CC BY
25
Retaliatory Mechanisms
in Biosystems
л
X
Regulatory Mechanisms
in
Biosystems
ISSN 2519-8521 (Print) ISSN 2520-2588 (Online) Regul. Mech. Biosyst., 8(2), 185-190 doi: 10.15421/021729
The effect of biologically active feed additives of humilid substances on the antioxidant system in liver mitochondria of gerbils
O. O. Dyomshina*, G. O. Ushakova*, L. M. Stepchenko**
*Oles Honchar Dnipro National University, Dnipro, Ukraine **Dnipro State Agrarian-Economic University, Dnipro, Ukraine
Article info
Received 29.03.2017 Received in revised form
24.04.2017 Accepted28.04.2017
Oles Honchar Dnipro National University, Gagarin Ave., 72, Dnipro, 49010, Ukraine. Tel.: +38-050-607-52-83. E-mail: [email protected]
Dnipro State
Agrarian-Economic University, Sergey Efremov Str., 25, Dnipro, 49600, Ukraine.
Dyomshina, O. O., Ushakova, G. O., & Stepchenko, L M. (2017). The effect of biologically active feed additives of humilid substances on the antioxidant system in liver mitochondria of gerbils. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 8(2), 185-190. doi:10.15421/021729
Mitochondria are organelles that are most sensitive to the action of stressors on any cell of the entire organism and exposure to chemicals which can cause its dysfunction and cell death in general. Especially sensitive to adverse conditions are liver mitochondria, where the processes of biotransformation of endogenous and exogenous metabolites are formed, not only in the liver, but also in other organs and tissues. Mitochondrial dysfunction can cause instant hepatic cytolysis and steatosis. Therefore, early detection of mitochondrial toxicity is important during preclinical studies of new pharmacological agents, as this will help avoid remote negative effects. The biologically active feed additive Humilid, a complex of humic acids known for their antidiarrheal, analgesic, immune-stimulating, and antimicrobial properties; shows a corrective effect on the activity of the lysosomal cathepsin; enhances the positive effect of hematopoiesis on hemoglobin and its quality indicators consisting of red blood cells; and activates the synthesis and accumulation of fibronectin expression that takes part in the formation of immunological protection of animals. The objective of our experiment was to determine the effect of complex biologically active feed additives based on humic substances on the biochemical indicators of the liver mitochondrial antioxidant system of Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus Milne-Edwards, 1867). The experiment was conducted on mature (6 months) Mongolian gerbils. The data obtained showing the influence of the biologically active feed additives Humilid, alone or in combination with ascorbate and Eco-impulse Animal, on the antioxidant defense system of liver mitochondria of gerbils are presented in this article. The proven antioxidant effect of humic substances in the mitochondrial fraction of the liver which inhibits the accumulation of oxidized products in the cells is shown, confirmed by the decrease in the number of TBA-active products, catalase activation, and an increase in the concentration of cytochrome C. Also, an increase in the amount of cytochrome C, which is a direct participant in the mitochondrial respiratory chain and provides efficient electron transport, indicates the acceleration of energy supply processes. The functional activity of mitochondria was accompanied by increased activity of aspartate aminotransferase involved in the shuttle of malate-aspartate transport of electrons through the mitochondrial membrane. The results obtained indicate the positive reaction of gerbil liver mitochondria under the influence of the biologically active feed additives of humic substance.
Keywords: Humilid; ascorbic acid; Eco-impulse Animal; aspartate aminotransferase; catalase; superoxide dismutase; TBA-active products; cytochrome C
Вплив бюлопчно активних кормових добавок гумшово*1 природи на систему антиоксидантного захисту мггохондрш печшки монгольсько'1 шщанки
О. О. Дьомшина*, Г. О. Ушакова*, Л. М. Степченко**
*Днтровський нацюнальний yHieepcumem iMeHi Олеся Гончара, Днтро, Укрмна **Днтровський державний аграрно-економiчнuйyHieepcumem, Днтро, Украта
Наведено даш щодо оцшки впливу бюлопчно активно'1 кормово'1 добавки Гумшд окремо та в cyMÎmi з acK0p6ÎH0B0K> кислотою, або «Еюммпульс Animal» на систему антиоксидантного захисту мггохондрш печшки пщанок. Доведено антиоксидантний вплив гушнових речовин у мiтохондрiях печшки, що пщтверджено зниженням юлькосп ТБК-активних продуктов, аю^защею каталази та тдвищенням концентрацп цитохрому С. Збшьшення юлькосп цитохрому С свщчить про прискорення процеав енергозабезпечення за рахунок активацц дихального ланцюга мгтохондрш та ефективного транспорту електрошв. Визначено потенщювальний синерпзм aскорбiновоï кислоти та Гумшду, що посилюе антиоксидантш властивосп гушнових речовин. Функцюнальна актившсть мгтохондрш супроводжувалась тдвищенням активносп aспaртaтaмiнотрaнсферaзи, яка бере участь у малатаспартатному човниковому транспорт! електрошв ^зь мiтохондрiaльнy мембрану та цикж сечовини. Встановлено сильний прямий корелятивний зв'язок високого ступеня значимосп мiж
Regul. Mech. Biosyst., 8(2) 185
юльюстю ТБК-активних продуктов i актившстю каталази, юльюстю ТБК-активних продукпв та юльюстю цитохрому С в умовах застосування Гумiлiду в сумiшi з аскорбiновою кислотою, а також вiрогiдний сильний обернений зв'язок високого ступеня значимосп мiж кiлькiстю ТБК-активних продукгiв та актившстю каталази, акгивнiстю СОД та юльюстю цитохрому С за впливу бюлопчно активно!' добавки «Еко-Гмпульс Animal». Отримат результати вказують на позитивну реакцiю мiтохондрiй печiнки пiщанок за впливу бюлопчно активних кормових добавок гумшовта природи.
Ключовi слова: Гумшд; аскорбiнова кислота; «Еко-Гмпульс Animal»; аспартатамiнотрансфераза; каталаза; супероксиддисмутаза; ТБК-активш продукти; цитохром С
Вступ
Органела, яка бере активну участь у бшьшосп катаболГч-них процесiв i забезпечуе клгтини енерпею, - це мiтохондрiя. Саме мiтохондрiя найчутливгша органела до до стресових фак-торiв будь-яко1 клтини цiлiсного органзму. Вплив хГтчних речовин на мiтохондрiï може викликати 1х дисфунщи та бути причиною загибет клгтини в цшому (Begiiche et al., 2011; Brinkmann et al., 2013; Buron et al., 2017). Особливо чутливГ до несприятливих умов серед клпинних органел мггохондри пе-чгнки, де вщбуваються процеси бютрансформаци ендогенних i екзогенних метаболiтiв, як утворюються не тгльки у печГнщ, а i в Гнших органах i тканинах (Gergalova and Skok, 2011; Mel-nichuk et al., 2013; Hamdallah et al., 2014). Порушення функцгй мгтохондрш може бути причиною миттевого печшкового ци-толГзу та стеатозу (Dykens et al., 2007; Labbe et al., 2008; Vadzuk et al., 2010). Тому ранне виявлення мгтохондр1ально1 гнтокси-каци важливе пгд час преклшчних дослгджень нових фармако-лопчних препаратiв, оскiльки це допоможе уникнути вщдале-них негативних насладив (Hynes et al., 2013; Felser et al., 2014; Buron et al., 2017).
Мггохондри - джерело вгльних радикалiв, як1 у значнш кшькосп утворюються внаслщок розвитку патологш р1зно1 етiологiï, що зумовлюе пГдвищення продукгщ Н2О2 i Н2О2-Гнду-коважа шактиваци акон1тази за загального зниження концентращ каталази, що спричинить передчасне старшня клгтини (Dai et al., 2017). Системи, як1 знешкоджують надлишкову юльюсть токсичних окиснених метаболiтiв, - високомолекулярна та низькомолекулярна антиоксидантш системи, яю функщону-ють одночасно. Супероксидан1он - один Гз токсичних оксиге-нових метаболiтiв, що Гнтенсивно утворюеться в дихальному ланцкш мгтохондрш. Ензими, яю знешкоджують супероксид-анюн - це супероксиддисмутаза (СОД) та цитохром С, най-вищГ рiвнi яких рееструються саме в мiтохондрiях печшки (Demin et al., 2008; Donghong et al., 2015; Serova et al., 2016).
У печшщ форми СОД, що домГнуе та складае понад 65% за-гально1 активност - мггохондрГальна (Mn-СОД) (Surai and Fisinin, 2013). Цитохром С, а саме його окиснена форма (Fe3+), виявляе потужн антиоксидантн1 властивостг за рахунок ефек-тивншого, тж СОД, окиснення супероксиданюна в молеку-лярний оксиген (Demin et al., 2008; Serova et al., 2016), тому вважаеться одним Гз маркерiв ефективностi функцюнування антиоксидантно1 системи. КрГм цього, ïï використовують як маркер оксидативного стресу (Birk et al., 2014). Зростання його концентрацiï у цитозольнш фракци клтини свГдчить про шдвищення проникносп зовнттньо!' мiтохондрiальноï мембра-ни (як наслщок активагщ окисних процесiв), що запускае меха-тзм загибелГ клгтини шляхом апоптозу.
Окисне пошкодження також впливае на реплжащю та транскрипцГю мiтохондрiальноï ДНК i спричиняе зниження м-тохондрiальноï функпiï, яка, у свою чергу, зумовлюе збгльшен-ня рГвня активних форм оксигену та подальше пошкодження мiтохондрiальноï ДНК (Cui et al., 2012). Пошкодження мгто-хондрiальних макромолекул клгтинного дихання токсичними формами оксигену, у свою чергу, витупае причиною передчас-ного старшня клгтин i органiзму в цшому (Lapointe, 2014; La-pointe et al., 2014). Запобггае оксидагщ клгтини ïï антиоксидант-на система - важлива ланка функцiонування в нормТ, особливо за впливу екзогенних факторiв.
Бюлопчно активна кормова добавка Гумшд (ТУ У 15.700493675 004:2009) - це комплекс гумгнових кислот, вщомих
своïми антидiарейними, знеболювальними, Гмуностимулю-вальними та антимiкробними властивостями, здаттстю впли-вати на конверсiю корму, рют i яюсть м'яса сгльськогосподар-ських тварин (Stepchenko and Skorik, 2006; Kovalenko et al., 2010; Stepchenko, 2010). Пдрогумат проявляе корегувальний ефект на активнiсть лiзосомальних катепсишв, що може бути спричинене його мембранотропними властивостями та актива-щею внутрiшньолiзосомального протеолiзу (Stepchenko, 2010), тобто впливае на молекулярт механiзми адаптаци тварин за ди хрончлого стресу. СумГш сфагнiну й дублгну викликае по-силення гемопоезу, позитивно впливае на вмст гемоглобiну та його якют показники у складi еритроципв (Stepchenko and Skorik, 2006; Shvetsova et al., 2010). Цг бюлопчно активт кормов! добавки зумовлюють зростання синтезу, експреси та накопичення фiбронектину, який бере участь у формуванн Гмунолопчного захисту тварин (Stepchenko, 2010), знижують кардiотоксичнiсть високих доз адреналшу, що зумовлено ïх здатнiстю зв'язувати вшьт радикали (Paronik et al., 2015). Також у дослгдженнях на пухлинах печiнки (Pan et al., 2016) препарат Mineral Pitch, що мстить фульвокислоти та гумгновГ кислоти, виявив себе як потенпiйний антипролiферативний та проапоптотичний агент через утворення перекисних продуктГв i NO, а також шляхом модуляци ргвня експреси miRNA-21 i miRNA-22, що дало авторам можливГсть рекомендувати вико-ристовувати цей препарат як дiетичну добавку, яка може зни-зити ризик розвитку раку та пригнiчувати рют пухлини.
Фульвокислоти та гумгновГ кислоти - джерело мгкро- та мак-роелементтв i, одночасно, активатори шдвищення к концентраци в органах i тканинах (Szabo et al., 2017). У дослГдженнях Ryzh-kovskaia et al. (2014) показано, що споживання щурами з пара-цетамольним експериментальним гепатитом мiнеральноï води, яка мстить гумгновГ кислоти, протягом 21 доби зумовило моди-фжацГю ультраструктури гепатоцитГв. Спостерiгали збiльшен-ня кГлькостГ цистерн гранулярного ендоплазматичного гетику-луму, гранул глжогену та мiтохондрiальний полГморфГзм. Вщ-бувалось вiдновлення енергетичних процесiв, глжоген- i про-тегнсинтезувальних функций, порушених у результатi введення парацетамолу. Фаза тсля вгдмГни лiкувальних препаратiв (14 дб) характеризувалася подальшим змiцненням репаративних процесiв i функпiональноï активност1 клпин печiнки. ГумглГди використовують у профшактищ та терапевтичних заходах у ветеринарии практищ для всгх видв тварин (EMEA, 1999).
«Екo-iмпульс Animal» - 6ГологГчно активна кормова добавка, яка являе собою комплексний препарат, одержаний шляхом лужного гГдролГзу торфу за впливу електричного струму. Використовують у склада рацюну сiльськогосподарських тварин та птиц! з метою полшшення функционального стану орга-нГзму, тдвищення iмунiтету, профiлактики стресу, а також щдвищення продуктивностГ та iнтенсивностi росту.
Незважаючи на широке використання бюлопчно активних кормових добавок на основ! гумшових речовин у ветеринари, птахiвнипгвi, тваринництвГ та рослиннипгвi, дослгдження ïх впливу на органГзм людини з метою подальшого впровадження у медичну практику ще тривають. ВГдомост! про вплив дослгджува-них препаратГв на антиоксидантну систему мГгохондрГй печшки ссавцГв вгдсутнГ. Класичний антиоксидант - аскорбГнова кислота -найважливГший i найефективнГший низькомолекулярний компонент антиоксидантжа системи кожноï клГтини, але ïï компонований вплив Гз гумгновими речовинами поки не дослГджено.
Мета статт! - визначити вплив комплексних бГологГчно активних кормових добавок на основ! гумгнових речовин Гум-
л!д окремо або у комплекс! з аскорбшовою кислотою, або «Ета^мпульс Animal» на стан антиоксидантно! системи мтго-хондрш печшки монгольсько! пщанки.
Матер1ал i методи досл1джень
Експеримент проведено на монгольських пщанках (Mongolian gerbilia, Meriones unguiculatus Milne-Edwards, 1867) зрь лого вшу (6 мкяцш) середньою вагою 63-83 г, яких утриму-вали у стандартних умовах вшарта. Маншуляци з тваринами проводили вщповщно до правил «Свропейсько! конвенцп за-хисту хребетних тварин, яю використовуються для експери-ментальних та шших наукових цшей» (Страсбург, 1986). Методика проаналiзована та схвалена локальним етичним ко-м1тетом ДНУ.
Дослщт бiологiчно активнi кормовi добавки додавали до питно! води у розрахунку 5 мг/кг ваги тварини. Тварин подшили на чотири дослвдт групи по 6 особин у кожнш: I група -шташш тварини (контроль), як1 отримували звичайний рацион; II - тварини, яким у питну воду додавали 1% розчин Гумiлiду (отримано та апробовано у проблемнш лаборатори з гумшових речовин ш. Л. А. Христево!, ДДАЕУ); Ш - у питну воду додавали сумш 1% розчинв Гумiлiду та аскорб1ново! кислоти (ПрАТ «Фармацевтична фiрма "Дарнищ"», Ки!в, Укра!на); IV -у питну воду додавали 1% розчин препарату «Еко-[мпульс Animal» (ДДАЕУ). Експеримент проводили протягом 24 доб. Наприюнщ тварин зважували та виводили з експерименту пд етерним наркозом, видаляли печшку, промивали И у фгяолопч-ному розчинi та використовували для подальших дослвджень
Гомогенат печшки та !! мiтохондрiальну фракцию отримували шляхом диференциного центрифугування у градiентi са-харози методом Wieckowski et al. (2009). Визначення загально! кшькосп протешу та активносп аспартатамшотрансферази (АсАТ, КФ 2.6.1.1) проводили з використанням стандартних лабораторних тест-набортв (Фетсгт, Дншро, Украгна) за методами Burtis et al. (2012) та Young (2014) зпдно з протоколом ф!рми виробника. Активн!сть каталази (КТ, КФ 1.11.1.6) визначали за здаттстю пероксиду водню утворювати солями мотбдену сттйкий забарвлений комплекс (Коrоluk et al., 1988). Активтстъ каталази виражали в мккат./кг мто-хондр!ально! фракци. Активтсть супероксиддисмутази (СОД, КФ 1.15.1.1) оцшювали як здаттсп> ензиму шпбувати реакцю окиснення кверцетину (Коstuk et al., 1990). Активтсть СОД виражали в умовних одиницях (у. о.). За умовну одиницю приймали активтсть ензиму, який здатний викликати шпбу-вання кверцетину на 50% у розрахунку на 1 мг протегтв тка-нини. Юлькить ТБК-активних продуктов визначали фотомет-рично за концентрацию забарвленого комплексу (Аndreeva et al., 1988), який утворювався за реакцп малонового доальде-пду (МДА) у кислому середовищ двома молекулами тюбар-бпурово! кислоти (ТБК). Юлькить МДА виражали у мжро-молях ТБК-активних продуктов на 1 мг протешу мтгохондрь ально! фракци. Кiлькiстъ цитохрому С - за його здаттстю вщ-новлювати дитюнат натр1ю (Selivanov et al., 1997).
Статистичний аналiз результата проводили методом ANOVA. В!ропдними вважали вщмшносп на ртвт Р < 0,05.
Результати
Обсяг загального пулу протешв у бюлопчних ртдинах, тканинах i !х компартментах - один найважливших по-казниюв метаболiзму. Дослтдження загального вм1сту проте!-н1в у отриманих мiтохондрiальних фракцях пщанок показали наявнiстъ стабиьного пулу протегтв за умов застосування гумшових препарата протягом 24 доб у визначенш доз! (рис. 1).
Загальна кiлькiстъ протешв у мггохондодальнш фракци тварин, яких випоювали Гумшдом як окремо, так i у сумптп з аскорбшовою кислотою, була майже на ртвт контрольно! групи. У тварин, яких випоювали «Еко-!мпульс Animal», юльюсть
npoTeïHiB знижувалась в1рог1дно на 27% пор1вняно з контрольною групою та шшими досл1дними групами.
Оцнювання ензиматично1 активности аспартатамшотранс-ферази в м1тохондр1альних фракцях, отриманих i3 печенки до-сл1дних тварин, показало несуттеве тдвищення (в 1,2 раза) активностi цього ензиму за впливу Гумiлiду (рис. 2). У тварин, яким у питну воду додавали сумш Гумшду та аскорбшово1 кислоти або «Еко-1мпульс Animal», активтсть АсАТ щдвишу-валась у 2,5 раза пор^вняно з контрольною групою.
Рис. 1. Загальна кшькють протешв у мiтохондpiальнiй фракци печгнки пщанок: 1 - контрольна група тварин, 2 - тварини, яю отримували у питнш вод! 1% Гумшду, 3 - у питнш вод! сумш 1% Гумшду та 1% аскорбшово1 кислоти, 4 - у питнш вод! 1% препарату «Еко^мпульс Animal»; * - Р < 0,05 вдаосно контрольно! групи; х ± SD, n = 6
ï ю
Рис. 2. Активнiсть aспaртaтaмiнотрaнсферaзи в мтохонд-рiaльнiй фрaкцiï печiнки пiщaнок: назви груп див. рис. 1
Для встановлення здaтностi препарата гyмiнових кислот виявляти aнтиоксидaнтнi влaстивостi в мiтоходрiaльних фракциях печшки визначали кшькють ТБК-активних сполук, актив-нiсть каталази та супероксиддисмутази - мaркерiв ступеня оксидативного стресу та стану aнтиоксидaнтноï системи. Кшькють ТБК-активних сполук суттево зменшуеться в мтохондрь aльнiй фракци печiнки в уск дослiдних трупах тварин у 1,52,0 раза вiдносно контрольноï групи (рис. 3). Активтсть каталази у дослщжуваних фракщях печiнки пiщaнок зросла на 11% тшьки у випадку впливу Гумшду (рис. 4), тодi як в шших групах перебувала на рiвm контрольноï групи.
Змiнy активносп супероксиддисмутази (СОД) у мтохонд-рiaльнiй фрaкцiï печiнки спостерiгaли тшьки у грут тварин, яких випоювали препаратом «Еко-iмпyльс Animal»: спостерь гали зниження aктивностi на 40% порiвняно з контрольною групою тварин (рис. 5).
Для визначення енергозабезпечення печшки та цiлiсностi мiтохондрiaльноï мембрани за застосування ксенобютиюв на основi гумшових речовин визначали кшькють цитохрому С у мггохондаальнш i водорозчиннш фракцях печшки, основна час-тина яюм представлена цитозольними протешами (рис. 6).
*,# * 11
Рис. 3. Кшькють TБK-aктивниx пpoдyктiв y мiтoxoндpiaльнiй фpaкцiï печшки пiщaнoк. нaзви ipyn див. pиc. 1
12 3 4
Рис. 4. Aктивнicть кaтaлaзи в мiтoxoндpiaльнiй фpaкдiï пeчiнки пiщaнoк. нaзви ipyn див. pиc. 1
Рис. 5. Активисть cyпepoкcиддиcмyтaзи в мiтoxoндpiaльнiй фpaкцiï пeчiнки пiщaнoк. нaзви гpyп див. pra. 1
3a peзyльтaтaми достижения пpoвeдeнo кopeляцiйний arn-лiз i poзpaxoвaнo кopeляцiйний коефкцент nipcoEa (xaßn.). Уага-иовлеио cильний пpямий зв'язок виcoкoгo cтyпeия зиaчимocтi мiж кшькютю TБK-aктивниx пpoдyктiв i aктивиicтю кaтaлaзи (r = Q,98, P < Q,QQ1), кiлькicтю TБK-aктивниx пpoдyктiв тa кiлькicтю цигoxpoмy С (r = Q,98, P < Q,QQ1), aктивиicтю СOД i кiлькicтю цигoxpoмy С (r = Q,74, P < Q,Q1) aa зacтocyвaния Гумшду тa acкopбiиoвoï киототи, a тaкoж мiж aктивиicтю ГОД i кшькютю цитoxpoмy С (r = Q,78, P < Q,Q1) y paзi зacтocyвaния Гyмiлiдy. Вipoгiдиий cильний oбepнeний зв'язок виcoкoгo cтyпeия зиaчимocтi встшовлено мiж кiлькicтю TEK-aктивниx ^o^Rrá i aктивиicтю кaтaлaзи (r = -Q,84, P < Q,Q1), aктивиicтю СOД i кiлькicтю цигoxpoмy С (r = -Q,92, P < Q,QQ1) щд Hac зacтocyвaния пpeпapaтy «Eto-m^m Animal».
Рис. б. Кшькють цигoxpoмy С y вoдopoзчиииiй (А) тa мiтoxoидpiaльиiй (Б) фpaкцiяx печшки пiщaиoк. иaзви гpyп див. pra. 1
Таблиця
Kopeляцiйний коефщент nipcoEa мж дocлiдними пapaмeтpaми aнтиoкcидaигнoгo зaxиcтy mTOxoE^in печшки пiщaиoк
Tpym Гумищ Гумщд + acкopбiнoвa киcлoтa «Eкo-iмпyльc Animale»
TБK-aктивнi пpoдyкти - KT -Q,599* Q988*** -Q,842***
TБK-aктивнi пpoдyкти - ОЭД Q,229 Q,639* -Q,29Q
TБK-aктивнi пpoдyкти - цигoxpoм С Q,496* Q982*** Q,124
СOД - цигoxpoм С Q,786** Q744** -Q,924***
СOД-KT Q,Q7Q Q,534* -Q,272
Примтки. * - P < Q,Q5, ** - P < Q,Q1, *** - P < Q,QQ1.
Уcтaиoвлeиo пoмipний пpямий зв'язок мж кiлькicтю 1БК-aктивииx пpoдyктiв тa кiлькicтю цигoxpoмy С (r = Q,49, P < Q,Q5) щд чac зacтocyвaння Гyмiлiдy, a тaкoж мiж кшькютю TБK-aктивниx пpoдyктiв тa aктивиicтю ГОД (r = Q,63, P < Q,Q5) зa умов зacтocyвaння Гумлду тa acкopбiиoвoï киcлoти. Для юльком! TБK-aктивниx пpoдyктiв i aranEEocri кaтaпaзи визтчежо пoмipний oбepиeний зв'язок (r = -Q,59, P < Q,Q5).
Обговорення
Дocлiджeния зaгaльиoгo вмicтy пpoтeïнiв y oтpимaниx м-тoxoидpiaльниx фpaкдiяx пiщaиoк пoкaзaли cтaбiльний пул пpoтeïнiв зa умов зacтocyвaния гумшовю пpeпapaтiв гфотягом 24 даб y визиaчeиiй доз!. Oднaк y твapии, якиx випoювaли пpeпapaтoм «Eкo-iмпyльc Animal», кiлькicть пpoтeïнiв y цш фpaкцiï вipoгiднo знижyвaлacь пopiвияиo з кoнтpoльиoю гpyпoю тa шшими дocлiдними гpyпaми. Знижения вмюту npo-тешв зa впливу «Eкo-iмпyльc Animal» може бути иacлiдкoм пocилeння пpoтeoлiзy a6o гaльмyвaния бiocингeзy иовт пpoтeïнiв. 3 шшого боку, можливо, тaкe явище пoв'язaиe з ви-coкoю кoицeитpaцieю вiльниx низькoмoлeкyляpииx noxiamx гyмiнoвиx peчoвии y cклaдi дшого пpeпapaтy, як! можуть виявляти влacтивocтi мoдyлятopiв бiocингeтичниx пpoцeciв.
Oцiнювaния eизимaтичиoï aктивиocтi acпapтaтaмiнoтpaи-cфepaзи в мiтoxoидpiaльииx фpaкцiяx, oтpимaниx !з печшки догадаю твapии, пoкaзaлo иecyттeвe тдвищежия aктивиocтi цього ежзиму зa впливу Гумшду. У той же чac, y твapии, яким y питну воду дoдaвaли cyмim Гумшду тa acкopбiнoвoï киcлoти a6o «Eкo-iмпyльc Animal», a^iMEicn) AcAT дocтoвipиo щдви-щyвaлacь пopiвияиo з кoнтpoльиoю гpyпoю. Можливо, зa умов зacтocyвaиия дaииx peчoвии вiдбyвaeтьcя пocилeния пpoцeciв мaлaтacпapтaтнoгo човникового мexaиiзмy, який зaбeзпeчye cyбcтpaтaми диxaльний лaнцюг i 6epe yчacть y тpaиcпopтi eлeктpoиiв кpiзь мiтoxoидpiaльиy мeмбpaиy. Ц пpoцecи cпpя-жеш !з cинтeзoм ATФ i eиepгoзaбeзпeчeниям клггиж печшки.
Mapкepи cтyпeия oкcидaтивиoгo cтpecy тa cтaиy aнтиoкcи-дaнгнoï cиcтeми (y тому чжл! мiтoxoидpiй) - кшькють 1БК-
активних сполук, активнсть каталази та супероксиддисмутази. Суттеве зменшення кшькосп ТБК-активних сполук у мгто-хондpiальнiй фракци печшки вах дослГдних груп тварин вка-зуе на потужн антиоксидантнi властивосп гумшових речовин у склад дослдних препаратв i можливу здатнiсть активГзу-вати ензими антиоксидантного захисту, яю знижують юлькить окиснених продуктГв у клпит. Активтсть каталази тдвищу-валась тд час додавання до питно1 води Гумшду, тодГ як в шших групах перебувала в межах контрольна групи. Таке тд-вищення активносп каталази може бути позитивною ознакою гальмування процесГв утворення окисних продуктгв i активГза-ц]^ адаптивних процесгв за умов ксeнобiотичного впливу, що також показано гншими авторами (Lapointe and Hekimi, 2010; Stepchenko, 2011; Paronik et al., 2015; Dai et al., 2017) та до-слГдженнями впливу гумГнових препаратв на печгнку (Serova et al., 2016). Залишаеться вГдкритим питання про специфГчтсть дiï рГзних форм гумГнових сполук на вказаний ензим.
Зниження активносп супероксиддисмутази в мтохондрг-альнГй фpакцiï печгнки пгд час випоювання тварин препаратом «Еко-Гмпульс Animal» поргвняно з контрольною групою тварин, скоргше за все, пов'язане зГ значним зниженням концен-траци пдроперекису в цГй групг тварин, що також свГдчить про зниження оксидаци мгтохондрш печГнки за рахунок активГзаци гнших ланок антиоксидантного захисту, таких як цитохром С, концентрацш якого зб1льшуеться в усГх експериментальних групах. Окиснена форма (цитохром С Fe3+) виявляе потужнГ антиоксидантнГ властивостГ за рахунок ефективнгшого, н1ж СОД, окиснення супероксиданГона в молекулярний оксиген.
Завдяки особливостям будови гумГнових речовин, препарати на 1х основ! виявляють антиоксидантну даю, знижуючи к1льк1сть окиснених продуктГв у клпин (Stepchenko and Skorik, 2006; Stepchenko, 2011; Paronik et al., 2015), у тому чист, субстратгв СОД, що спричинюе зниження ïï активносп. У лгтературГ наведено докази гормоноподГбжи дiï метаболтв гумГнових кислот у печгнщ свгйських тварин (Stepchenko, 2011). Метабо-лГзм гумГнових речовин у печшщ супроводжуеться утворенням бГологГчно активних гумГнових похгдних (або самих гумГнових кислот), яю можуть прямо або опосередковано брати участь у регуляци бГосинтезу протешв.
Отриман нами результати свГдчать про посилення процесу бГосинтезу цитохрому С (особливо за присутносп аскоpбiновоï кислоти, яка бере участь у метаболГзм! феруму), який, у свою чергу, е учасником дихального ланцюга м1тохондр1й та завдяки утворенню комплексу з кардюлгпшом забезпечуе цшснсть внутpiшньоï мембрани мгтохондрш. Також цитохром С - регулятор апоптозу клГтини. ОтриманГ дат вказують на стимуляцГю власних клгтинних антиоксидантних систем печшки, що тдтверд-жуеться пГдвищенням активностГ каталази у клгтинах печГнки та зниженням кшькосп ТБК-активних продуктГв у всГх дослГдних групах тварин. Можливе посилення процесу поглинання окси-гену пгд час вживання екзогенних речовин гумiновоï природи та, як наслГдок, енергетичного забезпечення клГтин за рахунок активапiï транспорту електронГв у дихальному ланцюзГ мгтохондрш i спряженого з ним окисного фосфорилювання, безпо-середтм учасником чого виступае цитохром С. ОтриманГ результати збГгаються Гз даними щодо пгдвищення активностГ аспартатамГнотрансферази як активного учасника малат-ас-партатного човникового трансферу, як субстратв, так i елек-тронв у мембран! мгтохондрш.
Висновки
БГологГчно активнГ добавки гумiновоï природи виявляють виражений позитивний вплив на стан та функцГональну актив-нГсть мгтохондрш печгнки пГщанок за рахунок пгдвищення антиоксидантного захисту клпин шляхом посилення адаптацГй-них процесгв, що супроводжуються збшьшенням активностГ каталази, аспартатамГнотрансферази, кшькосп цитохрому С. З'ясовано потенцГювальний синергГзм аскоpбiновоï кислоти та
Гумтду. Додавання аскорбгново! кислоти до розчину Гумш-ду посилюе його антиоксидантнГ властивостГ.
Вживання гумГнових препаратгв у дозГ 1% дГючо! речовини у питнгй водГ протягом 24 даб не викликало Гнтоксикаци в мгтохондргях печГнки, що дозволяе рекомендувати цГ бГологГчно активы добавки до подальших дослГджень Гз метою !х упровадження в медичну практику.
References
Adrianova, I. G. & Sidorova, N. D. (1990). Citohrom С i ego rol' v processah Ikanevogo dyhanija. Citohrom С i ego klinicheskoe primenenie [Cytochrome C and its role in 1he processes of tissue respiration. Cytochrome C and its clinical application]. Leningrad University Press, Leningrad (in Russian). Andreeva, L. Y., Kozhemjakyn, L. A., & Kyshkun, A. A. (1988). Modyfykacyja metoda opredelenyja perekysej lypydov v teste s tyobarbyturovoj kyslotoj [Modification of the method for the determination of lipid peroxides in the test with thiobarbituric acid]. Laboratory Work, 2, 41-43 (in Russian). Begriche, K., Massart, J., Robin, M.-A., & Borgne-Sanchez, A. (2011). Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver. Bernard Fromenty Journal of Hepatology, 54(4), 773-794. Birk, A. V., Chao, W. M., Bracken, C., Warren, J. D., & Szeto, H. H. (2014) Targeting mitochondrial cardiolipin and the cytochrome c/cardiolipin complex to promote electron transport and optimize mitochondrial ATP synthesis. British Journal of Pharmacology, 171(8), 2017-2028. Brinkmann, C. R., Jensen, L., Dagnaes-Hansen, F., Holm, I. E., Endo, Y., Fujita, T., Thiel, S., Jensenius, J. C., & Degn, S. E. (2013). Mitochondria and the lectin pathway of complement. The Journal of Biological Chemistry, 288(12), 8016-8027. Buron, N., Porceddu, M., Roussel, C., Begriche, K., Trak-Smayra, V., Gicquel, T., Fromenty, B., & Borgne-Sanchez, A. (2017). Chronic and low exposure to a pharmaceutical cocktail induces mitochondrial dysfunction in liver and hyperglycemia: Differential responses between lean and obese mice. Environmental Toxicology, 32, 1375-1389. Burtis, C., Аshvud, E., & Bruns, D. (2012). Tietz textbook of clinical
chemistry and molecular diagnostics, 5th ed. Saunders. Cui, H., Kong, Y., & Zhang, H. (2012). Oxidative stress, mitochondrial
dysfunction, and aging. Journal of Signal Transduction, 646-654. Dai, D. F., Chiao, Y. A., Martin, G. M., Marcinek, D. J., Basisty, N., Quarles, E. K., & Rabinovitch, P. S. (2017). Chapter seven mitochondrial targeted catalase: Extended longevity and the roles in various disease models. Progress in Molecular Biology and Translational Science, 146, 203-241. Donghong, L., Lei, L., Pengxi, L., Yi, L., & Xiangyun, C. (2015). Apoptosis of hela cells induced by a newtargeting photosensitizer-based PDT via a mitochondrial pathway and ER stress. OncoTargets and Therapy, 8, 703-711. Dykens, J. A., Marroquin, L. D., & Will, Y. (2007). Strategies to reduce late-stage drug attrition due to mitochondrial toxicity. Expert Review of Molecular Diagnostics, 7, 161-175. Felser, A., Stoller, A., Morand, R., Schnell, D., Donzelli, M., Terracciano, L., Bouitbir, J., & Krahenbuhl, S. (2014). Hepatic toxicity of dronedarone in mice: Role of mitochondrial p-oxidation, Toxicology, 323, 1-9. Gergalova, G. L., & Skok, M. V. (2011). Vplyv nikotynu na membrannyj potencial mitohondrij: Uchast' nikotynovyh acetylholinovyh receptoriv [The influence of nicotine on the mitochondrial membrane potential, participate nicotinic acetylcholine receptor]. The Ukrainian Biochemical Journal, 83(5), 13-21 (in Ukrainian). Hamdallah, A., Davydov, V. V., & Shvets, V. N. (2014). Oxidative stress and the enzyme system of aldehyde catabolism in the muscle mitochondria of immobilized pubertal rats. Ukrainian Biochemical Journal, 86(6), 50-55 (in Ukrainian). Hynes, J., Nadanaciva, S., Swiss, R., Carey, C., Kirwan, S., & Will, Y. (2013). A high-throughput dual parameter assay for assessing drug-induced mitochondrial dysfunction provides additional predictivity over two established mitochondrial toxicity assays. Toxicology in Vitro, 27(2), 560-569.
Koroljuk, M. A., Yvanova, L. Y., Majorova, Y. G., & Tokareva, V. E. (1988). Metod opredelenyja aktyvnosty katalazy [Method for the determination of catalase activity]. Laboratory Work, 1, 16-19 (in Russian). Kostjuk, V. A., Potapovych, A. Y., & Kovaleva, Z. V. (1990). Prostoj i chuvst-vitel'nyj metod opredelenija aktivnosti superoksiddismutazy, osnovannyj na reakcii okislenija kvercetina [A simple and sensitive method for determining the activity of superoxide dismutase, based on the oxidation reaction of quercetin]. Questions of Medical Chemistry, 36, 2, 88-91 (in Russian). Labbe, G., Pessayre, D., & Fromenty, B. (2008). Drug-induced liver injury through mitochondrial dysfunction: mechanisms and detection during preclinical safety studies. Fundamental and Clinical Pharmacology, 22, 335-353.
Lapointe, J. (2014). Mitochondria as promising targets for nutritional interventions aiming to improve performance and longevity of sows. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 98(5), 809-821.
Lapointe, J., Hughes, B. G., Bigras, E., & Hekimi, S. (2014). Compensatory elevation of voluntary activity in mouse mutants with impaired mitochondrial energy metabolism. Physiological Reports, 2(11): e12214.
Melnichuk, S. D., Khizhnyak, S. V., Morozov, V. S., & Voytsitsky, V. M. (2013). Aktyvnist' NAD^H-generujuchyh enzymiv ta vmist cytohromiv u mitohondrijah pechinky ta miokarda shhuriv za eksperymental'nogo gipobiozu [The activity of NAD^H-generating enzymes and content of cytochromes in the mitochondria of liver and myocardium of rats under experimental hibernation]. The Ukrainian Biochemical Journal, 85(4), 75-81 (in Ukrainian).
Pan, K., Gupta, P., Damania, P., Yadav, A. K., Gupta, A., Ashraf, A., & Venugopal, S. K. (2016). Mineral pitch induces apoptosis and inhibits proliferation via modulating reactive oxygen species in hepatic cancer cells. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16, 148.
Paronik, V. A., Stepchenko, L. M., Djachenko, L. M., Ljevyh, A. E., & Shevcova, A. I. (2015). Vplyv korvitynu ta gumilidu na stan oksydantno-antyoksy-dantnoi' systemy shhuriv na foni vvedennja adrenalinu [Impact of corvitin and humilid on the state of the oxidant-antioxidant system of rats on the background of the introduction of adrenaline]. Biologija Tvaryn, 17(4), 109114 (in Ukrainian).
Ryzhkovskaia, E. L., Verigo, N. S., Kuznetsova, T. E., & Ulashchik, V. S. (2014). The ultrastructural organization of the liver of rats with experimental hepatitis after drinking mineral water containing humic acids. Voprosy Kurortologii, Fizioterapii, i Lechebnoi Fizicheskoi Kultury, 5, 35-41 (in Russian).
Selyvanov, E. A., Hmilova, G. A., Beljaeva, Y. S., Slepneva, L. V., & Sydorova, N. D. (1997). Sposob kolichestvennogo opredelenija citohroma C v preparatah, soderzhashhih kollagen [Method of quantitative determination of cytochrome C in preparations containing collagen]. Patent of Russian Federation № 2084869, G01N21/25, application number 94023438/25 (in Russian).
Serova, D., Taran, O., & Dyomshina, O. (2016). Biologichna aktyvnist' preparativ na osnovi guminovyh rechovyn u pechinci pishhanok (Meriones unguiculatus) [Biological activity of humic substances in the liver of Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus)]. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, Ecology, 24(2), 410-415 (in Ukrainian).
Stepchenko, L. M. & Skorik, M. V. (2006). Stan systemy antyoksydantnogo zahystu erytrocytiv kurej-nesuchek za dii' guminovyh rechovyn [System status of erythrocyte antioxidant protection of laying hens under the influence of humic substance]. Scientific Bulletin of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnology S. Z. Gzhytsky, 7(3-4), 137-143 (in Ukrainian).
Stepchenko, L. M. (2010). Znachenia katepsinu B ta jogo inhibitoriv v reguljaciji obminnyh procesiv u kurchat-brojleriv za diji rechovyn guminovoji prypody [The value of cathepsin B and its inhibitors in the regulation of metabolism in broiler chickens for the actions of humic substances]. Biologija Tvaryn, 12(2), 180-188 (in Ukrainian).
Surai, P. F., & Fisinin, V. I. (2013). Natural antioxidants in hen's embryogenesis and antioxidant defence in postnatal development. Agricultural Biology, 2, 3-17.
Szabo, J., Vucskits, A. V., Berta, E., Andräsofszky, E., Bersenyi, A., & Hullär, I. (2017). Effect of fulvic and humic acids on iron and manganese homeostasis in rats. Acta Veterinaria Hungarica, 65(1), 66-80.
Vadzyuk, O. B., Mazur, Y. Y., & Kosterin, S. O. (2011). Reguljacija funkcionu-vannja ATR-chutlyvogo K+-kanalu mitohondrij miometrija aktyvnymy formamy kysnju [Regulation functioning of ATP-sensitive K+-channels myometrium mitochondrial reactive oxygen species]. Ukrainian Biochemical Journal, 83(3), 48-57 (in Ukrainian).
Wieckowski, M. R, Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., & Pinton, P. (2009). Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nature Protocols, 4(11), 1582-1590.
Young, D. S. (2014). Effects on clinical laboratory tests: Drugs, disease, herbs and natural products. American Association for Clinical Chemistry.
