животные — белые беспородные крысы-самцы (5 мес., 250 г); группы: 1-я — травма спинного мозга (п = 16); 2-я — травма спинного мозга + гомотопическая имплантация фрагмента МешоОеГ™ (п = 20); 3 — травма спинного мозга + гомотопическая имплантация фрагмента №игоОеГ™, ассоциированного с СККМ мыши (п = 16). Модель травмы — левостороннее пересечение половины спинного мозга на уровне Т11; длительность наблюдения — 28 нед., оценка показателя функции
задней ипсилатеральной конечности (ПФ ЗИК) — по шкале Basso — Beattie — Bresnahan. Результаты. Ксенотрансплан-тация СККМ в комплексе с NeuroGel™ удлиняет во времени, но уменьшает интенсивность прироста ПФ ЗИК в остром и раннем периодах травматического процесса, пролонгирует фазу значимого роста двигательной функции до 6-го месяца включительно. В группе 1 достоверное (р < 0,05) увеличение ПФ ЗИК наблюдали лишь в течение 3-4-й недели, в группе 2 — в течение 1-2-й и 5-6-й недель, в группе 3 — в течение 1— 2-й, 4-5-й и 8-24-й недель. По состоянию на 28-ю неделю ПФ ЗИК в группе 1 составил 1,6 ± 0,5 балла, в группе 2 — 8,4 ± 0,9 балла, в группе 3 — 11,0 ± 1,5 балла по шкале Basso — Beattie —
Bresnahan. Достоверную разницу ПФ ЗИК между группами 2 и 1 отмечали в течение 2-28-й недель (р < 0,001), между группами 3 и 1 — в течение 1-28-й недель (р < 0,02). Максимальную разницу ПФ ЗИК групп 3 и 2 в пользу первой отмечали на 24-й неделе (р = 0,055). Вывод. Ксенотрансплантация СККМ в комплексе с №игеЮе1™ в целом изменяет динамику восстановления
двигательной функции паретической конечности, обусловливает тенденцию к потенцированию положительного влияния матрикса на течение спинальной травмы.
Ключевые слова: травма спинного мозга, восстановительное лечение, тканевая нейроинженерия, искусственный тканевый матрикс, стволовые клетки костного мозга.
Tsymbaliuk V.I.1, Medvediev V.V.2, Rybachuk O.A.3,5, Kozyavkin V.I.4, Draguntsova N.G.1
1SI «Institute of Neurosurgery named after Acad. A.P. Romodanov of NAMS of Ukraine», Kyiv, Ukraine
2SI «Institute of Genetic And Regenerative Medicine of NAMS of Ukraine», Kyiv, Ukraine
3 Bogomolets National Medical University, Kyiv, Ukraine
4 International Clinic of Rehabilitation, Truskavets, Ukraine
5 Bogomolets Institute of Physiology, Kyiv, Ukraine
THE EFFECT OF IMPLANTATION OF NEUROGEL™ USED WITH XENOGENIC BONE MARROW STEM CELLS ON MOTOR FUNCTION RECOVERY AFTER EXPERIMENTAL SPINAL CORD INJURY
Summary. Objective. To examine NeuroGel™ with bone marrow stem cells (BMSC) implantation on rat's hind limb motor function recovery after experimental spinal cord injury. Materials and methods. Animals: outbred albino male rats (5.5 months, 250 g); experimental groups: 1st — spinal cord injury only (n = 16); 2nd — spinal cord injury + immediate homotopical transplantation of NeuroGel™ (n = 20); 3rd — spinal cord injury + analogous transplantation of NeuroGelTM in association with adult mouse BMSC (n = 16). Model of injury: left-side spinal cord hemisection at T11; the ipsilateral hindlimb function indicator (IHL FI) was detected using the Basso — Beattie — Bresnahan scale (BBB). Results. Xenotransplantation of the BMSC together with NeuroGel™ extends the period, but reduces the intensity of IHL FI growth in the acute and early period of traumatic process, prolongs a phase of significant IHL FI growth to the 6th month inclusive. In group 1
significant (p < 0.05) increase of IHL FI was observed during 3rd — 4th week only, in group 2 — during 1st — 2nd and 5th — 6th week, in group 3 — during 1st — 2nd, 4th — 5th and 8th — 24th week. At the 28th week in group 1 IHL FI was 1.6 ± 0.5 points, in group 2 — 8.4 ± 0.9 points, in group 3 — 11.0 ± 1.5 points by BBB scale. Significant difference in IHL FI between groups 2 and 1 was being registered for 2nd — 28th weeks (p < 0.001), between groups 3 and 1 — during 1st — 28th week (p < 0.02). The maximal difference between groups 2 and 3 in favor of the first one was noted on the 24th week (p = 0.055). Conclusion. BMSC-xenotransplantation in association with NeuroGel™ changes the dynamics of the paretic limb function recovery, it provides a tendency towards intensification of the NeuroGel™ positive impact on the course of the spinal cord injury.
Key words: spinal cord injury, recovery treatment, tissue neuroengineering, artificial tissue scaffold, bone marrow stem cells.
