CC BY
44
УДК 612.822.3
ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ МОДУЛЯЦИИ ЦИКЛИЧЕСКИМ ПЕПТИДОМ МЕДЛЕННЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ МЕМБРАНЫ
НОЦИЦЕПТИВНОГО НЕЙРОНА
Цель. Настоящая работа направлена на решение важнейшей проблемы лечения хронической боли путем создания новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов, способных заменить опиоидные анальгетики.
Работа выполняется с целью создания анальгетика пептидной природы, сравнимого по эффективности и безопасности с разрабатываемым нами синтетическим неопиоидным анальгетиком «Аноцептином®», успешно прошедшим первую фазу клинических исследований.
Материалы и методы. С помощью квантовохимических расчетов и метода локальной фиксации потенциала проанализированы особенности пространственного строения молекулы состоящего из 14 аминокислот циклического пептида цикло-(CPRERRACPRERRA) с замкнутой дисульфидной связью (PP-14) и исследована его способность снижать потенциалочувствительность медленных натриевых каналов Nav1.8. Методом органотипического культивирования эмбриональной нервной ткани исследовано влияние PP-14 на рост нейритов сенсорных нейронов.
Результаты. Установлено, что пептид PP-14 снижает потенциалочувствительность ответственных за кодирование болевых сигналов медленных натриевых каналов Nav1.8, уменьшая величину эффективного заряда их активационной воротной системы. Это свидетельствует о возможном анальгетическом действии PP-14. Показано, что данный агент не с высокой степенью вероятности не будет обладать нейротоксиче-скими свойствами. Исследование механизма модуляции каналов Nav1.8 пептидом PP-14 показало его отличие от механизма анальгетического действия коменовой кислоты (лекарственной субстанции препарата «Аноцептин®»): действие PP-14 не связано с активацией трансдукторной функции Na+, ^-АТФазы.
Заключение. В настоящей работе приведены доказательства того, что циклопептид PP-14 снижает потенциалочувствительность каналов Nav1.8 с той же эффективностью, что и коменовая кислота, но механизмы действия этих субстанций на мембрану ноцицептивного нейрона различны. Молекулярной мишенью PP-14 служит канал Nav1.8, при этом процесс лиганд-рецепторного связывания исследуемого агента с каналом также приводит к снижению эффективного заряда его активационной воротной системы. PP-14 может считаться перспективной лекарственной субстанцией анальгетика пептидной природы, специфический механизм действия которого обусловлен его прямым связыванием с каналами Nav1.8.
Ключевые слова: метод локальной фиксации потенциала, квантовохимические расчеты, метод органотипического культивирования эмбриональной нервной ткани, каналы Nav1.8, пептиды, ноцицепция.
Шелых Т.Н., Плахова В.Б., Рогачевский И.В., Пеннияйнен В.А Подзорова С.А., Крылов Б.В.
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН Россия, 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6 [email protected]
Реферат
POSSIBLE MECHANISM OF MODULATION OF SLOW SODIUM CHANNELS OF NOCICEPTIVE NEURON MEMBRANE BY CYCLIC
PEPTIDE
Shelykh ^N., Plakhova V.B., Rogachevsky I.V., Penniyaynen V.A.,
Podzorova S.A., Krylov B.V.
I.P. Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences 6 Makarova emb., Saint-Petersburg, 199034, Russia [email protected]
Abstract
Purpose. The present work helps solve an extremely important problem of chronic pain relief by development of novel effective and safe medicinal substances which could replace opioid analgesics in clinical practice. The aim of the study is to design a peptide analgesic substance, comparable in efficiency and safety to synthetic non-opioid analgesic "Anoceptin®" which is developed by us and which has successfully passed the first phase of clinical trials.
Materials and methods. The spatial structure of the cyclic peptide PP-14, cyclo-(CPRERRACPRERRA), which consists of 14 aminoacid residues stabilized by a disulfide bond, was studied quantumchemically. The ability of PP-14 to decrease the voltage sensitivity of slow sodium channels Nav1.8 was investigated by the patch-clamp method. The effect of PP-14 on growth of sensory neuron neurites was examined by organotypic culturing of embryonic nerve tissue.
Results. PP-14 was established to decrease the voltage sensitivity of slow sodium channels Nav1.8 that are responsible for nociceptive signal coding. PP-14 decreases the effective charge of their activation gating device, which indicates that the peptide might have analgesic properties. PP-14 was not demonstrated to exhibit any neurotoxic effects. Investigation of modulation of Nav1.8 channels by PP-14 has shown that its mechanism is distinct from the mechanism of analgesic action of comenic acid (medicinal substance of "Anoceptin®"): PP-14 does not activate the transducing function of Na+,K+-ATPase.
Conclusion. It is demonstrated that cyclic peptide PP-14 decreases the voltage sensitivity of Nav1.8 channels with efficiency comparable to that of comenic acid. However, the mechanisms of action of these substances on the nociceptive neuron membrane are radically different. The molecular target of PP-14 is Nav1.8 channel, and ligand-receptor binding of the studied agent to the channel results in a decrease of the effective charge of its activation gating device. PP-14 may be considered as a perspective medicinal substance of a peptide analgesic, the effect of which is specific due to its direct binding to Nav1.8 channels.
Keywords: patch-clamp method, quantum-chemical calculations, organotypic tissue culturing, channels Nav1.8, peptides, nociception.
Введение
Нейроны дорзальных ганглиев, связанные с С-волокнами, экспрессируют потенциалозависи-мые натриевые каналы, нечувствительные к тетро-дотоксину (Nav1.8) [1-7]. Каналы Nav1.8 играют важную роль в проявлениях гипервозбудимости и боли, вызванных повреждениями соматических структур [8]. Амплитуда токов каналов Nav1.8 оказывается увеличенной в сенсорных нейронах при воздействии основных медиаторов, участвующих в воспалительных процессах, таких как аденозин [9], эндотелин [10], фактор роста нервной ткани
[11] и т.д. Установлено, что плотность этих каналов увеличивается при сильной зубной боли [12]. Результаты ряда исследований указывают на то, что каналы Nav1.8 играют важную роль в проявлении нейропатической боли, например, эти медленные натриевые каналы становятся функционально более активными при диабетической нейропатии [13].
Очевидно, что безопасный и селективный модулятор функциональной активности каналов Nav1.8 может иметь огромный терапевтический потенциал. Новый подход к поиску подобного модулятора основан на использовании обнаруженных нами молекулярных механизмов лиганд-рецепторного
связывания с указанными каналами ряда субстанций пептидной и непептидной природы [14-16]. Предыдущие исследования доказали, что, основываясь на этих механизмах, можно разработать принципиально новый анальгетик («Аноцептин®»), способный в ряде случаев заменить опиоидные обезболивающие препараты. Лекарственная субстанция указанного анальгетика (коменовая кислота) ре-цептор-опосредованно, воздействуя на опиоидопо-добные мембранные рецепторы, инициирует «тангенциальную» передачу сигнала к Na+,K+-АТФазе, играющей здесь роль трансдуктора сигнала, и затем к каналам Nav1.8, отвечающим за кодирование ноцицептивной информации. Кроме этого, сигнал от №+,К+-АТФазы трансдуктор-опосредованно должен «радиально» передаваться и на геном клетки, запуская, в соответствии с результатами наших предыдущих исследований, процессы регенерации. Очевидно, что эта рецептор-опосредованная активация трансдукторной функции Na+,K+-АТФазы должна приводить к купированию хронической боли благодаря передаче сигнала на эффекторное звено — канал Nav1.8. Прервать этот каскадный процесс можно с помощью больших концентраций специфического блокатора натриевого насоса — уабаина. Именно такое использование указанного агента позволяет ответить на вопрос, является ли мишенью атакующей молекулы собственно канал Nav1.8 или связанные с ним «соседние» молекулярные структуры — опиоидоподобный рецептор и Na+, К+-АТФаза? Более подробно этот подход описан нами в другой работе [16].
Настоящая статья посвящена выяснению возможного механизма действия субстанции пептидной природы цикло-^PRERRACPRERRA) с замкнутой дисульфидной связью (PP-14) на медленные натриевые каналы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что PP-14 может оказаться сравним по эффективности с коменовой кислотой, лекарственной субстанцией синтетического неопи-оидного анальгетика «Аноцептина®», успешно прошедшего первую фазу клинических исследований.
Материалы и методы исследования
Ионные токи регистрировали методом локальной фиксации потенциала (patch-clamp method) в конфигурации «регистрация активности целой клетки» («whole-cell») [17]. Объектом исследования являлись культивируемые изолированные сенсорные нейроны, выделенные из ганглиев областей Ls—S1 спинного мозга новорожденных крыс линии Wistar. Культивирование изолированных нейронов в течение двух часов в стандартных питательных средах с использованием СО2-инкубатора позволяет получить интактные клетки. Подробно метод получения этих нейронов описан нами ранее [18].
Опыты проводили с помощью аппаратно-программного комплекса, включающего в себя усилитель EPC 7 (patch-clamp L/M-EPC 7), персональный компьютер и разработанный нами пакет программ для автоматизации научных исследований. Микроэлектроды изготавливали из мягкого
стекла, вытягивали в две стадии, добиваясь величины сопротивления в 1-3 МОм. Потенциал внутри микроэлектрода составлял обычно -60 мВ относительно потенциала внеклеточного раствора, равного нулю. После образования плотного "гига-омного" контакта клетку поднимали над дном экспериментальной камеры, что позволяло в ряде случаев сменить внеклеточный раствор без ухудшения условий фиксации и регистрации натриевых токов. Записи токов начинали спустя несколько минут, за это время происходило замещение внутриклеточной среды на внутриклеточный раствор, заполняющий микроэлектрод. Регистрацию токов обычно производили в течение часа. В ходе каждого эксперимента определялись величины не только последовательного сопротивления, но и емкости мембраны (Cm), вычитались токи утечки (IL) и токи, протекающие через емкость мембраны (IC). Воздействия на мембрану нейрона осуществляли с помощью ступенек разности потенциалов различной величины и длительности. В ритме эксперимента строилась "пиковая вольт-амперная характеристика", по которой определяли величину "хордовой" проводимости (GNa), а также значение эффективного заряда активационной воротной системы медленных натриевых каналов. По максимальным (пиковым) значениям каждого из токов данного семейства строилась пиковая вольт-амперную характеристика. Потенциалы реверсии токов (E) определяли как точку пересечения правой ветви вольт-амперной характеристики с осью потенциалов. Для исследования характеристик натриевых токов в опытах использовали стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л). Внеклеточный: NaCl - 65, CaCl2 - 2, MgCl2 - 2, Choline Cl - 90, HEPES Na - 10, тетродотоксин -0.0003, pH 7.4. Внутриклеточный: CsF - 100, NaCl -10, CsCl - 40, MgCl2 - 2, HEPES Na - 10, pH 7.2. Исключение из растворов ионов калия позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе обеспечивали блокирование кальциевых токов [5, 19]. В работе использованы реактивы фирмы "Sigma Chemical Co." (США).
Циклопептид PP-14 получен методом классического пептидного синтеза, для чего применяли реактивы и производные аминокислот фирм "Sigma Chemical Co." (США), "Iris Biotech GmbH" (Германия), растворители производства компаний "Экос-1" и "Криохром" (Россия). Конечный продукт характеризовали с помощью аналитической ВЭЖХ (чистота >95%) и масс-спектрометрии.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью t-критерия Стьюден-та. Достоверными считали различия при р < 0.05.
Полную оптимизацию геометрических параметров изолированной молекулы PP-14 осуществляли полуэмпирическим методом AM1 с применением программы GAMESS [20].
Влияние PP-14 на рост нейритов сенсорных ганглиев оценивали с помощью метода органоти-пической культуры ткани. Объектами исследования служили сенсорные ганглии 10-12-дневных
куриных эмбрионов, культивируемые в чашках Петри на подложках из коллагена в СО2-инкубаторе ("Sanyo", Япония) в течение 3 суток при 36.5°С и 5% СО2. Питательная среда содержала 45% раствора Хенкса, 40% среды Игла, 10% фетальной сыворотки коровы с добавлением инсулина (0.5 ед/мл), глюкозы (0.6%), глютамина (2 ммоль/л) и гентамицина (100 ед/мл). Контрольными служили эксплантаты, культивируемые только в условиях питательной среды. В культуральную среду добавляли исследуемый циклопептид в широком диапазоне концентраций. Для количественной оценки роста эксплантатов применяли морфометрический метод. Индекс площади рассчитывали как отношение площади зоны роста эксплантата к исходной площади. Контрольное значение исходной площади принимали за 100%. Статистический анализ результатов производили при помощи программы STATISTICA 8.0 с использованием t-критерия Стьюдента. Для визуализации объектов использовали микроскоп Axio Observer Z1 ("Carl Zeiss", Германия). Полученные изображения анализировали с использованием программ ImageJ и ZEN_2012. Работа выполнена на оборудовании ЦКП "Конфо-
кальная микроскопия" Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Новорожденные крысы были получены в Центре коллективного пользования биоресурсной коллекцией Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии им. И.П.Павлова РАН.
Результаты исследования и их обсуждение
С помощью метода локальной фиксации потенциала была исследована способность циклического пептида РР-14 снижать потенциалочувствитель-ность медленных натриевых каналов Nav1.8, ответственных за кодирование болевых сигналов. РР-14 представляет собой синтетический циклический пептид цикло-(Сys1-Pro2-Arg3-Glu4-Arg5-Arg6-Ala7-Cys8-Pro9-Arg10-Glu11-Arg12-Arg13-Ala14) с замкнутым дисульфидным мостиком Cys1-Cys8. В процессе проведения эксперимента осуществлялась регистрация семейств натриевых токов Nav1.8 в ответ на приложение ступенек потенциала в соответствии с программой эксперимента в контрольных условиях и после приложения исследуемого агента (рис. 1 а, б).
Рисунок 1. Семейства медленных натриевых токов до и после воздействия PP-14.
а - контрольные записи. б - семейство натриевых токов после приложения РР-14 в концентрации 100 нмоль/л.
Тестирующий потенциал изменялся от -35 до 45 мВ с шагом 10 мВ. Во всех записях поддерживаемый потенциал, длительность которого составляла 500 мс, был равен -110 мВ. Токи утечки и емкостные токи вычтены программным способом.
Действие исследуемого агента приводило к изменению ряда характеристик медленных натриевых каналов. Сравнение семейств натриевых токов, за-
регистрированных до и после действия РР-14, позволяет сделать заключение, что амплитуда тока уменьшается. Это уменьшение амплитуды в неко-
торой степени обусловлено так называемым "rundown эффектом", являющимся ограничением, внутренне присущим методу локальной фиксации потенциала.
Наиболее важным стационарным параметром, определяющим электровозбудимость сенсорного нейрона, служит эффективный заряд (Zeff) актива-ционной воротной системы медленных натриевых каналов Nav1.8. Для его количественного измере-
ния строили пиковые вольт-амперные характеристики обычным способом [21]. При подаче на мембрану последовательности ступенек напряжения (Е) регистрировали амплитудные (пиковые) значения токов (1тах), которые были представлены в виде функции 1тах (Е). На рисунке 2 приведены нормированные пиковые вольт-амперные характеристики натриевых токов в контрольном эксперименте и после приложения пептида РР-14 в концентрации 100 нмоль/л.
Е, мв
-50 -35 -20 -5 10 25
-0.1 ■
-0.6 ■
-1.1 J
40 □
□ 1 ■2
а в ■
Рисунок 2. Нормированные значения пиковых вольт-амперных характеристик медленных натриевых каналов.
1 - контрольные записи; 2 - после приложения РР-14 в концентрации 100 нмоль/л.
Основной эффект, позволяющий обнаружить количественную связь между потенциалочувстви-тельностью активационной воротной системы медленных натриевых каналов и воздействием исследуемого агента, проявляется в изменении крутизны левой ветви вольт-амперной характеристики, что может быть более наглядно представлено после построения зависимости хордовой проводимости от потенциала GNa(E). Эта функция строится следующим образом:
^а(Е) = Imax(E)/(E-ENa), (1)
где 1(Е) — амплитудное значение тока при деполяризующем потенциале Е, Е№ — величина потенциала реверсии натриевого тока. Функция GNa(E) имеет начальный S-образный участок, крутизна которого отражает особенности потенциало-чувствительности активационного процесса. Для количественной оценки функции GNa(E) обычно применяется распределение Больцмана. При этом
предполагается, что стационарные характеристики переходов между состояниями активационной системы натриевых каналов определяются потен-циалозависимостью хордовой проводимости, что, однако, весьма спорно. Впервые величину эффективного заряда активационной воротной системы натриевых каналов определили создатели мембранной ионной теории [21-23]. В настоящей работе для оценки величины эффективного применяется другой подход [24]. Можно предположить, что число открытых каналв (Ко) пропорционально величине хордовой проводимости GNa(E), а число закрытых каналов (Кс) соответствует ^№тах - GNa(E)}.
Тогда, применяя метод Алмерса [24], можно получить:
/Ы) = (Е)/ GNamax - GNa (Е)^Сехр^еЕ/кТ], (2)
где С — константа, Zeff — эффективный заряд, выраженный в единицах заряда электрона е [23],
к - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура. Очевидно, что при Е^ -да указанная функция представляет собой одну экспоненту, которая может быть аппроксимирована с удовлетворительной точностью регрессионной прямой, проходящей через несколько начальных точек (рис. 3). Здесь иллюстрирован способ построения Zeff с помощью функции (2). Тангенсы углов наклона регресси-
онных прямых построены по первым трем точкам и определяют предельную логарифмическую чувствительность медленных натриевых каналов к потенциалу в контрольном опыте и после воздействия РР-14. Величина эффективного заряда, представленная в единицах заряда электрона, снижалась с контрольного значения Zeff равного 6.6 до 4.7 после приложения исследуемого агента (рис. 3).
О
9 п
7 -
& л
S5
Ü з
1 -
■i -I ^
г
О
^ з
-5 -
tff
6.6
□1 ■ 2
-50
-30
-10
10
30
Е, мв
Рисунок 3. Влияние PP-14 на потенциалочувствительность активационной воротной системы
медленных натриевых каналов.
1 - контрольные записи; 2 - после приложения PP-14 в концентрации 100 нмоль/л.
Экспоненциальная функция, представленная в логарифмическом масштабе (ось ординат), позволяет определить величину Zeff по тангенсу угла наклона асимптот, проведенных к начальным участкам этих функций в контрольном опыте и после приложения исследуемых агентов.
Следующая серия экспериментов была направлена на уточнение молекулярной мишени, с которой происходит связывание исследуемого цикло-пептида РР-14. Ранее при исследовании действия коменовой кислоты и ряда кардиотонических стероидов на медленные натриевые каналы мембраны ноцицептивного нейрона нами было установлено, что Na+,K+-АТФаза является важным последовательным звеном в передаче сигнала, запускаемого указанными агентами [25-27]. Она выполняет здесь не только насосную, но и трансдукторную функцию. Выключение этой трансдукторной функции можно осуществить воздействием больших концентраций уабаина (200 мкмоль/л). Сочетанное применение РР-14 и больших концентраций уа-баина позволяет выяснить возможное существование связи между трансдукторной функцией
№+,К+-АТФазы и каналами Nav1.8. В том случае, когда молекулярной мишенью РР-14 служит №+,К+-АТФаза, а канал Nav1.8 является здесь лишь эффекторным звеном, применение больших концентраций уабаина должно привести к блокированию сигнала исследуемого агента. Сочетанное действие циклопептида РР-14 (100 нмоль/л) и уабаина (200 мкмоль/л) на мембрану ноцицеп-тивного нейрона приводило к смещению вправо пика вольт-амперной характеристики, а также к снижению крутизны начального участка ее левой ветви (рис.4 а). Использование метода Алмерса позволило установить, что исследуемый агент в присутствии больших концентраций уабаина все же снижает величину эффективного заряда акти-вационной воротной системы каналов Nav1.8 на полтора заряда электрона (рис. 4 б).
Е, мв
-50 -35 -20 -5 10 25 40
-0.1
в
-0.6
-1.1
' ■
I П_1
В
□ ■
□
В Ш
в.В
и
9
5 ■
2 3 .
О н
т 1
0 _ 1
-1 ^
У.
о
в
я
2
О
-з ■
_5
-7
-50
-30 -10
Е, мв
10
30
Рисунок 4. Влияние уабаина и PP-14 на медленные натриевые каналы Nav1.8.
(а) Нормированные значения пиковых вольт-амперных характеристик медленных натриевых каналов. 1 - контрольные записи; 2 - после предварительного приложения уабаина в концентрации 200 мкмоль/л и РР-14 в концентрации 100 нмоль/л.
(б) Влияние уабаина и РР-14 на потенциалочувствительность активационной воротной системы медленных натриевых каналов. 1 - контрольные записи; 2 - после предварительного приложения уабаина в концентрации 200 мкмоль/л и РР-14 в концентрации 100 нмоль/л.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что уабаин не влияет на способность РР-14 модулировать натриевые каналы Nav1.8.
На рисунке 5 представлены обобщающие данные, свидетельствующие о том, что воздействие
циклопептида РР-14 в концентрации 100 нмоль/л с наружной стороны мембраны ноцицептивного нейрона приводит к значительному снижению эффективного заряда каналов Nav1.8 (почти на два заряда электрона). При этом «выключение» транс-
Рисунок 5. Снижение эффективного заряда активационной воротной системы медленных натриевых каналов в
контрольных экспериментах и после приложения PP-14.
1 - контрольные записи 2еАг = 6.7±0.4 (п=14); 2 - после приложения РР-14 в концентрации 100 нмоль/л 2еАг = 4.7±0.4 (п=13); 3 - после предварительного приложения уабаина в концентрации 200 мкмоль/л и РР-14 в концентрации 100 нмоль/л 2еАг = 4.9±0.3 (п=10). * - значения статистически достоверны при р < 0.05.
дукторной функции №+,К+-АТФазы не оказывало влияния на модуляцию активационного воротного устройства каналов Nav1.8 при воздействии цикло-пептида РР-14. Эти данные исключают возможность участия №+,К+-АТФазы в качестве последовательного звена в передаче сигнала, вызываемого воздействием исследуемого агента. Его специфической мишенью служит медленный натриевый канал, точнее, его активационное воротное устройство.
С помощью метода органотипической культуры ткани исследовали влияние PP-14 на рост нейритов сенсорных нейронов. В качестве объекта изучения были выбраны эксплантаты сенсорных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов, культивируемых в чашках Петри на подложках из коллагена в СО2-инкубаторе («Sanyo», Япония) в течение 3 суток при 36.5°С и 5% СО2 (рис. 6). Циклический пептид PP-14 был исследован в концентрациях 10 нмоль/л, 0.1 мкмоль/л и 1 мкмоль/л (рис. 7). Установлено, что препарат ни в одной из исследованных концентраций не оказывал влияния на рост исследуемой ткани. Индекс площади роста опытных эксплантатов спинальных ганглиев не отличался от контрольного значения.
Метод органотипической культуры нервной ткани является общепризнанным методом оценки биологической активности различных субстанций для поиска и тестирования новых лекарственных пре-
паратов. Преимуществом метода является возможность количественной оценки влияния исследуемых агентов на развитие клеточного сообщества, составляющего исследуемую ткань [28, 29]. Этот метод позволяет также обнаружить новые молекулярные мишени и организацию внутриклеточных сигнальных процессов при действии субстанций, претендующих на роль лекарственных препаратов.
В эмбриогенезе спинальных ганглиев первые нейробласты появляются у куриного эмбриона на 3-и сутки инкубации. Пролиферативная активность нервных клеток спинальных ганглиев заканчивается к десятому дню эмбрионального развития [28, 30]. Дифференцировка эмбриональных нервных клеток и превращение их в нейроны и клетки нейроглии происходит с 3-го по 7-й день развития куриного эмбриона. На девятые сутки инкубации у куриных эмбрионов формируется соединительнотканная капсула ганглия и увеличивается число клеток [28]. К восьмому дню развития куриного эмбриона, т. е. ко времени возникновения первых рефлекторных движений, связи сенсорных клеток ганглия и двигательных нейронов в спинном мозгу оказываются уже установлены с мишенями [28, 31]. Всё это позволяет заключить, что исследованный нами циклопептид РР-14 не оказывает влияния на процессы пролиферации и дифференцировки нервной ткани. В противном случае воздействие такого
Рисунок 6. Микрофотография эксплантата спинального ганглия 10-12-дневного куриного эмбриона через трое суток культивирования (об. 10). Контроль.
1 нМ 0.1 мкМ 1 мкМ
Рисунок 7. Изменение индекса площади (ИП) эксплантатов спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов
при воздействии PP-14.
1 - контроль (n=25); 2 - при воздействии PP-14 в концентрациях 10 нмоль/л (n=23), 0.1 мкмоль/л (n=25) и 1 мкмоль/л (n=27).
Рисунок 8. Пространственное строение молекулы РР-14 по результатам полной оптимизации геометрии методом АМ1.
Гуанидиновые группы, невовлеченные во внутримолекулярные взаимодействия, выделены овалами. Буква 8 указывает на атомы серы, участвующие в образовании дисульфидной связи.
рода могло бы привести к негативным побочным эффектам, включая проявления нейротоксических свойств.
Квантовохимические расчеты показали, что конформация PP-14, полученная в рамках полной оптимизации геометрических параметров указанной молекулы полуэмпирическим методом AM1 (рис. 8), стабилизирована наличием дисульфидного мостика Cys1-Cys8, а также существованием внутримолекулярных ион-ионных связей Glu4-Arg6 и Glu11-Arg13. При этом боковые цепи аргинильных остатков Arg3, Arg5, Arg10 и Arg12 оказываются сте-рически доступными и невовлеченными в сильные внутримолекулярные взаимодействия, и можно предположить, что именно гуанидиновые группы указанных аргинильных остатков претендуют на роль функциональных групп, ответственных за связывание молекулы РР-14 с каналом Nav1.8.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый циклопептид РР-14 имеет в качестве своей специфической мишени определенный сайт, локализованный непосредственно на канале Nav1.8, связывание изучаемой молекулы с которым приводит к снижению переноса эффективного заряда активационной воротной системой указанного канала. В отличие от тех пептидных анальгетиков, которые активируют опиоидные рецепторы, воздействие РР-14, видимо, совершенно безопасно, поскольку анальгетический эффект здесь возникает благодаря специфическому воздействию на иную молекулярную мишень, которой являются медленные натриевые каналы Nav1.8, ответственные за кодирование ноцицептивных сигналов [1, 9, 32].
Ранее нами было установлено, что механизм действия трипептида Ac-RER-NH2 так же обусловлен модуляцией именно каналов Nav1.8 [15] В цитируемой работе была изучена способность ар-гининсодержащих трипептидов Ac-RER-NH2, Ac-RR-NH2 и свободной молекулы Arg модулировать возбудимость мембраны ноцицепторов. Приложение молекулы Ac-RER-NH2 к наружной мембране ноцицептивного нейрона так же вызывает снижение величины Zeff активационной воротной системы каналов Nav1.8. В отличие от этого, свободная молекула аргинина (R) и молекула дипептида RR не оказывали влияния на электрофизиологические характеристики каналов Nav1.8, в то время как молекула трипептида RER в форме Ac-RER-NH2 в концентрации 1 мкмоль/л вызывала достоверное снижение величины эффективного заряда их ак-тивационного воротного устройства. Исследуемый в настоящей работе циклопептид РР-14 оказывает более выраженное действие на канал Nav1.8: такое же снижение величины эффективного заряда достигается при его приложении в концентрации на порядок ниже, чем концентрация трипептида.
Полученные на основе метода локальной фиксации потенциала и квантовохимических расчетов данные позволяют сделать предположения: 1) эффективность узнавания атакующей молекулы может определяться ее общим положительным зарядом; 2) отрицательно заряженный остаток глутаминовой кислоты за счет образования внутримолекулярных
ион-ионных связей, ограничивающих конформаци-онную свободу атакующей пептидной молекулы, помогает данной молекуле принять продуктивную конформацию для наиболее эффективного формирования лиганд-рецепторного комплекса. Основной вклад в энергетику его образования, видимо, вносят высокоэнергетические ион-ионные связи между положительно заряженными гуанидиновыми группами боковых цепей двух аргинильных остатков молекулы Ac-RER-NH2 или исследованного циклического пептида и отрицательно заряженными нуклеофильными группами в составе молекулярной мишени — канала Nav1.8. Поскольку свободная молекула аргинина и дипептид Ac-RR-NH2 не проявили эффекта при исследовании методом локальной фиксации потенциала, можно сделать вывод, что для связывания с каналом Nav1.8 необходимо наличие как минимум двух положительно заряженных групп в составе атакующей молекулы, причем данные группы должны быть соответствующим образом ориентированы и расположены на определенном расстоянии друг от друга для обеспечения возможности наиболее энергетически выгодного связывания пептида. Циклический пептид РР-14 удовлетворяет этим требованиям.
Основным результатом проведенного исследования можно считать обнаружение циклической субстанции пептидной природы, действие которой в очень низкой концентрации приводит к резкому снижению величины Zeff активационной воротной системы каналов Nav1.8. Обнаруженный механизм модуляции этих каналов, ответственных за кодирование ноцицептивных сигналов, может стать основой действия нового анальгетика, лекарственной субстанцией которого может служить циклический пептид РР-14.
Заключение
В рамках представленного исследования был синтезирован циклический пептид PP-14 (цикло-(Cys,-Pro2-Arg3-Glu4-Arg5-Arg6-Ala7-Cys8-Pro9-Arg,0-Glu,,-Arg,2-Arg,3-Ala14) с замкнутым дисуль-фидным мостиком Cys,-Cys8). С помощью кван-товохимических расчетов, метода локальной фиксации потенциала и метода органотипическо-го культивирования нервной ткани проанализированы особенности пространственного строения молекулы PP-14 и исследована его способность контролировать возбудимость мембраны ноци-цептивного нейрона. Установлено, что пептид PP-14 снижает потенциалочувствительность ответственных за кодирование болевых сигналов медленных натриевых каналов Nav1.8, уменьшая величину эффективного заряда их активацион-ной воротной системы. Это свидетельствует о возможном анальгетическом действии PP-14. Доказано, что этот агент не обладает нейро-токсическими свойствами. Все это указывает на перспективность дальнейшего исследования ар-гининсодержащих пептидов для разработки лекарственной субстанции нового анальгетического препарата пептидной природы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kostyuk PG, Veselovsky NS, Tsyndrenko AY. Ionic currents in the somatic membrane of rat dorsal root ganglion neurons. Neuroscience. 1981; 6(12): 2423-2430.
2. Roy ML, Narahashi T. Differential properties of tetrodotoxin-sensitive and tetrodotoxin-resistant sodium channels in rat dorsal root ganglion neurons. Neuroscience. 1992; 12(6): 21042111.
3. Caffrey JM, Eng DL, Black JA, Waxman SG, Kocsis JD. Three types of sodium channels in adult rat dorsal root ganglion neurons. Brain Res. 1992; 592(1-2): 283-297.
4. Cohen SA, Barchi RL. Voltage-dependent sodium channels. Int Rev Cytol. 1993; 137: 55-103.
5. Elliott AA, Elliott JR. Characterization of TTX-sensitive and TTX-resistant sodium currents in small cells from adult rat dorsal root ganglia. J Physiol Lond. 1993; 463(4): 39-56.
6. Jeftinija S. The role of tetrodotoxin-resistant sodium channels of small primary afferent fibers. Brain Res. 1994; 639(1): 125-134.
7. Carrier GO, Ikeda SR. TTX-sensitive Na+ channels and Ca2+ channels of the L- and N-type underlie the inward current in acutely dispersed coeliac-mesenteric ganglia neurons of adult rats. Pflugers Arch. 1992; 421(1): 7-16.
8. Yamane H, de Groat WC, Sculptoreanu A. Effects of ralfinamide, a Na+ channel blocker, on firing properties of nociceptive dorsal root ganglion neurons of adult rats. Exp Neurol. 2007; 208(1): 63-72.
9. Gold M, Reichling D, Shuster M, Levine J. Hyperalgesic agents increase a tetrodotoxin-resistant Na+ current in nociceptors. Proc Natl Acad Sci. USA. 1996; 93(3): 1108-1112.
10. Zhou Z, Davar G, Strichartz G. Endothelin-1 (ET-1) selectively enchances the activation gating of slowly inactivating tetrodotoxin-resistant sodium currents in rat sensory neurons: a mechanism for the pain-inducing actions of ET-1. Neuroscience. 2002; 22(15): 6325-6330.
11. Zhang YH, Vasko MR, Nikol GD. Ceramide, a putative second messenger for nerve growth factor, modulates the TTX-resistant Na(+) current and delayed rectifier K(+) current in rat sensory neurons. J Physiol. 2002; 544(2): 385-402.
12. Renton T, Yiangou Y, Plumpton C, Tate S, Bountra C, Anand P. Sodium channel NaV 1.8 immunoreactivity in painful human dental pulp. BMC Oral Health. 2005; 5(1): 5.
13. Hirade M, Yasuda H, Omatsu-Kanbe M, Kikkawa R, Kitasato H. Tetrodotoxin-resistant sodium channels of dorsal root ganglion neurons are readily activated in diabetic rats. Neuro science. 1999. 90(3): 933-939.
14. Plakhova V, Rogachevsky I, Lopatina E, Shelykh T, Butkevich I, Mikhaienko V, et al. A novel mechanism of modulation of slow sodium channels: from ligand-receptor interaction to design of an analgesic medicine. Activitas Nervosa Superior Rediviva. 2014; 56(3-4): 55-64.
15. Шелых Т.Н., Рогачевский И.В., Ноздрачев А.Д., Веселки-на О.С., Подзорова С.А., Крылов Б.В. и др. Молекулярный механизм модуляции трипептидом возбудимости мембраны ноцицептивного нейрона. Доклады академии наук. 2016; 466(6): 734-737. [Shelykh T.N., Rogachevsky I.V., Nozdrachev A.D., Veselkina O.S., Podzorova S.A., Krylov B.V. et al. Molecular mechanism of modulation of nociceptive neuron membrane excitability by a tripeptide. Doklady Biochemistry and Biophysics. 2016; 466(1): 77-80. (In Russian)].
16. Krylov BV, Rogachevskii IV, Shelykh TN, Plakhova VB. Frontiers in pain science. Volume 1. New non-opioid analgesics: understanding molecular mechanisms on the basis of patch-
clamp and quantum-chemical studies. Bentham Science Publishers Ltd Sharjah UAE. 2017.
17. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 1981; 391(1): 85-100.
18. Плахова В.Б., Подзорова С.А., Мищенко И.В., Баграев Н.Т., Клячкин Л.Е., Маляренко А.М. и др. Возможные механизмы действия инфракрасного излучения на мембрану сенсорного нейрона. Сенсорные системы. 2003; 17(1): 24-31.
19. Kostyuk PG, Krishtal OA, Pidoplichko VI. Effect of internal fluoride and phosphate on membrane currents during intracellular dialysis of nerve cells. Nature. 1975; 257(5528): 691-693.
20. Schmidt MW, Baldridge KK., Boatz JA, Elbert ST, Gordon MS, Jensen JH, et al. General atomic and molecular electronic structure system. Journal of computational chemistry. 1993; 14(11): 1347-1363.
21. Hodgkin AL, Huxley AF. Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo. J Physiol. 1952a; 116(4): 449-472.
22. Hodgkin AL, Huxley AF. The dual effect of membrane potential on sodium conductance in the giant axon of Loligo. J Physiol. 1952b; 116(4): 497-506.
23. Hodgkin AL, Huxley AF. A quantitative description ofmembrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 1952c; 117(4): 500-544.
24. Almers W. Gating currents and charge movements in excitable membranes. Rev Physiol. Biochem Pharmacol. 1978; 82: 97-190.
25. Derbenev AV, Krylov BV, Shurygin AYa. Effects of meconic and comenic acids on slow sodium channels of sensory neurons. Membr Cell Biol. 2000; 13(3): 379-387.
26. Lopatina EV, Yachnev IL, Penniyaynen VA, Plakhova VB, Podzorova SA, Shelykh TN, et al. Modulation of signal-transducing function of neuronal membrane Na+,K+-ATPase by endogenous ouabain and low-power infrared radiation leads to pain relief. Medicinal Chemistry. 2012; 8(1): 33-39.
27. Yachnev IL, Plakhova VB, Podzorova SA, Shelykh TN, Rogachevsky IV, Krylov BV. Mechanism of pain relief by low-power infrared irradiation: ATP is an IR-target molecule in nociceptive neurons. Medicinal chemistry. 2012; 8(1): 14-21.
28. Коновалов Г.В., Оленев С.Н., Чумасов УИ. Культура нервной ткани. М.: Медицина. 1977.
29. Melli G, Hoke A. Dorsal root ganglia sensory neuronal cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 2009; 4(10): 1035-1045.
30. Carr VM, Simpson SBJr. Proliferative and degenerative events in the early development of chick dorsal root ganglia. I. Normal development. J Comp Neurol. 1978; 182(4): 727-739.
31. Ernsberger U. Role of neurotrophin signalling in the differentiation of neurons from dorsal root ganglia and sympathetic ganglia. Cell Tissue Res. 2009; 336(3): 349-384.
32. Borovikova L, Borovikov D, Ermishkin V, Revenko S. The resistance of cutaneous feline C-fiber mechano-heat-sensitive unit termination to tetrodotoxin and its possible relation to tetrodotoxin-resistant sodium channels. Primary Sensory Neuron 1997; 2(1): 65-75.
Работа поддержана Программой Президиума РАН П.30П
(№ 0134-2015-0003).
