CC BY
62
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 25 2011
IZVESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 25 2011
УДК 582.84+577.1
ВОЗМОЖНОСТИ СТИМУЛЯЦИИ СИНТЕЗА ЭРГОСТЕРИНА МИЦЕЛИЕМ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЫ
© Ю. С. ЛЫКОВ*, Г. В. ИЛЬИНА*, Д. Ю. ИЛЬИН**
Региональный центр государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области Пензенская государственная сельскохозяйственная академия,
*кафедра биологии и разведения животных,
**кафедра биологии и экологии e-mail: [email protected], [email protected]
Лыков Ю. С., Ильина Г. В., Ильин Д. Ю. - Возможности стимуляции синтеза эргостерина мицелием кси-лотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры // Известия ПГПУ им. В. Г. Белинского. 2011. № 25. С. 290-294. - Изучены особенности глубинного роста видов ксилотрофных базидиомицетов в присутствии экстрактов модельного лигнина. Обнаружено стимулирующее развитие мицелия влияние со стороны метоксиль-ных групп лигнина. Установлено, что добавление в питательную среду источников метоксильных групп интенсифицирует синтез эргостерина у грибов белой гнили.
Ключевые слова: ксилотрофные базидиомицеты, эргостерин, метоксильные группы лигнина.
Lykov Yu. S., Il'ina G. V., Il’in D. Yu. - Possibility of stimulation of ergosterol synthesis by mycelium of xylotrophic basidiomycetes in conditions of submerged culture // Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V.G. Belinskogo. 2011. № 25. Р. 290-294. - The submerged growth features of xylotrophic basidiomycetes with cultivation on model lignin extract are studied. The influence of lignin methoxyl groups on the development of mycelium is established. Methoxyl groups addition to nutrient medium intensifies the ergosterol synthesis by white-rot fungi.
Keywords: xylotrophic basidiomycetes, ergosterol, lignin methoxyl groups.
Одним из показателей метаболизма гриба в условиях чистой культуры может служить интенсивность синтеза эргостерина - основного грибного стерина, играющего ключевую роль в формировании структуры мембран, а также представляющего собой исходное вещество для синтеза различных продуктов, многие из которых рассматриваются как вторичные метаболиты [10]. Имеется множество сведений о син-тезебазидиальнымимакромицетамибиологическиак-тивных веществ липидной природы. Примерами могут служить синтез каротиноидов и, собственно, эргосте-рина мицелием трутовика серно-желтого ^. sulphu-тж); тритерпенов, обладающих антиаллергическим и гипохолестеринемическим действием (ганодеровые кислоты) - грибами рода Ganoderma [1, 10]. Для самих грибов подобные вещества могут играть роль регуляторов процессов жизнедеятельности, в том числе переходаквторичномуметаболизмуиплодоношению. Есть сведения, что не менее важным регуляторным экзогенным регуляторным фактором для ксилотрофных базидиомицетов может выступать компонент их природного субстрата - лигнин. Показано, что он способен влиять на морфогенез культуры в естественных
условиях [9]. Довольно сложно создать условия, приближенные к природным, в условиях культуры. Эту проблему можно частично решить, оптимизировав субстрат внесением лигноцеллюлозных компонентов. Основной и наиболее доступный субстрат, используемый при культивировании ксилотрофных бази-диомицетов, представляют собой опилки различных древесныхпород. Однакоизвестно, чтоиспользование таких материалов не всегда обеспечивает нормальное развитие культуры и ее высокую продуктивность. В связи с этим актуальным представляется поиск специфической подготовки субстрата для культивирования, с тем, чтобы оптимизировать развитие культур для более полной реализации их природного потенциала.
По мнению ряда авторов, на начальных стадиях разрушения древесины происходит потеря меток-сильных групп и некоторых эфирных связей лигнина. Опыты с меченым лигнином показали, что при разложении лигнина грибами белой гнили конечный продукт метаболизма СО2 образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и ароматических ко-
лец [7]. В ходе предварительных исследований нами было установлено стимулирующее развитие культур ксилотрофных базидиомицетов влияние лигноцеллю-лозных источников, характеризующихся различной химической структурой в условиях поверхностного культивирования [5]. Результаты этих исследований показали, что оптимальным является использование источников целлюлозы и лигнина, предварительно экстрагированных и подвергнутых метанолизу, что позволило повысить содержание метоксильных групп в материале. В результате этой процедуры снижается степень конденсации молекулы лигнина, материал опилок обогащается всевозможными мономерными, димерными и олигомерными производными фенолов, которые могут образоваться посредством разрыва эфирных связей в молекуле лигнина [4]. В связи с этим определенный интерес представляет изучение влияния метанолизного лигнина, как регуляторного фактора, на процесс синтеза эргостерина мицелием.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектами исследования послужили виды дереворазрушающих грибов, распространенные на территории Пензенской области: Inonotus obliquus ( Pers.: Fr.) Pilát (трутовик скошенный), Phellinus tremulae (Bon-dartsev) Bondartsev & P.N. Borisov (ложнотрутовик осиновый), Fomitopsispinicola (Sw.) P. Karst. (трутовик окаймленный), Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill (трутовик серно-желтый), Ganoderma applana-tum (Pers.) Pat. (трутовик плоский), Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. (трутовик лакированный), Fomes fomentarius (L.) J.J. Kickx (трутовик настоящий), Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. (корневая губка), Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst. (трутовик киноварно-красный), Fistulina hepatica ( Schaeff.) Sibth (трутовик печёночный). Для исследований было отобрано по три штамма каждого из указанных видов. Повторность опытов трёхкратная. Виды культивировались в глубинных условиях в колбах Эрленмейера на эксцентриковой качалке при скорости вращения 225 об./мин, с эксцентриситетом 2.5 см, при температуре +24-26°С.
Метанолиз лигноцеллюлозного субстрата осуществляли путём обработки предварительно экстра-тированных нативных опилок 0.3% раствором HCl в метаноле при нормальных условиях в течение 4 суток. После этого опилки промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции среды и высушивали до постоянной массы [3, 4].
Выращивание мицелия в глубинных условиях традиционно рассматривается как наиболее приемлемый способ оценки характера развития культуры, в частности, степени накопления биомассы, под влиянием каких-либо факторов. Если в качестве таких факторов выступают добавки к питательной среде, одним из основных требований к ним служит их растворимость, поскольку в противном случае отделить глубинный мицелий (для определения его массы) от частиц, содержащихся в культуральной жидкости, будет практически невозможно. В наших экспериментах интерес
представляло исследование влияния метоксильных групп лигнина на процесс синтеза эргостерина культурами. Для этого нужно было получить навески глубинной мицелиальной биомассы. Поскольку опилки, как нерастворимый материал, при добавлении в жидкую питательную среду будут помехой для отделения биомассы мицелия, внесение их в обычном состоянии не-целесообразнодляпроведенияданногоэксперимента. Решением проблемы может служить предварительная перкаляциялигноцеллюлозныхсубстратов.Политера-турным сведениям, в процессе перкаляции до 40% ма-териаладревесиныпереходитвраствор [3]. Используя таким образом подготовленный субстрат, будет сложно судить о влиянии на развитие мицелия углеводной части материала опилок. Влияние же олигомерных и мономерных углеводных компонентов учесть сложно, но и исключить нельзя, поскольку их спектр (как качественный, так и количественный) чрезвычайно широк. В этой связи логичным представляется полное удаление углеводной составляющей из метанолизного лиг-ноцеллюлозного субстрата, то есть получение модельного лигнина на основе метанолизных опилок (лигнина Классона). Лигнин Классона был выделен методом сернокислотного гидролиза в модификации Комарова [6]. Перкаляцию лигнина проводили с целью его перевода в водный раствор. Навеску лигнина помещали в 500 мл колбу и заливали дистиллированной водой, и кипятили смесь в условиях обратного холодильника в течение 48 часов [3]. Далее смесь фильтровали и анализировали фильтрат на предмет содержания метоксильных групп методом Цейзеля в модификации с применением газо-жидкостной хроматографии [4]. Установлена концентрация метоксильных групп на уровне 7.4 мМ/г, что превышает таковую в перколятах нативного лигнина, не подвергавшегося метанолизу, в 2.1 раза.
В наших экспериментах в качестве контрольной питательной среды была использована модифицированная среда Чапека, содержащая 30 г/л глюкозы (взамен сахарозы) и 3 г/л целлобиозы. Экспериментальная глубинная среда была приготовлена на основе экстракта (перколята) лигнина Классона, к которому было добавлено 30 г/л глюкозы и 3 г/л целлобиозы.
Глубинную биомассу мицелия определяли, отфильтровывая её через предварительно взвешенные фильтры с последующим высушиванием до постоянной массы.
Определение содержания эргостерина в мице-лиипроводилигазохроматографическимметодомсде-риватизацией в триметилсилильные производные [2]. В качестве стандарта использовали стандарт эргосте-ринафирмы«Мегск».Вработе использовалихромато -граф «Кристалл-2000 М» с пламенно-ионизационным детектором, оснащённый набивной колонкой с насадкой - 5% SE-30 на инертоне.
При статистической обработке результатов использовали профессиональную компьютерную программу «Statistica 6.0». Для оценки достоверности влияния изучаемых компонентов питательных сред на определяемые параметры проводилсядисперсионный
анализ полученного массива данных (ANOVA). При определении значимости полученных результатов использовался ^критерий Стьюдента при уровне значимости 0.95 [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для организации настоящего исследования необходимо было получить достаточное количество образцов биомассы мицелия, выращенного в опытных и контрольных условиях.
В ходе эксперимента была установлена неоднозначная реакция культур на присутствие в среде продуктов перкаляции лигнина. При этом для большин-
ства культур изученных видов установлено стимулирующее влияние метоксильных групп на процесс накопления биомассы мицелия. Анализ данных таблицы (табл. 1) свидетельствует о позитивном влиянии пер-калята лигнина, полученного из метанолизных опилок, на развитие большинства изученных видов кси-лотрофных базидиомицетов: F. pinicola, G. applanatum, G. lucidum, F. fomentarius, F. hepatica, P. cinnabarinus. Анализируя полученные данные, следует отметить, что названные виды относятся к группам грибов как белой (G. applanatum, G. lucidum, P. ánnabarinus), так и бурой (F.pinicola, L. sulphureus, F. hepatica) и смешанной (F. fomentarius) гнили.
Таблица1
Накопление биомассы мицелия культурами ксилотрофных базидиомицетов на различных средах (26°С, 7 сут. развития, повторность трехкратная, воздушно-сухой мицелий, г), в пересчете на 1 л питательной среды
Вид Штамм Варианты
Среда Чапека модифицированная (контроль) Среда с перкалятом из метанолизного лигнина (опыт)
I. obliquus IO-1 2.18±0.04 2.72±0.02*
IO-2 2.98±0.18 3.02±0.10
IO-3 2.20±0.07 2.46±0.02
Ph. tremulae Pht-1 !.9!±0.!3 1.34±0.07
Pht-2 1.75±0.01 !.!9±0.0!
Pht-3 !.48±0.!! !.!0±0.!!
F. pinicola Fpi-1 5.69±0.08 8.5±0.15
Fpi-2 4.82±0.22 6.2±0.20
Fpi-3 3.47±0.11 3.90±0.12
L. sulphureus РD-99 5.78±0.08 6.83±0.23
РD-01 4.34±0.35 5.69±0.11
Ah-02 4.57±0.09 6.72±0.30
G. applanatum G-1 3.10±0.15 5.28±0.13
G-2 3.18±0.10 4.75±0.24
G-3 3.77±0.22 5.13±0.12
G. lucidum Gl-1 2.59±0.19 3.75±0.21
Gl-3 3.64±0.27 5.30±0.14
Gl-6 3.04±0.24 6.22±0.25
F. fomentarius АН-96 2.28±0.02 4.67±0.28
Nic-02 3.08±0.08 4.!0±0.!!
Lp-05 3.33±0.06 5.61±0.32
P. cinnabarinus PyC-1 3.29±0.09 3.62±0.17
PyC-2 3.77±0.09 4.60±0.01
PyC-4 3.65±0.05 4.96±0.04
H. annosum Han-1 2.09±0.07 2.01±0.19
Han-2 2.89±0.11 1.65±0.02
Han-3 2.63±0.02 2.66±0.09
F. hepatica Fh-1 2.89±0.01 4.61±0.20
Fh-!а 2.58±0.13 5.01±0.42
Fh-5 2.09±0.04 4.64±0.18
* достоверные (р < 0,05) отличия показаны жирным шрифтом
Такие результаты свидетельствуют, что меток-сильные группы ассимилируются мицелием в качестве дополнительного трофического компонента субстрата. Активный рост мицелия предполагает также активизацию образования мембранных структур, в состав которых входит эргостерин. В полученных на-вескахбиомассыопределялисодержаниеэргостерина. Для этого у каждого из изученных видов были отобраны навески биомассы самых продуктивных и наиболее позитивно реагирующих на обогащение среды меток-сильными группами штаммов.
Результаты исследований показали, что содержание эргостерина выше в образцах мицелия, выращенного на средах с добавлением перколята метанолизного лигнина, причем это достоверно отмечено для видов - представителей белой гнили: I. obliquus, Ph. tremulae, G. applanatum, G. lucidum, P. cinnabari-nus (табл. 2), F. fomentarius - гриба смешанной гнили и, как исключение - для представителя бурой гнили L. sulphureus.
Биомасса G. lucidum (штамм Gl-3) увеличилась в опыте по сравнению с контролем в 1.45 раза, а содержание эргостерина - в 1.31 раза. Интересный результат получен при оценке влияния метоксильных групп перкалята лигнина на изменение содержания эргосте-рина у P. cinnabarinus (штамм PyC-1): на фоне отсутствия достоверного влияния на накопление биомассы показатели содержания эргостерина увеличились в 1.38 раза.
Отсутствие прямой связи между процессами накопления биомассы мицелия и интенсивностью синтеза эргостерина в опыте и в контроле свидетельствует о том, что помимо затрат этого вещества на пластический обмен, культуры накапливают материал для синтеза на его основе веществ и образования структур
Стимуляция процессов образования эргостери-на у некоторых видов грибов - возбудителей белой гнили древесины не обнаруживает заметной связи с процессами стимуляции накопления биомассы мицелия. Например, средняя биомасса глубинного мицелия гриба I. obliquus (штамм IO-2), зафиксированная в опыте, почти не превосходила среднюю биомассу, накапливаемую культурой в контроле, а содержание эргостерина в опыте увеличилось в 1.71 раза (табл. 2). Средние показатели биомассы глубинного мицелия Ph. tremulae (штамм Pht-1) в опыте были ниже контрольных значений в 1.40 раза, а содержание эргосте-рина - выше в 1.67 раза. Пропорционально увеличилось накопление биомассы и содержание эргостерина в опытных вариантах по сравнению с контролем у следующих видов: L. sulphureus (штамм РD-99), соответственно в 1.22 раза и в 1.30 раза; у G. applanatum (штамм G-2) - в 1.47 раза и у F. fomentarius (штамм Nic-02) - в 1.33 и 1.32 раза соответственно увеличились оба показателя.
на последующих стадиях развития. Возможно, это резерв для синтеза вторичных метаболитов, связанных с протеканием репродуктивных процессов.В этойсвязи установленные закономерности предполагают исследование влияния изученных компонентов лигнина на процессы образования репродуктивных структур.
список литературы
1. гвоздикова Т.С., Мишин л.Т., Черноок Т.В., Плени-на л.В., Капич А.Н. глубинный мицелий ксантофиллосодержащего гриба Laetiporus sulphureus - основа биологически активной добавки // Успехи медицинской микологии. 2004. Т. 3. С. 218-220.
2. гёрёг Ш. Количественный анализ стероидов (пер. с англ.). М.: Мир, 1985. 504 с.
Таблица 2
Показатели содержания эргостерина в воздушно-сухом мицелии штаммов исследованных видов ксилотрофных базидиомицетов (26°С, 7 сут. развития, повторность трехкратная)
Вид, штамм Среда Чапека модифицированная (контроль) Среда с перкалятом из метанолизного лигнина (опыт)
Масса навески, (мг) Эргостерин,% Масса навески, (мг) Эргостерин,%
I. obliquus, IO-2 2983.7±182.1 0.74±0.04* 3023.0±104.3 1.31±0.02
Ph. tremulae, Pht-1 1911.2±131.0 0.41±0.01 1339.7±71.3 0.69±0.02
F. pinicola, Fpi-1 5694.0±82.4 0.38±0.03 8506.1±153.8 0.39±0.01
L. sulphureus, РD-99 5782.1±80.7 0.37±0.01 6832.3±232.1 0.49±0.01
G. applanatum, G-2 3179.3±102.2 0.70±0.09 4751.1±244.4 1.03±0.09
G. lucidum, Gl-3 3638.2±274.2 0.87±0.01 5303.2±139.1 1.49±0.02
F. fomentarius, Nic-02 3081.7±83.7 1.06±0.04 4107.2±112.6 1.42±0.05
P. cinnabarinus, PyC-1 3292.2±90.3 1.08±0.03 3619.5±172.9 1.50±0.03
H. annosum, Han-2 2894.3±10.2 0.61±0.01 1652.3±23.9 0.76±0.04
F. hepatica, Fh-5 2093.3±389.6 1.60±0.04 4643.4±184.8 1.56±0.06
* достоверные (р < 0.05) отличия показаны жирным шрифтом
3. ГрушниковО.П.,Елкин. В.В.Достижения ипроблемы химии лигнина. М.: Наука, 1973. 296 с.
4. Закис Г.Ф. Функциональный анализ лигнинов и их производных. Рига: Зинатне, 1987. 230 с.
5. Ильина Г.В., ИльинД.Ю.,Лыков Ю.С.Рольспецифи-ки лигнинсодержащих субстратов при культивировании ксилотрофных грибов in vitro // Микология и фитопатология. 2009. Т. 43. № 2. С. 35-40.
6. Оболенская A.B., Ельницкая З.П., Леонович A.A. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы: учебное пособие для вузов. М.: Экология, 1991. 320 с.
7. Решетникова И.А. Деструкция лигнина ксилотрофны-ми макр омицетами. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами. М., 1997. 197 с.
8. Халафян А.А. Statistica6. Статистический анализдан-ных. 3-е изд. М.: ООО «Бином-Пресс», 2007. 512 с.
9. Фенгел Д. Древесина (химия, ультраструктура, реакции): Пер. с англ. / Под ред. А.А. Леоновича. М.: Лесная промышленность, 1988. 512 с.
10. Smith J.E., Rowan N.J., Sullivan R. Medicinal mushrooms: their therapeutic properties and current medical usage with special emphasis on cancer treatments. Glasgow: University of Strathclyde, 2002. 256 p.
