CC BY
24
Экспериментальные и клинические исследования
Возрастные различия структурно-метаболических параметров иммунокомпетентных клеток детей
Артемьев С.А.\ Булыгин Г.В.2, Камзалакова Н.И.2
Age-related differences in structural-metabolic parameters of immunocompetent cells of children
Artemiyev S.A., Bulygin G.V., Kamzalakova N.I.
1 Красноярская краевая клиническия больница, г. Красноярск
2 Красноярский государственный медицинский университет им. В.Ф. Войно-Ясенецкого, г. Красноярск
© Артемьев С.А., Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И.
Иммунохимическими методами изучено состояние липидного спектра и активность внутриклеточных ферментов лимфоцитов у детей 1-5 и 6-ю лет. Установлено, что функциональные особенности лимфоцитов детей разных возрастных групп обусловлены не только количественными различиями, но и структурно-метаболическими характеристиками иммунокомпетентных клеток.
Ключевые слова: иммунитет, метаболизм лимфоцитов, ферменты лимфоцитов, липидный спектр лимфоцитов, иммунокомпетентные клетки.
The state of the lipid spectrum and activity of intracellular ferments of lymphocytes have been studied in children 1—5 and 6—10 years old by immunochemical methods. The results suggest that functional peculiarities of lymphocytes in children of different age groups are caused not only by qualitative differences, but also by structural-metabolic characteristics of immunocompetent cells.
Key words: immunity, lymphocyte metabolism, lymphocyte ferments, lipid spectrum of lymphocytes, immunocompetent cells.
УДК 612.017.11:611.083.3
Введение
Из современных данных известно, что при рождении здоровый ребенок имеет сформированную систему иммунитета, состоящую из центральных органов и различных иммунокомпе-тентных клеток, но в то же время функционирование иммунной системы в процессе роста и развития организма ребенка имеет ряд особенностей. В процессе развития наблюдаются определенные критические периоды [6], когда на воздействие чужеродных агентов иммунная система дает неадекватный или даже парадоксальный ответ. Он может носить очень слабый, недостаточный для защиты характер или, наоборот, чрезмерный, гиперергический [2].
Исходя из вышесказанного, цель настоящего исследования — выявление функциональных
особенностей иммунокомпетентных клеток в различные периоды онтогенеза. Материал и методы
Обследованы 50 практически здоровых детей обоего пола: 25 детей в возрасте 1—5 лет и 25 детей в возрасте 6—10 лет. Фенотип лимфоцитов оценивался методом непрямой флюоресценции с мышиными моноклональными антителами на люминесцентном микроскопе «Люмам И-1». На лимфоцитах определялось наличие молекул различных cD-рецепторов [1, з, 7]. Мо-ноклональные антитела, использованные при проведении этой методики, выпускаются ЗАО «Сорбент» (Россия).
Для характеристики функции фагоцитов наиболее информативным оказался показатель времени выхода на пик графика индуцированной
Артемьев С.А., Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И. Возр ров...
хемилюминесценции (ХЛ), который оценивался по методике p. De Soli и соавт. [8] с опсонизиро-ванным зимозаном в качестве активатора индуцированной хемилюминесценции. Фагоцитарный индекс устанавливался методом определения фагоцитарной активности нейтрофилов с использованием латекса.
Состояние гуморального звена иммунной системы оценивалось следующими методами:
D определение концентрации циркулирующих иммунных комплексов проводилось после инкубации сыворотки крови с раствором ПЭГ-6000 и последующим учетом результатов на фотоэлек-трокалориметре [ю];
2) концентрация сывороточных иммуноглобулинов (ig) a, м, g, определялась по методике радиальной иммунодиффузии g. Manchini и соавт. [9];
3) содержание общего igE в сыворотке крови определялось с помощью моноклональных антител (инструкция по применению иммунофер-ментной тест-системы ЗАО «Биоиммуноген», г. Москва).
Изучение липидного спектра лимфоцитов периферической крови проводилось методом тонкослойной хроматографии. Липидные экстракты из лимфоцитов (4,0 6,0 • 106 клеток) готовились по Foich и соавт., разгонка фракций проводилась на силуфолевых пластинках uv-254 (Чехия )c последующим их проявлением 5%-м раствором фосфорно-молибденовой кислоты в 96%-м этаноле. Для определения размеров пиков пластины сканировались на денситометре «Chromoscan-200» (Великобритания). Идентификация липидных фракций осуществлялась при помощи стандартов фирмы «Sigma» (США), а также по относительной подвижности фракций [4]. Определялись следующие фракции липидов: фосфолипиды (ФЛ), холестерин (ХС), свободные жирные кислоты (СЖК), триацилглицериды (ТАГ), эфиры холестерина (ЭХС); их соотношения (ХС/ФЛ, СЖК/ТАГ).
Активность внутриклеточных ферментов в
общей популяции лимфоцитов периферической крови (400 500 • ю3 клеток) определялась биолюминесцентным методом с бактериальной лю-
ые различия структурно-метаболических парамет-
циферазой [5]. Активность вычислялась по наработке восстановленного или окисленного ко-фермента в избыточно обогащенной субстратом среде. Были изучены внутриклеточные НАДФ-зависимые ферменты: глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (Г-6-ФДГ), глицерол-з-фосфат-дегидрогеназа
(Г-з-ФДГ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), малат-дегидрогеназы (НАДМДГ и НАДФМДГ), глута-мат- и изоцитратдегидрогеназы (НАДГДГ, НАД-ФГДГ, НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ), обратные НАДФ-и НАД-зависимые глутаматдегидрогеназы, а также глутатионредуктаза (ГР). Показатели активности ферментов рассчитывались в мкЕ/104 клеток.
Данные приведены в виде среднего значения М и стандартной ошибки среднего значения т. Достоверность различий определяли с помощью {■-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
В младшей возрастной группе определяется достоверно большее количество лейкоцитов (р < 0,05) в периферической крови (табл. 1). При этом среди лейкоцитов преобладают молодые и пролиферирующие клетки: палочкоядер-ные гранулоциты (р < 0,05), лимфоциты (р < 0,001) и моноциты (р < 0,05), являющиеся предшественниками макрофагов.
Таблица 1
Показатели клинического анализа крови и иммунокомпетентных клеток у детей в возрасте 1—5 и 6— 10 лет, М ± т
Показатель Возраст, лет
1—5 6—10
Лейкоциты, мкл 5 918,75 ± 218,90 5 205,26 ± 160,82
Полиморфноядерные, 2,50 ± 0,30 1,62 ± 0,15
Сегментоядерные, % 36,38 ± 1,27 48,68 ± 0,75
Эозинофилы, % 3,13 ± 0,28 3,58 ± 0,29
Моноциты, % 6,94 ± 0,62 5,11 ± 0,35
Лимфоциты, % 51,06 ± 0,98 41,53 ± 0,77
Лимфоциты, мкл 3 004,69 ± 90,36 2 159,26 ± 72,15
CD3, % 60,19 ± 0,71 62,37 ± 0,71
CD3, мкП 1 804,87 ± 50,55 1 343,35 ± 42,38
CD4/CD8 1,33 ± 0,07 1,12 ± 0,04
CD19, % 12,88 ± 0,51 11,26 ± 0,40
CD19, мкл 388,22 ± 22,22 244,75 ± 13,29
|дА, г/л 2,72± 0,17 3,39 ± 0,15
|дМ, г/л 0,95 ± 0,06 1,03 ± 0,06
Экспериментальные и клинические исследования
!дв, г/л 11,06 ± 0,39 12,87 ± 0,41
|дЕ, МЕ 61,88 ± 5,73 46,68 ± 3,08
ФИ, % 56,88 ± 2,65 64,37 ± 1,85
ХЛ, мин 29,13 ± 0,89 22,84 ± 0,71
Среди различий в показателях иммунного статуса (табл. 1) следует отметить у детей 1—5 лет более высокое абсолютное содержание лимфоцитов (p < 0,001), В-клеток ф < 0,001) и Т-лимфоцитов ф < 0,001). При этом если уровень последнего параметра обусловлен только более высоким количеством лейкоцитов в периферической крови, то первые два — и большими относительными показателями соответствующих клеток.
Обращает на себя внимание то обстоятельство, что, несмотря на повышенное у этих детей содержание В-лимфоцитов, функция их невысока — концентрации 1дА и !дв ниже, чем у детей 6—10 лет ф < 0,01). Более высокий в младшей группе уровень !дЕ соответствует известной из литературы повышенной аллергической «готовности» в этом возрасте [6].
Необходимо отметить и различия в функциональных показателях фагоцитарной системы детей обследованных групп. Меньшие возможности этой системы в младшем возрасте подтверждаются снижением ФИ ф < 0,05) и большим временем выхода на пик кривой, индуцированной ХЛ ф < 0,001).
Перечисленные выше онтогенетические различия иммунного статуса обследованных сочетались с особенностями структурно-метаболических параметров их лимфоцитов ( табл. 2). Последние заключались в меньшем содержании в клетках детей 1—5 лет основных структурных компонентов — холестерина ф < 0,01) и фосфо-липидов ф < 0,05), а также ТАГ ф < 0,001). В то же время показатели ЭХХС и суммарного ХС превышали таковые в старшей возрастной группе ф < 0,01 — в обоих случаях). Интегра-тивный показатель СЖК/ТАГ, отражающий баланс процессов липолиза и липогенеза, был выше у младших детей ф < 0,01), что свидетельствует о смещении внутриклеточных реакций в сторону липолиза.
Табл и ца 2
Показатели метаболизма лимфоцитов у детей в возрасте 1
-5
и 6—10 лет, М ± т
Показатель Возраст, лет
1— 5 6 —10
ХС, % 14,20 ± 0,57 16,50 ± 0,46
ФЛ, % 22,09 ± 0,85 25,00 ± 0,76
СЖК, % 8,71 ± 0,49 8,40 ± 0,46
ТАГ, % 9,12 ± 0,31 11,08 ± 0,37
ЭХС, % 45,89 ± 1,67 39,02 ± 1,21
ХОЛ/ФЛ 0,65 ± 0,01 0,67 ± 0,02
СЖК/ТАГ 0,96 ± 0,05 0,77 ± 0,04
Общий ХС, % 60,09 ± 1,24 55,52 ± 1,02
Г-6-ФДГ, мкЕ/104 клеток 8,47 ± 0,70 5,47 ± 0,66
Г-3-ФДГ, мкЕ/104 клеток 24,59 ± 2,29 16,98 ± 2,08
ЛДГ, мкЕ/104 клеток 31,79 ± 2,22 28,26 ± 2,46
НАДМДГ, мкЕ/104 клеток 44,93 ± 2,69 41,11 ± 3,55
НАДФМДГ, мкЕ/104 клеток 7,09 ± 0,83 4,73 ± 0,42
НАДИЦДГ, мкЕ/104 клеток 1,38 ± 0,14 1,56 ± 0,17
НАДФИЦДГ, мкЕ/104 кле- 19,76 ± 1,99 14,87 ± 1,20
ток
НАДГДГ, мкЕ/104 клеток 1,60 ± 0,19 1,74 ± 0,15
НАДФГДГ, мкЕ/104 клеток 4,07 ± 0,16 2,94 ± 0,28
ГР, мкЕ/104 клеток 6,23 ± 0,61 3,81 ± 0,30
Последнее обстоятельство подтверждалось и более высокой активностью фермента Г-3-ФДГ Ф < 0,01), контролирующего подачу избытка субстратов с липидного обмена на гликолиз. Характерной чертой метаболизма лимфоцитов детей 1—5 лет является более высокая активность всех НАДФ-зависимых ферментов (табл. 2): Г-6-ФДГ Ф < 0,01), НАДФИЦДГ ф < 0,1), НАДФГДГ ф < 0,001), НАДФМДГ Ф < 0,01) и ГР ф < 0,01). Такой метаболический профиль клеток свидетельствует о высокой интенсивности в них реакций синтеза и способности к пролиферации.
Заключение
Обобщая представленный материал, можно сделать вывод о том, что онтогенетические особенности функционирования иммунной системы детей разных возрастных групп обусловлены не только количественными различиями показателей иммунитета, но и структурно-мета -болическими характеристиками иммунокомпе-тентных клеток. Последние у детей 1—5 лет свидетельствуют о том, что в клетках более интенсивно протекают реакции холестеринового и жирнокислотного обмена (в сочетании с повы-
Артемьев С.А., Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И. Возр ров...
шенными затратами на реакции обмена энергетических субстратов — ТАГ) с перераспределением избытка липидных субстратов на гликолиз. Высока и способность внутриклеточного метаболизма их лимфоцитов к процессам синтеза и пролиферации за счет выработки повышенного количества НАДФН*. Совокупность этих характеристик, как известно, свойственна активно пролиферирующим, быстро обновляющимся клеточным популяциям. Однако возможности гуморального звена, вероятно, в связи с преобладанием в популяции В-лимфоцитов молодых и функционально незрелых клеток несколько ограничены, что подтверждается меньшим количеством наиболее высокоспецифичных 1дА и до у младших детей. Менее высоки в возрасте 1—5 лет и возможности фагоцитарного звена иммунитета, которые лимитируются как снижением поглотительной способности фагоцитов, так и их презентационной функции.
Литература
1. Иммунология: В з т.: Пер. с англ. / Под ред. У.
\е различия структурно-метаболических парамет-
Пола. М.: Мир, 1987—1988. Т. 2. 456 с.
2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб.:
Спец. лит., 1998. С. 216—229.
3. Лесков В.П., Чередеев А.Н., Горлина Н.К. Клиническая иммунология для врачей. М., 1997. 125 с.
4. Ростовцев В.Н., Резник Г.Е. Количественное определение липидных фракций плазмы крови // Лаб.
дело. 1982. № 4. С. 218—221.
5. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом // Лаб. дело. 1989. № 11.
С. 23—25.
6. Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. Иммунология и иммунопатология детского возраста. М.: Медицина,
1996. 364 с.
7. Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Интерпретация лабораторных показателей при оценке иммунного статуса человека // Лаб. дело. 1991. № 2. С. 6—14.
8.De Soli P., Lippa S., Lixxarru G. Whole blood chemilumines-
cence: a new technical approach to assess oxygen-dependent microbial activity of granulocytes // J. Clin. Lab. Autom. 1983. V. 3. P. 391— 400.
9. Manchini G., Carbonara A.O., Heremas J.F. Immunochemical quantitation of antigens by single radical immunodiffusion // Immuno-chemistry. 1965. V. 2. P. 235—254.
10. Haskova V. et al. Simple method of circulating immune complex // Z. Immunol. Forsch. 1978. Bd. 154. S. 399—406.
Поступила в редакцию 27.08.2008 г.
Сведения об авторах
С.А. Артемьев — канд. мед. наук, анестезиолог-реаниматолог Красноярской краевой клинической больницы (г. Красноярск).
Г.В. Булыгин — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой клинической иммунологии Красноярского государственного медицинского университета им. В.Ф. Войно-Ясенецкого (г. Красноярск).
Н.И. Камзалакова — д-р мед. наук, профессор кафедры клинической иммунологии Красноярского государственного медицинского университета им. В.Ф. Войно-Ясенецкого (г. Красноярск).
Для корреспонденции
Артемьев Сергей Александрвич, тел. (391-2 ) 97-96-97; e-mail: [email protected]
