CC BY
82
13. Современные подходы к фармакологической коррекции гипоксических состояний / И.В. Коваль,
Н.В. Вдовенко, В.А. Козловский [та ш.] // Спортивна медицина. - 2008. - №1. - С. 36-41.
14. Monnier M. Atlas for stereotaxic brain research on the conscious rabbit / M. Monnier, M. Ganglooff. -Amsterdam: Elsevier Publishing company, 1961.- 145 p.
♦
ВПЛИВ ГІДРОГЕН СУЛЬФІДУ НА СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗУ ЩУРІВ
УДК 616-005.3-092.9:546.221.1
Н.В. Заічко ,
Т.М. Платонова ,
Т.М. Чернишенко ,
Т.В. Гриненко ,
О. І. Юсова
НДІреабілітації інвалідів Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова (директор - д.мед.н., проф. В.І. Шевчук)
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України м. Київ
Ключові слова: гідроген сульфід, пропаргілгліцин, гемостаз Key words: hydrogen sulfide, proparhilhlitsyn, hemostasis
Резюме. Исследовано влияние 7-дневного введения донора гидроген сульфида Na2S ' 9H2O (14 мкмоль/кг) и ингибитора цистатионин-гамма-лиазы DL- пропаргилглицина (50 мг/кг) на систему гемостаза крыс. Установлено, что повышение уровня гидроген сульфида в плазме крови замедляет активацию протромбина, снижает активность фактора Х и ингибиторов фибринолиза. В то же время, снижение уровня гидроген сульфида приводит к усилению гемокоагуляции и увеличивает АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов.
Summary. Influence of 7-day administration of hydrogen sulfide donor Na2S ' 9H2O (14 micromol/kg) and inhibitor of cystathionine-y-lyase DL-pro-pargylglycine (50 mg/kg) on hemostasis in rats was investigated. It was established that increasing of hydrogen sulfide blood level decelerated prothrombin activation, decreased activity of factor X and fibrinolysis inhibitors. At the same time, lowering of hydrogen sulfide resulted in enhancement of hemocoagulation and ADP-inducedplatelet aggregation.
Гідроген сульфід (H2S) є біологічно активним метаболітом сірковмісних амінокислот - цистеїну, гомоцистеїну та метіоніну, який бере участь в регуляції судинного тонусу, нейромодуляції, запаленні тощо [7]. Встановлено, що H2S досить активно утворюється в міокарді та судинах за участі піридоксальфосфатзалежного ферменту цистатіонін-у-ліази (КФ 4.4.1.1) [7]. Тому зниження ендогенної продукції H2S сьогодні розглядають як можливий чинник захворювань серцево-судинної системи, зокрема артеріальної гіпертензії та ішемічної хвороби серця. Цілком очевидно, що H2S, як і інші вазодилататори (оксид азоту, аденозин), може виявитись причетним до регуляції функціонального стану тромбоцитів та процесів тромбогенезу. Однак вплив H2S на систему гемостазу залишається повністю не з’ясованим. У попередніх дослідженнях нами було показано, що в умовах in vitro
H2S проявляє антиагрегантну дію [3], а зниження його вмісту в сироватці крові у щурів із гіпергомоцистеїнемією асоціюється з посиленням активаційних процесів у тромбоцитах. Метою цієї роботи було визначити вплив H2S на різні ланки (коагулянтну, антикоагулянтну, фіб-ринолітичну, тромбоцитарну) системи гемостазу щурів.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Досліди проведені на 30 білих нелінійних щурах-самцях масою 250-270 г. Під час експерименту всі тварини отримували напівсинтетичний крохмально-казеїновий раціон, який забезпечував надходження в їх організм оптимальних кількостей всіх макро- і мікронутрієнтів [2]. На цей раціон тварин переводили за 10 днів до початку експерименту для адаптації, режим харчування та водний режим були ad libitum. Тварини були розділені на три групи: група № 1
- контроль (п=10), щурам групи №2 (п=10) вводили донор Н28 - Ка28 ' 9Н20 (у водному розчині існує як гідросульфід-аніон Ж-) в дозі 14 мкмоль/кг 1 раз на добу інтраперитонеально 7 днів, щурам групи №3 (п=10) вводили Б,Ь-пропаргілгліцин (інгібітор цистатіонін-у-ліази) в дозі 50 мг/кг 1 раз на добу інтраперитонеально 7 днів. Щурам контрольної групи інтраперитонеально вводили відповідну кількість 0,15 М розчину КаЄІ. Дози та шляхи введення вказаних речовин обрані згідно з даними літератури і не викликали загибелі тварин [6]. Забір крові для досліджень проводили з серця тварин у поліетиленові пробірки: з 3,8% розчином цитрату натрію (у співвідношенні 9:1) для дослідження показників гемостазу; без антикоагулянтів - для біохімічних досліджень. Перед забором крові щурів анестезували кетаміном (100 мг/кг маси тіла інтраперитонеально). З експерименту тварин виводили шляхом дислокації шийних хребців. Досліди проведено згідно з правилами гуманного ставлення до експериментальних тварин, затвердженими комітетом з біоетики Вінницького національного медичного університету ім. М. І.Пирогова.
Сироватку крові, а також багату та бідну тромбоцитами плазму крові отримували звичайними методами. Показники системи гемостазу визначали протягом трьох годин після забору крові. Плазму крові зі згустками чи ознаками гемолізу для досліджень не використовували. Агрегацію тромбоцитів досліджували у зразках багатої тромбоцитами плазми крові на фотооптичному агрегометрі АР2110 (“Солар”, Білорусь), як індуктор агрегації брали АДФ (кінцева концентрація 5 мкМ). Для характеристики коагу-ляційного потенціалу визначали: активований частковий тромбопластиновий час (АЧТЧ), про-тромбіновий час (ПЧ), тромбіновий час (ТЧ), вміст фібриногену, амідолітичну активність Х фактору (по відношенню до хромогенного субстрату 82765). Антикоагулянтну ланку системи гемостазу характеризували за активністю антитромбіну ІІІ та протеїну С, яку визначали амі-долітичним методом. Для характеристики фібри-нолітичної системи визначали час лізису еугло-булінів. Додатково в пулах плазми щурів контрольної групи та щурів 2 групи (введення Ка28' 9Н20) визначали кількість плазміногену та активності тканинного активатору плазміногену (ТАП), його інгібітору (ПАІ-1) і а-2-антиплаз-міну.
Вміст плазміногену в плазмі крові визначали з використанням лізин-сефарози. На колонку, яка містила 5 мл гелю лізин-сефарози (сорбційна
ємність - 0,6 мг білка/мл гелю), наносили 1 мл плазми крові щурів. Колонку промивали 0,1 М натрій-фосфатним буфером до поглинання елюату 0,001 при 280 нм, десорбцію плазмі -ногену здійснювали 0,1 М 6-аміногексановою кислотою. Концентрацію проферменту розраховували за коефіцієнтом екстинції Е1%/280 нм = 17,0 [8].
Активність ТАП та ПАІ-1 визначали за стандартною процедурою методів COASET t-PA та COATEST PAI (Chromogenix), відповідно, з використанням desAABB фібрину як стимулятора (0,12 мг/мл).
Активність а2-антиплазміну плазми визначали за інгібуванням фібринолітичної активності плазміну. В реакційне середовище вносили: 0,02 М вероналовий буфер, що містить 0,13 М NaCl та 0,001 М CaCl2, плазмін (3,5 ’ 10-8 М), плазму крові щурів (2,5 - 5,0 мкл). Процес полімеризації фібрину ініціювали додаванням розчину desAABB фібрину (6,0 ' 10-7 М). Об’єм суміші -1,0 мл. Реакцію проводили в термостатованій кюветі спектрофотометру (ЛОМО, Росія) за 37 0С. Оптичну щільність середовища протягом полімеризації та наступного гідролізу фібрину плазміном визначали при 350 нм. Вимірювали час напівлізису згустку t% (час від початку полімеризації фібрину до зменшення максимальної мутності середовища на 50%) і розраховували швидкість гідролізу фібрину плазміном як 1/t'A Швидкість гідролізу фібрину плазміном за відсутності плазми крові приймали за 100%.
Вміст H2S у плазмі крові визначали за реакцією з и-фенілендіаміном, як описано [1]. Вміст цистеїну визначали за реакцією з нінгідриновим реактивом у кислому середовищі [5]. Рівень білкових SH-груп у плазмі крові визначали за реакцією з реактивом Елмана.
У роботі використані Б,Ь-пропаргілгліцин, L-цистеїн фірми Sigma (США), набори “Техплас-тин-тест”, “АПТВ-ЕІ-тест”, “Тромботест”, “Хро-моТех-Антитромбин”, “АДФ” фірми Технологія-Стандарт (Росія) та “Реахром-Протеин С” фірми НПО РЕНАМ (Росія), ТАП (Alteplasa) фірми Boehringer Ingelheim (Німеччина), S2251 (Val-Leu-Lys-pNa) фірми Chromogenix (Швеція), урокіназа фірми Medac (Німеччина), BrCN-сефа-роза фірми Amersham (Швеція). Статистичну обробку результатів проводили за допомогою статистичних програм “MS Exel XP”. Вірогідність відмінностей оцінювали за t-критерієм Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Встановлено, що 7-денне введення розчину Na2S ' 9H2O викликало підвищення (на 24,0 та
22,7%) рівня Н28 та білкових 8Н-груп у плазмі крові і практично не впливало на рівень цистеїну (табл.). У той же час, введення пропаргілгліцину зумовило зниження вмісту И28, цистеїну та білкових 8Н-груп в плазмі крові на 37,6; 23,1 та 20,7%, відповідно. Індуковане введенням про-
паргілгліцину падіння вмісту рівнів цистеїну та И28 у плазмі крові пояснюється інгібуванням цистатіонін-у-ліази, яка каталізує утворення зазначених речовин у серцево-судинній системі та інших тканинах (схема 1).
Цистатіонін + Н2О ^ Цистеїн + NH3 + 2-оксобутират (1)
Цистеїн + Н2О ^ Піруват + Н28 + NH3 (2)
Схема 1. Реакції утворення цистеїну (1) та Н28 (2), що каталізуються цистатіонін-у-ліазою
Звертає на себе увагу той факт, що коливання вмісту И28 у плазмі крові, індуковані введенням Ка28 ' 9Н20 та пропаргілгліцину, супроводжувались аналогічними за спрямованістю змінами рівня білкових 8Н-груп, причому між цими показниками існував достовірний прямий коре-
ляційний зв’язок (г=0,79). Виявлена закономірність підтверджує причетність Н28 до підтримки 8Н-груп у відновленому стані [7], що, як відомо, впливає на біологічну активність білків, у тому числі і білків системи гемостазу [4].
Вплив Н28 та Б,Ь-пропаргілгліцину на вміст сірковмісних сполук у плазмі крові, показники системи гемостазу та агрегацію тромбоцитів у щурів (М±т)
Показник Групи щурів
1 2 3
контроль (п=10) введення ^28 ' 9Н20 (п=10) введення пропаргілгліцину (п=10)
Вміст сірковмісних сполук у плазмі крові
Н28, мкмоль/л 68,3 ±3,56 84,7±3,14* 42,6±3,14 *
Цистеїн, мкмоль/л 167,6±6,04 176,2±5,57 128,9±4,69*
Білкові 8Н-групи, ммоль/л 7,53±0,26 9,24±0,27* 5,97±0,26*
Показники плазмених ланок системи гемостазу
ПЧ, с 18,7±0,52 24,6±0,76* 15,9±0,59*
АЧТВ, с 26,2±0,59 31,3±1,60* 22,1±1,28*
ТЧ, с 10,3±0,30 13,0±0,39* 9,9±0,38
Фібриноген, г/л 2,88±0,15 2,98±0,07 2,83±0,12
Активність АТ ІІІ, % 100,4±1,98 102,7±1,44 95,6±1,98
Активність протеїну С, % 99,2±1,21 94,2±2,80 95,2±2,81
Активність фактору Х, % 99,7±1,46 79,5±3,60* -
Час лізису еуглобулінів, хв. 106,5±2,99 112,1±3,07 108,8±2,67
Показники АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів
Ступінь агрегації,% 31,3±2,31 26,0±1,14 40,7±1,15*
Час агрегації, с 202,5±18,8 206,6±10,7 247,6±4,24*
Швидкість, % за хв 26,5±1,36 22,5±1,70 32,4±1,82*
Примітка : * - р<0,05 - відносно групи контролю
Коливання рівня Н28 у крові відображались на функціональному стані системи зсідання крові. Зокрема, збільшення вмісту Н28 у плазмі крові при введенні Ка28 ' 9Н20 асоціювалось зі зменшенням активності коагуляційних процесів: у щурів групи №2 час зсідання плазми крові в тестах ПЧ та АЧТВ подовжився на 31,6 та 19,5%,
активність фактору Х зменшилась на 20,3% порівняно з контролем, що свідчить про сповільнення активації протромбіну. В той же час індуковане пропаргілгліцином зниження вмісту Н28 у плазмі крові, навпаки, супроводжувалось посиленням процесів гемокоагуляції - час зсідання крові в тестах ПЧ та АЧТВ у щурів
групи № 3 скоротився на 2-4 с (15-16%) порів- гілгліцину) не асоціювались з достовірними змі-
няно з контролем. Введення ' 9Н20 вик- нами активності білків антикоагулянтної ланки
ликало також подовження (на 26,2%) часу зсі- (антитромбіну ІІІ та протеїну С) і не викликали
дання крові в тесті ТЧ, тоді як введення про- помітних змін часу лізису еуглобулінів. Більш
паргілгліцину практично не впливало на цей детальний аналіз показників системи фібри-
показник. Оскільки рівні фібриногену у щурів нолізу був проведений у пулах плазми крові
контрольної та дослідних груп достовірно не щурів контрольної групи та щурів, яким вводили
відрізнялись між собою, збільшення ТЧ може Ка28 ' 9Н20. З’ясувалось, що зниження рівня Н28
свідчити про накопичення в плазмі крові сполук, не супроводжувалось достовірними змінами
здатних зменшувати активність тромбіну, при вмісту плазміногену та активності ТАП (рис.1) в
цьому не виключено, що таку дію має Н28. плазмі крові, однак намічалась тенденція до
Зміни вмісту Н28 у плазмі крові (як при вве- зменшення активності інгібіторів плазміну -
денні ' 9Н20, так і при введенні пропар- ПАІ-1 та а2-антиплазміну (рис.2, 3).
Об’єм плазми крові, мкл
Рис.1. Активність ТАП у плазмі крові щурів контрольної групи та щурів, яким вводили Ка28 • 9Н20 (дослід)
Дослідження агрегації тромбоцитів показало, що зниження вмісту Н28 у плазмі крові супроводжувалось підвищенням чутливості цих клітин до дії стимуляторів. Так, ступінь, швидкість та час АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів у щурів, яким вводили пропаргілгліцин, були вищими (на 30,0; 22,3 та 44,0%), ніж у контролі.
Помірне підвищення рівня Н28 у плазмі крові, зумовлене введенням Ка28 ' 9Н20, не спричиняло достовірних змін агрегації тромбоцитів. Між ступенем агрегації тромбоцитів та рівнем Н28 у плазмі крові виявлявся обернений кореляційний зв’язок (г=-0,33), який посилювався при введенні пропаргілгліцину (г=-0,51).
С
а
о
и
о
х
X
о
и
о
2
X
п
¡5
<
4 5 6 7 8
Об’єм плазми крові, мкл
70
60
50
40
3
Рис.2. Зниження активності екзогенного ТАП під дією ПАІ-1 плазми крові щурів контрольної групи та щурів, яким вводили ^28 • 9Н2О (дослід)
Таким чином, нами вперше показано, що рівень Н28 у крові є одним із чинників, причетних до регуляції функціонального стану системи гемостазу. Підвищення вмісту Н28 у крові супроводжується сповільненням процесу гемоко-агуляції (за рахунок зниження активності фактору Х та пригнічення процесу активації протромбіну) і викликає тенденцію до зменшення активності інгібіторів фібринолізу - ПАІ-1 та а2-антиплазміну. На противагу цьому, зниження вмісту Н28 у плазмі крові сприяє посиленню процесів активації протромбіну та збільшує чутливість тромбоцитів до АДФ, що може зумовити розвиток тромбофілії. Найбільшою мірою на падіння рівня Н28 у крові реагують тромбо-цитарна ланка і плазмені фактори коагуляції, тоді як зростання рівня Н28 у крові в першу чергу відображається на плазменому гемостазі і, меншою мірою, на процесі фібринолізу. Ймовірні механізми впливу Н28 на процеси зсідання
крові можуть опосередковуватись через зміну редокс-статусу білків системи гемостазу та тромбоцитів, внаслідок здатності цієї молекули втручатись у тіолово-дисульфідний обмін. Як відомо, цей шлях є важливим в регуляції активності багатьох білків, у тому числі і білків системи гемостазу [4]. Зокрема, продемонстровано, що редукція дисульфідних зв’язків у молекулі тромбіну зменшує його клотингову активність по відношенню до фібриногену [9], а інгібування активності одного з ключових ферментів тіо-лово-дисульфідного обміну протеїндисульфідізо-мерази порушує залежний від тканинного фактору процес утворення фібрину [4]. Перспективами подальших досліджень є вивчення молекулярних механізмів впливу И28 на систему гемостазу та розробка шляхів корекції гемоко-агуляційних порушень шляхом модуляції синтезу И28.
Об’єм плазми крові, мкл
Рис.3. Інгібування фібринолітичної активності плазміну а2-антиплазміном плазми крові щурів контрольної групи та щурів, яким вводили Ка28 . 9Н20 (дослід)
ВИСНОВКИ
1. Введення Ка28 • 9Н20 (донору Н28) щурам у дозі 14 мкмоль/кг протягом 7 днів викликає підвищення (20-25%) рівня Н28 та білкових 8Н-груп у плазмі крові і практично не впливає на рівень цистеїну. За цих умов введення пропар-гілгліцину в дозі 50 мг/кг, навпаки, викликає достовірне зниження (25-30%) вмісту Н28, цистеїну та білкових 8Н-груп у крові.
2. Підвищення вмісту И28 у плазмі крові призводить до подовження часу зсідання крові в тестах ПЧ і АЧТВ, зниження активності фактору Х і викликає тенденцію до зменшення активності інгібіторів фібринолізу ПАІ-1 та а2-антиплаз-міну. Зниження рівня И28 у плазмі крові асоціюється з посиленням процесів гемокоагуляції та збільшенням АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Визначення вмісту гідроген сульфіду в сироватці крові / Н. В. Заічко, Н.О. Пентюк, Л. О. Пентюк [та ін.] // Вісник наукових досліджень. - 2009. - №1. -С.29-32.
2. Гіпергомоцистеїнемія: моделювання та вплив на стан судинної системи в експерименті / О.О. Пентюк, М. Б. Луцюк, К. П. Постовітенко [та ін.] // Досягнення біології та медицини.-2004.-№°1(3).-С.35-38.
3. Заічко Н.В. Вплив аніонів гідросульфіду, диті-оніту, сульфіту, тіосульфату та сульфату на агрегацію тромбоцитів людини / Н. В. Заічко, О.О. Пентюк // Укр.біохім. журнал. - 2009. - T. 81, №1. - С.105-113.
4. Chen V.M. Allosteric disulfide bonds in thrombosis and thrombolysis / V. M. Chen, P. J. Hogg // J. Thromb. Haemost. - 2006. - Vol. 4.- P. 2533 - 2541.
5. Gaitonde M. K. A spectrophotometric method for direct determination of cysteine in the presence of other naturally occuring amino acid / M. K. Gaitonde // Bio-chem. J .- 1967. - Vol.104, N2. - P.627-633.
6. Hydrogen sulfide and its possible roles in myocardial ischemia in experimental rats / Y. Z. Zhu, Z. J.
Wang, P. Ho [et al.] // J. Appl. Physiol. - 2007.- Vol. 102, N1.- P.261-268.
7. Lowicka E. Hydrogen sulfide (H2S) - the third gas of interest for pharmacologists / E. Lowicka, J. Bel-towski // Pharmacological Reports.- 2007.- Vol.59.- P.4-24.
8. Robbins K. C. Plasminogen and plasmin / K.C. Robbins, L. Summaria // Methods in Enzymology. - 1976.
- Vol. 45. - P. 257- 273.
9. Serejskaya AA. Enzymic activity of thrombin with partially reduced disulfide bonds / A. A. Serejskaya,
S. V. Zubak, T. W. Osadchuk, S. B. Serebryani // Thromb. Res. - 1983. - Vol. 32, N2.- P. 147-154.
♦
