CC BY
19
DOI: 10.31146/1682-8658-ecg-182-10-46-55 УДК 616.34, 612.397.2
Возможности использования жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови для диагностики болезни Крона
Кручинина М. В.1- 2, Азгалдян А. В.1, Светлова И. О.2, Осипенко М. Ф.2, Шашков М. В.3, Соколова А. С.4, Кручинин В. Н.5
1 Научно-исследовательский институт терапии и профилактической медицины — филиал ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, 630089, г. Новосибирск, ул. Бориса Богаткова, 175/1
2 ФГБОУ ВО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России, Новосибирск, Российская Федерация, 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52
3 ФГБУН Институт катализа им. Г К. Борескова СО РАН, 630090, г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5
4 ФГБУН Новосибирский институт органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН, 630090, г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 9
5 ФГБУН Институт физики полупроводников им. А. В. Ржанова СО РАН, 630090, г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 13
Opportunities for the use of fatty acids of erythrocytes membranes and blood serum for diagnosis of Crown's disease
M. V. Kruchinina1' 2, A. V. Azgaldyan1, I. O. Svetlova2, M. F. Osipenko2, M. V. Shashkov3, A. S. Sokolova4, V. N. Kruchinin5
1 Research Institute of Internal and Preventive Medicine —Branch of the Institute of Cytology and Genetics, SB RAS, 630089, Novosibirsk, st. Boris Bogatkov, 175/1
2 Federal State Budget Educational Institution of Higher Education "Novosibirsk State Medical University" Ministry of Health of the Russian Federation, 630091, Novosibirsk, Krasnyj prospect, 52
3 Boreskov Institute of Catalysis SB RAS, 630090, Novosibirsk, Lavrentiev Ave. 5
4 Novosibirsk Institute of Organic Chemistry SB RAS, 630090, Novosibirsk, Lavrentiev Ave. 9
5 Rzhanov Institute of Semiconductor Physics SB RAS, 630090, Novosibirsk, Lavrentiev Ave. 13
Для цитирования: Кручинина М. В., Азгалдян А. В., Светлова И. О., Осипенко М. Ф., Шашков М. В., Соколова А. С., Кручинин В. Н. Возможности использования жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови для диагностики болезни Крона. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2020;182(10): 46-55. DOI: 10.31146/1682-8658-ecg-182-10-46-55
For citation: Kruchinina M. V., Azgaldyan A. V., Svetlova I. O., Osipenko M. F., Shashkov M. V., Sokolova A. S., Kruchinin V. N. Opportunities for the use of fatty acids of erythrocytes membranes and blood serum for diagnosis of Crown's disease. Experimental and Clinical Gastroenterology. 2020;182(10): 46-55. (In Russ.) DOI: 10.31146/1682-8658-ecg-182-10-46-55
Кручинина Маргарита Витальевна, Лаборатория гастроэнтерологии, ведущий научный сотрудник, д.м.н.; доцент кафедры пропедевтики внутренних болезней
Азгалдян Александра Викторовна, аспирант лаборатория гастроэнтерологии
Светлова Ирина Олеговна, доцент кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии (факультета повышения квалификации и переподготовки врачей), к.м.н.
Осипенко Марина Федоровна, заведующая кафедрой пропедевтики внутренних болезней, д.м.н., профессор Шашков Михаил Вадимович, Аналитическая лаборатория, научный сотрудник, кандидат химических наук Соколова Анастасия Сергеевна, Лаборатория физиологически активных веществ, научный сотрудник, кандидат химических наук
Кручинин Владимир Николаевич, научный сотрудник, кандидат химических наук
Margarita V. Krucinina, Laboratory of Gastroenterology, Leading researcher, MD; Department of Propaedeutics of Internal Medicine, Associate Professor
Alexandra V. Azgaldyan, Laboratory of Gastroenterology, Post Graduate Student
Irina O. Svetlova, Department of Therapy, Hematology and Transfusiology (Faculty of Continuing Education and Retraining of Doctors), PhD
Marina F. Osipenko, Head of the Department of Propaedeutics of Internal Medicine, MD, Professor Mikhail V. Shashkov, Researcher, PhD Anastasia S. Sokolova, Researcher, PhD Vladimir N. Kruchinin, Researcher, PhD
И Corresponding author: Кручинина
Маргарита Витальевна Margarita V. Krucinina
Резюме
Цель работы. Исследовать особенности жирнокислотного (ЖК) состава мембран эритроцитов (Эр) и сыворотки крови (СК) у пациентов с болезнью Крона (БК) для возможного использования в целях дифференциальной диагностики.
Материалы и методы. С помощью хромато-масс-спектрометрической системы (ГХ/МС) на основе трех квадрупо-лей Agilent 7000B (США) исследован состав ЖК эритроцитов (Эр) и сыворотки крови (СК) 60-ти человек: 19 — с болезнью Крона (БК, 34±6,2 года), 21 — с неклассифицируемыми колитами (НКК, 35,2±4,7 года) и 20 здоровых лиц (32,9±5,7 года).
Результаты. Установлено, что уровни большей части насыщенных, мононенасыщенных омега-9, омега-6 ПНЖК оказались достоверно выше, а содержание преобладающей части омега-3, ряда омега-6 (линолевой, эйкозадиеновой, арахидоновой) — ниже, чем у здоровых лиц. Относительное содержание ЖК у больных с НКК оказалось промежуточным между таковыми у больных с БК и здоровыми (р<0,0001-0,02).
Полученные дифференцирующие значения уровней ЖК и их индексов в мембранах эритроцитов позволили выявить пациентов с предполагаемой болезнью Крона из тех, у кого диагностирован неклассифицируемый колит, что свидетельствует о высоком потенциале данного подхода для целей дифференциальной диагностики.
Заключение. Созданные диагностические панели (ЖК сыворотки крови и мембран эритроцитов) позволили дифференцировать пациентов с БК от здоровых лиц с достаточно высокими уровнями чувствительности и специфичности. Выявленные особенности уровней ЖК мембран Эр и СК, а также их соотношения у пациентов с БК перспективны для целей дифференциальной диагностики, в том числе, в случаях НКК.
Ключевые слова: болезнь Крона, неклассифицируемые колиты, дифференциальная диагностика, хрома-то-масс-спектрометрия, жирные кислоты, эритроциты, сыворотка крови
Summary
Aim of work is to study the features of the fatty acid (FA) composition of the membranes of erythrocytes (Er) and blood serum (BS) in patients with Crohn's disease (CD) for possible use for differential diagnosis.
Materials and methods. Using a gas chromatography-mass spectrometric system (GC/MS) based on three Agilent 7000B quadrupoles (USA), the composition of erythrocytes (Er) and blood serum (SC) of 60 people was studied: 19 — with Crohn's disease (CD, 34±6,2 years), 21 — with unclassified colitis (UCC, 35,2±4,7 years) and 20 healthy individuals (32,9±5,7 years).
Results. It was found that the levels of most saturated, monounsaturated omega-9, omega-6 PUFAs were significantly higher, and the content of the predominant part of omega-3, a number of omega-6 (linoleic, eicosadienoic, arachidonic) was lower than in healthy individuals. The relative content of FA in patients with unclassified colitis turned out to be intermediate between those in patients with CD and healthy (p <0,0001-0,02).
The obtained differentiating values of FA levels and their indices in the erythrocyte membranes made it possible to identify patients with suspected Crohn's disease from those who were diagnosed with unclassified colitis, which indicates the high potential of this approach for differential diagnosis.
Conclusion. The created diagnostic panels (FA of blood serum and erythrocyte membranes) made it possible to differentiate patients with CD from healthy individuals with fairly high levels of sensitivity and specificity. The revealed features of the levels of FA membranes of Er and BS, as well as their ratio in patients with CD, are promising for the purposes of differential diagnosis, including in cases of unclassified colitis.
Keywords: Crohn's disease, unclassified colitis, differential diagnosis, chromatography-mass spectrometry, fatty acids, red blood cells, blood serum
Введение
Болезнь Крона является хроническим и прогрессирующим воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК) с пиком заболеваемости в возрасте 15-30 лет [1, 2]. БК может поражать любую часть кишечной трубки от полости рта до перианальной области. При поражении тонкой кишки пациенты с БК могут иметь серьезные нутритивные осложнения. Этиология воспалительных заболеваний
кишечника не установлена. Однако, очевидно, что основу патогенеза этих нозологических форм составляет сочетание генетически детерминированных и приобретенных дефектов регуляторных механизмов, которые ограничивают патологическую активацию иммунной системы человека в ответ на потенциально патогенные и/или физиологические стимулы. Ранее предполагалось, что вклад мутаций
генов (регуляция процессов распознавания бактерий, аутофагия, дифференцировка лимфоцитов ^17) для развития БК составляет менее 25% [3], подразумевая, что другие факторы, такие как переменные среды и диетические антигены, играют важную роль в обострении БК [4-6]. В проведенных ранее исследованиях было показано, что жир-нокислотный профиль мембран эритроцитов у пациентов с БК значительно отличается от такового у здоровых лиц и пациентов с язвенным колитом значительно меньшим процентным содержанием линолевой кислоты при БК [7]. Следовательно, ферменты, участвующие в метаболизме линолевой кислоты, например, дельта-6-десатуразы, считаются гиперактивированными у пациентов с БК. Выявлены более низкие уровни дигомо-у-лино-леновой кислоты (С20:3 п-6), соотношение суммы эйкозапентаеновой и докозапентаеновой жирных кислот к арахидоновой кислоте и более высокое содержание маргариновой (С17:0) и олеиновой (С18:1; с9) в мембранах эритроцитов пациентов с болезнью Крона в сравнении с больными с язвен-
ным колитом [8]. Существенные сдвиги в уровнях полиненасыщенных жирных кислот, в том числе, омега-3 и омега-6, связаны с их участием в перечне ключевых биологических процессов, включая физиологические процессы в клеточной мембране, эйкозаноидное продуцирование, воспаление, регуляцию и экспрессию генов [9]. Наличие существенных сдвигов в уровнях жирных кислот предполагает возможное их использование как биологических маркеров для диагностики БК. Тем более, что в 25% случаев клиницистам приходится прибегать к диагнозу «неклассифицируемый колит», который предполагает дальнейшую верификацию. С другой стороны, измененный жир-нокислотный профиль - это возможный таргет для терапевтических воздействий, модификаций с помощью диеты.
Цель настоящего исследования - исследовать особенности жирнокислотного состава мембран эритроцитов и сыворотки крови у пациентов с болезнью Крона для возможного использования в целях дифференциальной диагностики.
Материалы и методы
В период с 2016 по 2019 гг. обследовано 19 пациентов - с БК (34,5±6,2 года), 21 - с неклассифицируе-мыми колитами (НКК) (35,2±4,7 года) и 20 здоровых лиц (32,9±5,7 года).
Клинико-инструментальная характеристика обследованных групп представлена в таблице 1. Группы пациентов с ВЗК были сопоставимы по возрасту, полу, индексу массы тела, числу курильщиков. Длительность заболевания у преобладающей части пациентов обеих групп оказалась более трех лет (в 73,7% случаев - у пациентов с БК и в 71,4% - у больных с НКК). У более половины пациентов в обеих группах с ВЗК отмечена средняя степень тяжести заболевания, оставшиеся больные имели легкое течение заболевания. У большей части пациентов обеих групп эндоскопическая активность соответствовала умеренной (в 63,2% случаев в группе с БК и в 61,9% - в группе с НКК). У преобладающей части пациентов с БК (68,4%) выявлены поражение подвздошной и толстой кишки, колит определен в 31,6% случаев. В группе с НКК, кроме илеоколита (38,1%) и колита (14,3%), отмечены пациенты с левосторонним колитом (28,6%) и проктитом/проктосигмоидитом (19%). На момент обследования у всех пациентов диагностирована клиническая ремиссия (индекс активности Беста -менее 150 баллов).
Группы пациентов оказались сопоставимы по уровню маркеров воспаления (достоверно отличаясь от группы сравнения по уровням фекального кальпротектина и С-реактивного белка, р<0,001) и проводимой терапии. Достоверных различий по уровню гемоглобина, количеству лейкоцитов не выявлено. В качестве группы сравнения были отобраны пациенты, сопоставимые с основными группами по возрасту и полу без манифестирующей патологии внутренних органов. Пациенты группы сравнения исключались из исследования, если они получали какие-либо добавки омега-3
полиненасыщенных жирных кислот или стати-ны, имели гиперлипидемию, которая могла потребовать лекарственной коррекции, какие-либо значительные отклонения по данным исследования общего анализа крови или биохимии или имели холестериновые камни в желчном пузыре, поскольку вышеописанные факторы оказывают существенное влияние на профиль жирных кислот сыворотки крови и мембран эритроцитов [10].
Исследование состава жирных кислот Эр и СК проведено с помощью ГХ/МС системы на основе трех квадруполей Agilent 7000B (США). Концентрации жирных кислот выражали в относительных процентах. Предел обнаружения жирной кислоты ~1 мкг на образец. Подробное описание пробоподготовки и процесса исследования состава жирных кислот приведено в работе [11]. Десатуразная активность определялась как соотношение уровней: [дигомо-у-линоленовая ЖК + арахидоновая ЖК] / [линолевая ЖК] или [C20:3n-6 + C20:4n-6 / C18:2n-6] как показатель, который отражает активность дельта-6-десатуразы; т.е. индекс дельта-десатурации. Оценивали соотношение пальмитиновой кислоты к линолевой [C16:0 / C18:2n-6], отражающее активность элонгазы.
Для статистического анализа использовано программное обеспечение SPSS, ver. 22. Для сравнения между двумя независимыми группами применялись тесты Mann-Whitney U и/или хи-квадрат. Для сравнения параметров между тремя независимыми группами использован метод ANOVA с последующим тестом Tukey HSD. Ранговые коэффициенты корреляции Спирмена использовались для оценки корреляций между дискретными переменными. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости нулевой гипотезы (p) принимался равным 0,05. Оценка диагностической точности панелей показателей произведена с помощью ROC-анализа.
Исследуемые группы
Параметры
Группа сравнения (n=20)
Группа пациентов с болезнью Крона (n=19)
Группа пациентов с неклассифицируемыми колитами (НКК) (n=21)
Возраст, (лет) 32,9±5,7 34,5±6,2 35,2±4,7
Пол, чел. (мужчины / женщины) 10/10 10/9 10/11
Курение, (чел.,%) 2 (10%) 3 (15,7%) 3 (14,3%)
Индекс массы тела (кг/м2) 21,9±2,4 20,9±3,1 20,1±3,9
Длительность заболевания, (годы) > 3 1-3 - 14 (73,7%) 5 (26,3%) 15 (71,4%) 6 (28,6%)
Степень тяжести легкая средняя - 9 (47,4%) 10 (52,6%) 9 (42,9%) 10 (57,1%)
Эндоскопическая активность минимальная умеренная - 7 (36,8%) 12 (63,2%) 8 (38,1%) 13 (61,9%)
Локализация проктит и проктосигмоидит левосторонний колит илеоколит колит - 13 (68,4%) 6 (31,6%) 4 (19,0%) 6 (28,6%) 8 (38,1%) 3 (14,3%)
Уровень гемоглобина, (г/л) 136,2±2,8 133,1±2,7 129,1±3,1
Количество лейкоцитов, (х109/л) 5,8±1,3 6,1±1,8 6,9±2,2
Фекальный кальпротектин (мг/г) 32,1±3,8 176,4±9,5** 183,5±11,9**
С-реактивный белок (мг/л) 1,1±0,9 5,1±3,1** 4,8±2,7**
Индекс активности БК (баллы) - 127,8±91,3 135,5±88,9
Терапия аминосалицилаты иммуномодуляторы - 17 (89,5%) 8 (42,1%) 16 (76,2%) 5 (23,8%)
Таблица 1.
Клинико-инструментальная характеристика обследованных групп.
Примечания:
* - достоверность (р) отличия от группы сравнения;
* - р<0,05, ** - р<0,001
Исследование выполнено с одобрения Комитета Биомедицинской Этики Научно-исследовательского института терапии и профилактической медицины - филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения
«Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук» (17.12.2018, протокол № 120). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Результаты
Анализ уровней жирных кислот в сыворотке крови пациентов с ВЗК позволил выявить разнонаправленные тенденции насыщенных и ненасыщенных ЖК у пациентов с болезнью Крона и неклассифицируемыми колитами в сравнении со здоровыми лицами, а также между группами больных с ВЗК (рисунок 1).
У пациентов с болезнью Крона уровни сывороточных пальмитиновой (С16:0), пальмитолевой (С16:1п-9), олеиновой (С18:1п-9), у-линоленовой (С18:3 п-6), дигомо-у-линоленовой (С20:3 п-6) оказались достоверно выше, а стеариновой (С18:0), лигноцериновой (С24:0), гондоиновой (20:1п-9), эйкозапентаеновой (С20:5 п-3), (докозапентаеновой (С22:5 п-3), докозагексаеновой (С22:6 п-3), линоле-вой (С18:2 п-6), эйкодадиеновой (С20:2 п-6) - достоверно ниже, чем в группе сравнения (р<0,05-0,001).
У пациентов с неклассифицируемыми колитами уровни большей части ЖК сыворотки крови занимали промежуточное положение между
величинами у здоровых и пациентов с болезнью Крона, при этом уровни стеариновой (С18:0), (докозапентаеновой (С22:5 п-3), линолевой (С18:2 п-6) были достоверно выше, а пальмитолевой (С16:1п-9), эйкодадиеновой (С20:2 п-6), у-линоленовой (С18:3 п-6) - ниже, чем при болезни Крона (р<0,05-0,01).
Общий тренд уровней жирных кислот в мембранах эритроцитов совпадал с таковым в сыворотке крови, но относительное процентное содержание было выше (рисунок 2). При болезни Крона в фосфолипидах мембран эритроцитов выявлено достоверно большее содержание ряда насыщенных ЖК (пальмитиновой С16:0, стеариновой С18:0, лигноцериновой С24:0), мононенасыщенных омега-9 ЖК (пальмитолевой С16:1п-9, олеиновой С18:1п-9) и омега-6 ПНЖК (у-линоленовой С18:3 п-6, ди-гомо-у-линоленовой С20:3 п-6) (р<0,05-0,001).
Напротив, уровни гондоиновой (20:1п-9), оме-га-3 ПНЖК (эйкозапентаеновой С20:5 п-3, докозапентаеновой С22:5 п-3, докозагексаеновой С22:6
Рисунок 1.
Уровни ЖК сыворотки крови в обследованных группах (%).
n-3) омега-6 ПНЖК (линолевой C18:2 n-6, эйко-дадиеновой C20:2 n-6, арахидоновой С20:4 n-6) оказались достоверно ниже, чем у здоровых лиц (р=0,03-0,001).
Уровни жирных кислот пациентов с некласси-фицируемыми колитами, занимая промежуточное
место между уровнями у здоровых и лиц с болезнью Крона, достоверно отличались от контроля (р<0,05-0,01), но не от пациентов с болезнью Крона.
Активность ферментов метаболизма ЖК - дель-та-6 десатуразы и элонгазы оказалась достоверно выше у пациентов с БК, чем у здоровых и больных
Рисунок 2.
Уровни ЖК мембран эритроцитов в обследованных группах (%).
с НКК (р<0,05-0,001). Последние имели более высокую активность ферментов, чем в контроле для десатуразы сыворотки и элонгазы мембран эритроцитов (р<0,01) (рисунок 3).
Из всей совокупности жирных кислот наиболее выраженные различия между пациентами
с БК и здоровыми выявлены по уровню пальмитиновой кислоты, который оказался максимально повышен при болезни Крона, и линолевой, уровень которой, напротив, оказался значительно сниженным. Кроме того, значимыми в различении оказались и соотношения жирных кислот,
Рисунок 3.
Активность дельта-6 десату-разы и элонгазы в сыворотке крови (левая часть рисунка) и в мембранах эритроцитов (правая часть рисунка) у пациентов с ВЗК.
Таблица 2.
Дифференцирующие значения уровней ЖК и их индексов в мембранах эритроцитов
Группы обследованных
Жирные кислоты,% Группа сравнения Группа больных с болезнью Крона
Пальмитиновая ЖК (С16:0) 20,42-24,95 25,65-30,71
Линолевая ЖК (С18:2 п-6) 12,47-14,90 10,42-8,25
(С20:3 + С20:4) / С18:2 0,82-1,03 1,12-2,35
С16:0 / С18:2
1,10-2,18
2,45-3,70
отражающих активность ферментов метаболизма ЖК.
Определены дифференцирующие значения данных показателей для пациентов с БК (таблица 2), с которыми были сопоставлены уровни ЖК пациентов с НКК. У 8 больных с НКК уровни индексов находились в пределах таковых у пациентов с БК; у семи больных впоследствии была верифицирована болезнь Крона, что свидетельствует о высоком потенциале данного подхода для целей дифференциальной диагностики.
Уровень пальмитиновой кислоты и соотношения ЖК были использованы при проведении ROC-анализа для дифференцирования пациентов с БК от здоровых лиц (рисунок 4). Созданные диагностические панели (ЖК сыворотки крови и мембран эритроцитов) позволили дифференцировать пациентов с БК от здоровых лиц с достаточно
высокими уровнями чувствительности и специфичности (для мембран эритроцитов - панель 1 (С16:0) - АиС 0,791, чувствительность 0,80, специфичность 0,74; панель 2 (С20:3+С20:4)/С18:2)-АиС 0,813, чувствительность 0,82, специфичность 0,66; панель 3 (С16:0/ С18:2) - АиС 0,813, чувствительность 0,82, специфичность 0,88). Наилучшие диагностические показатели выявлены у соотношения С16:0/С18:2 в сыворотке крови и мембранах эритроцитов, которое показало чувствительность 80%, специфичность 80%, прогностическую ценность положительного результата 78%, отрицательного результата 79%, диагностическую точность 79% для сыворотки крови и чувствительность 82%, специфичность 88%, прогностическую ценность положительного результата 85%, отрицательного результата 83%, диагностическую точность 84% для мембран эритроцитов.
Обсуждение
В настоящем исследовании изучено процентное содержание каждой из жирных кислот по отношении к сумме всех ЖК, поскольку абсолютные уровни ЖК имеют значительный разброс значений.
В нашей работе преобладающая часть жирных кислот у пациентов с болезнью Крона и некласси-фицируемыми колитами показали однонаправленные тренды изменений в сыворотке крови и мембранах эритроцитов. Исключение составили насыщенные ЖК - стеариновая С18:0 и лигноце-риновая С24:0, уровни которых оказались ниже в сыворотке крови с накоплением в мембранах эритроцитов. Сниженные уровни арахидоновой ЖК (С20:4 п-6) были выявлены лишь в мембранах эритроцитов пациентов с болезнью Крона, что может быть связано с ее повышенным расходом в арахидоновом каскаде с образованием провос-
палительных цитокинов (простагландин Е2 (PGE2), лейкотриен В4 (ЦГВ4), тромбоксан А2 (ТХА2) [12, 13].
В исследовании Veglia Б. е! а1. [14] показана роль арахидоновой кислоты в механизме репрограм-мирования нейтрофилов белком 2, транспортирующим жирные кислоты (БАТР2). Появляющиеся в ходе данного процесса полиморфноядерные миелоидные супрессорные клетки (PMN-MDSC) являются патологически активированными ней-трофилами, которые имеют решающее значение для регуляции иммунных реакций, в том числе, вероятно, при болезни Крона.
На состав п-6 ПНЖК в плазме или жизненно важных клеточных мембранах может влиять потребление пищи, образ жизни и демографические характеристики [15, 16]. Предполагалось также, что гендерные и присущие поколению различия
Рисунок 4.
ЯОС-анализ для потенциальных биомаркеров: а) сыворотка крови, б) мембраны эритроцитов. Панель 1 -пальмитиновая ЖК (С16:0); панель 2 - (С20:3+С20:4)/ С18:2; панель 3 - С16:0/ С18:2.
влияют на предпочтения и привычки в еде [7], поэтому в нашей работе группа здоровых обследованных была сопоставима по возрасту и полу с пациентами с ВЗК.
Сниженные уровни линолевой кислоты в сыворотке крови и мембранах эритроцитов, по данным настоящего исследования, косвенно свидетельствуют о ее повышенном метаболизме у пациентов с БК, что подтверждается повышенной активность фермента дельта-6 десатуразы. Следует отметить, что у пациентов с НКК уровень линолевой кислоты оказался также достоверно ниже, чем в контроле (p<0,001). В работе Uchiyama K. et al. также показана активация дельта-6 десатуразы при болезни Крона по сравнению со здоровыми [7]. Таким образом, n-6 ПНЖК, то есть линолевая ЖК, может быть эффективно метаболизирована в арахидоновую ЖК у пациентов с БК. В свою очередь, арахидоновая кислота может метаболизироваться до биоактивных эйкозаноидов, таких как простагландины, лейкотриены, тромбоксаны и липоксины, которые участвуют в воспалении и агрегации тромбоцитов. Исследования Sharon P. et al., Hommes D. W. et al. показали, что производство лейкотриенов и про-стагландинов увеличивается в слизистой оболочке кишечника у пациентов с болезнью Крона [17, 18], а потребление большого количества n-6 ПНЖК связано с повышенным риском развития ВЗК [19].
Seimon et al. [20] сообщили, что насыщенные жирные кислоты могут способствовать макрофагально-му воспалению и липотоксичности. Повышенная токсичность насыщенных ЖК может быть в определенной степени обусловлена тем фактом, что они менее эффективно этерифицируются в триглицери-ды. Хотя механизмы, лежащие в основе липотоксичности, в настоящее время неизвестны, накопление пальмитиновой кислоты в макрофагах может быть связано с воспалением [21]. В настоящем исследовании процентное содержание пальмитиновой C16:0 и пальмитолеиновой C16:1 в сыворотке крови и мембранах эритроцитов были выше у пациентов с БК по сравнению со здоровыми, в то время как уровень стеариновой ЖК C18:0 в сыворотке крови был ниже, что указывает сниженную активность элонгазы-6 у пациентов с БК. Косвенно это отражает замедление превращения пальмитиновой ЖК C16:0 в сте-
ариновую ЖК C18:0 при болезни Крона. Высокое процентное содержание пальмитиновой ЖК может индуцировать макрофаги, которые продолжают выделять воспалительные цитокины в слизистой оболочке кишечника [21]. Действительно, дельта-6 десатураза также участвует в метаболизме пальмитиновой ЖК у людей. Хотя дельта-6-десатура-ция пальмитиновой ЖК приводит к биосинтезу сапиеновой кислоты, эта метаболическая реакция ограничивается очень специфическими жировыми тканями, такими как сальные. Поэтому, вероятно, что этот метаболический путь не повлиял на результаты настоящего исследования.
Повышенные уровни мононенасыщенных ЖК С16:1п-9 и олеиновой С18:1п-9 в сыворотке крови и мембранах эритроцитов могут оказывать эпигенетические воздействия. Так, показано, МНЖК (в том числе, наиболее распространенная олеиновая ЖК - C18:1 п-9), подавляют передачу сигналов PTEN / Akt и регулируют эпителиально-мезенхи-мальный переход [22].
По данным настоящей работы у пациентов с БК оказались сниженными уровни омега-3 ПНЖК -С20:5п-3, С22:5п-3, С22:6п-3 как в сыворотке крови, так и в мембранах эритроцитов у пациентов с БК по сравнению с контрольной группой. Омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты, такие как а-линоленовая кислота, метаболизируются в эй-козапентаеновую кислоту (С20:5п-3) и докозагек-саеновую кислоту (С22:6п-3) теми же десатуразами, которые участвуют в метаболизме омега-6 ПНЖК. Следовательно, п-3 ПНЖК могут ингибировать арахидоновый каскад конкурентно антагонизирую-щими ферментами (дельта 6- и дельта-5-десатуразы, циклооксигеназы и липоксигеназы), тем самым обеспечивая противовоспалительные эффекты, ингибируя синтез воспалительных медиаторов АА и ТХА2 [23-25]. Снижение процентного содержания омега-3 ПНЖК, в том числе, эйкозапентаеновой ЖК, которая оказывает противовоспалительное действие через TLR4 в макрофагах, может способствовать активации воспаления у пациентов с БК.
Li Q. et al. (2007) обнаружили, что докозагексаено-вая и эйкозапентаеновая кислота изменяли липид-ную среду в мембранных микродоменах плотного соединения клеток кишечника m vitro. Экспозиция
с омега-3 ПНЖК эффективно предотвращала перераспределение окклюдина, ZO-1 и искажение морфологии плотных контактов клеток, уменьшало трансэпителиальное электрическое сопротивление, индуцированное цитокинами 1БЫ[-у и ТЫБ-а. Таким образом, было показано, что омега-3 ПНЖК играют важную роль в индуцированных провоспалитель-ными цитокинами дефектах проницаемости и дисфункции эпителиального барьера путем модификации липидной среды в мембранных микродоменах плотного соединения [26].
В то же время, процентное содержание омега-6 ПНЖК - у-линоленовой С18:3 п-6 и дигомо-у-ли-ноленовой С20:3 п-6 - оказалось достоверно выше у пациентов с болезнью Крона по сравнению со здоровыми обследованными. С одной стороны, это свидетельствует об ускоренном метаболизме линолевой кислоты, что объясняет существенное снижение ее содержания в мембранах эритроцитов и сыворотке крови. С другой стороны, дигомо-у-линоленовая С20:3 п-6 кислота является субстратом для синтеза простагландинов и тромбоксанов (1 серия) и лейкотриенов (3 серия), которые поддерживают воспаление в кишке.
Изменения в соотношении арахидоновой, ди-гомо-у-линоленовой и линолевой жирных кислот сказались на уровне индекса дельта-6-десатурации, который отражает активность дельта-6-десатуразы. По данным нашей работы, она оказалась повышенной у пациентов с БК, что свидетельствует о том, линолевая ЖК быстрее метаболизируется в арахи-доновую у пациентов с болезнью Крона. Известно, что доля жирных кислот в жизненно важных клеточных мембранах поддерживается гомеостазом посредством активности десатураз, которые обычно контролируются посредством обратной связи [27]. Вероятно, у пациентов с БК нарушена регуляция обратной связи десатурации ПНЖК.
Наиболее выраженные различия в уровнях ЖК коснулись пальмитиновой, содержание которой оказалось повышенным в максимальной степени у пациентов с БК по сравнению со здоровыми лицами, а также линолевой, уровень которой был, напротив, значительно сниженным у пациентов с ВЗК. Подобные полярные различия в содержании данных ЖК, как и их соотношение С16:0/ С18:2 оказались значимыми для различения пациентов с болезнью Крона. Соотношение (С20:3+С20:4)/С18:2, отражающее активность дельта-6-десатуразы, подтверждало измененный метаболизм ЖК; оно также позволило с достаточной точностью дифференцировать пациентов с БК от здоровых. Именно вышеописанные параметры вошли в состав «пилотных» диагностических панелей для различения пациентов с БК от здоровых. Следует заметить, что С16:0/ С18:2 показало наилучшие результаты по сравнению с другими панелями (АиС для сыворотки крови 0,84, для мембран эритроцитов -0,894). Данные результаты сопоставимы по специфичности (80-88% против 8289%) и превосходят по чувствительности (80-82% против 32-72%) возможности диагностических панелей, состоящих из антител против Saccharomyces cerevisiae и антинейтрофильных цитоплазматиче-ских антител (Zholudev е! а1. [27]), предложенных
как специфические серологические маркеры для пациентов с БК.
Следует заметить, что уровни большей части ЖК у пациентов с неклассифицируемыми колитами занимали промежуточное положение между таковыми при болезни Крона и у здоровых лиц. Можно предположить, что часть пациентов с НКК имели не верифицированную болезнь Крона. В клинической практике установление диагноза у пациентов с ВЗК -это сложный, порой многолетний процесс. Вероятно, существует потенциал использования уровней вышеописанных жирных кислот и их отношений для диагностических целей. Это продемонстрировало сопоставление уровней ЖК у больных с НКК с дифференцирующими значениями ЖК для пациентов с болезнью Крона. Подтверждение диагноза «болезнь Крона» у пациентов с НКК, уровни жирных кислот которых оказались в пределах значений для группы БК, показывает перспективность данного подхода и необходимость дальнейших исследований в данном направлении.
Таким образом, на основании проведенного исследования можно сделать следующие выводы:
• Уровни большей части насыщенных, мононенасыщенных омега-9, омега-6 ПНЖК оказались достоверно выше, а содержание преобладающей части омега-3, ряда омега-6 (линолевой, эйкода-диеновой, арахидоновой) - ниже, чем у здоровых лиц. Относительное содержание ЖК у больных с неклассифицируемыми колитами оказалось промежуточным между таковыми у больных с БК и здоровыми.
• Активности дельта-6-десатуразы, элонгазы в сыворотке крови и мембранах эритроцитах у пациентов с болезнью Крона выше, чем у здоровых лиц и больных с НКК (р<0,05-0,001).
• Созданные диагностические панели (ЖК сыворотки крови и мембран эритроцитов) позволили дифференцировать пациентов с БК от здоровых лиц с достаточно высокими уровнями чувствительности и специфичности (для Эр - панель 1 - АиС 0,791, чувс. 0,80, спец. 0,74; панель 2 - АиС 0,813, чувс. 0,82, спец. 0,66; панель 3 -АиС 0,894, чувс. 0,82, спец. 0,88). Наилучшие диагностические показатели выявлены у соотношения С16:0/С18:2 в сыворотке крови и мембранах эритроцитов (для мембран эритроцитов - чувствительность 82%, специфичность 88%, прогностическая ценность положительного результата 85%, отрицательного результата 83%, диагностическая точность 84%)
• Полученные дифференцирующие значения уровней ЖК и их индексов в мембранах эритроцитов позволили выявить пациентов с предполагаемой болезнью Крона из тех, у кого диагностирован неклассифицируемый колит, что свидетельствует о высоком потенциале данного подхода для целей дифференциальной диагностики.
• Выявленные особенности уровней ЖК мембран Эр и СК, а также их соотношения у пациентов с БК перспективны для целей дифференциальной диагностики, в том числе, в случаях неклассифи-цируемых колитов.
Литература | References
1. Sands B. E., Siegel C. A. Crohn's disease. In: Feldman M., Friedman L. S, Brandt L. J., eds. Sleisenger & Fordtran's Gastrointestinal and Liver Disease. 9th ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier. 2010. chap 111.
2. Burisch J., Munkholm P. Inflammatory bowel disease epidemiology. Curr. Opin. Gastroenterol. 2013, Vol. 29, No. 4, pp. 357-362.
3. Abraham C., Cho J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 2009, Vol. 361, pp. 2066-2078.
4. Harris M. L., Bayless T. M. Dietary antigens as aggravating factors in Crohn's disease. Dig. Dis. Sci. 1989, Vol. 34, pp. 1613-1614.
5. Sartor R. B. Pathogenesis and immune mechanisms of chronic inflammatory bowel diseases. Am. J. Gastroenterol. 1997, Vol. 92, pp. 5S-11S.
6. Powell J. J., Harvey R. S., Ashwood P, Wolsten-croft R., Gershwin M. E., Thompson R. P. Immune potentiation of ultrafine dietary particles in normal subjects and patients with inflammatory bowel disease. J. Autoimmun. 2000, Vol. 14, pp. 99-105.
7. Uchiyama K., Odahara S., Nakamura M., et al. The fatty acid profile of the erythrocyte membrane in initial-onset inflammatory bowel disease patients. Dig. Dis. Sci. 2013, Vol. 58, pp. 1235-1243.
8. Кручинина М. В., Азгалдян А. В., Светлова И. О., Шашков М. В., Соколова А. С., Кручинин В. Н. Особенности состава жирных кислот сыворотки крови и мембран эритроцитов у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (пилотное исследование). Современные проблемы науки и образования, 2019, № 3. http://www.science-education.ru/ru/article/ view?id=28868 (дата обращения: 10.06.2019). DOI: 10.17513/spno.28868.
Kruchinina M. V., Azgaldyan A. V., Svetlova I. O., Shashkov M. V., Sokolova A. S., Kruchinin V. N. Features
of the composition of fatty acids in blood serum and erythrocyte membranes in patients with inflammatory bowel diseases (pilot study). Modern problems of science and education. 2019, No. 3. DOI: 10.17513 / spno.28868.
9. Friedman A. N., Yu Z., Tabbey R., Denski C., et al. Low blood levels of long-chain n-3 polyunsaturated fatty acids in US hemodialysis patients: clinical implications. Am. J. Nephrol. 2012, Vol. 36, pp. 451-458.
10. Arab L., Akbar J. Biomarkers and the measurement of fatty acids. Public Health Nutr. 2002, Vol. 5, pp. 865-871.
11. Кручинина М. В., Кручинин В. Н., Прудникова Я. И., Громов А. А., Шашков М. В., Соколова А. С. Исследование уровня жирных кислот мембран эритроцитов и сыворотки крови у пациентов с ко-лоректальным раком г. Новосибирска. Успехи молекулярной онкологии. - 2018. - Т. 5. - № 2. - С. 50-61.
Kruchinina M. V., Kruchinin V. N., Prudnikova Ya. I. et al. Study of the level of fatty acids in erythrocyte membranes and serum of patients with colorectal cancer in Novosibirsk. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2018;5(2):50-61.
12. Stillwell W. An introduction to biological membranes. Composition, structure and function. Second edition -UK London: Elsevier. 2016. 432 p.
13. Veglia F., Tyurin V. A., Blasi M., De Leo A., et al. Fatty acid transport protein 2 reprograms neutrophils in cancer. Nature. 2019. Vol. 569, No. 7754, pp. 73-78.
14. Hodson L., SkeaffC. M., Fielding B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Prog. Lipid. Res. 2008, Vol. 47, pp. 348-380.
15. Asciutti-Moura L. S., Guilland J. C., Fuchs F., Richard D., Klepping J. Fatty acid composition of serum lipids and its relation to diet in an elderly institutionalized population. Am. J. Clin. Nutr. 1988. Vol. 48, pp. 980-987.
16. Sharon P., Stenson W. F. Enhanced synthesis of leukot-riene B4 by colonic mucosa in inflam-matory bowel disease. Gastroenterology. 1984, Vol. 86, pp. 453-460.
17. Hommes D. W., Meenan J., de Haas M., et al. Soluble Fc gamma receptor III (CD16) and eicosanoid concentrations in gut lavage fluid from patients with inflammatory bowel disease: reflection of mucosal inflammation. Gut. 1996, Vol. 38, pp. 564-567.
18. Tjonneland A., Overvad K., Bergmann M. M., Nagel G., et al. Linoleic acid, a dietary n-6 polyunsaturated fatty acid, and the aetiology of ulcerative colitis: a nested case-control study within a European prospective cohort study. Gut. 2009, Vol. 58, pp. 1606-1611.
19. Seimon T. A., Nadolski M. J., Liao X., Magallon J., et al. Atherogenic lipids and lipoproteins trigger CD36-TLR2-dependent apoptosis in macrophages undergoing endoplasmic reticulum stress. Cell Metab. 2010, Vol. 12, pp. 467-482.
20. Saraswathi V., Hasty A. H. Inhibition of long-chain acyl coenzyme A synthetases during fatty acid loading induces lipotoxicity in macrophages. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009, Vol. 29, pp. 1937-1943.
21. Fritz V., Benfodda Z., Rodier G., Henriquet C., et al. Abrogation of de novo lipogenesis by stearoyl-CoA desaturase 1 inhibition interferes with oncogenic signaling and blocks prostate cancer progression in mice. Mol. Cancer Ther. 2010, Vol. 9, pp. 1740-54.
22. Igarashi O., Sugano M., Ikeda I. A Modern Viewpoint of the Fatty Acid Nutrition Tokyo: Koseikan. 1998. 563 p.
23. Okuyama H., Kobayashi T., Watanabe S. Dietary fatty acids - The n-6/n-3 balance and chronic elderly disease. Prog. Lipid Res. 1997. Vol. 35, pp. 409-457.
24. Saku N., Kobayashi J., Kitamura S. Eicosapentaenoic acid modulates arachidonic acid metabolism in rat alveolar macrophages activated by silica. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 1999. Vol. 61, pp. 51-54.
25. Li Q., Zhang Q., Wang M., Zhao S., Xu G., Li J. n-3 polyunsaturated fatty acids prevent disruption of epithelial barrier function induced by proinflammatory cytokines. Molecular Immunology, 2008, Vol. 45, pp. 1356-1365.
26. Lans W. E. M. Fish and Human Health - New York: NY Academic Press, 1986. 458 p.
27. Zholudev A., Zurakowski D., Young W., Leichtner A., Bousvaros A. Serologic testing with ANCA, ASCA, and anti-OmpC in children and young adults with Crohn's disease and ulcerative colitis: diagnostic value and correlation with disease phenotype. Am. J. Gastroenterol. 2004, Vol. 99, pp. 2235-2241.
Работа выполнена в рамках темы «Эпидемиологический мониторинг состояния здоровья населения и изучение молекулярно-генетических и молекулярно-биологических механизмов развития распространенных терапевтических заболеваний в Сибири для совершенствования подходов к их диагностике, профилактике и лечению» ГЗ № 0324-2018-0001, Рег. № АААА-А17-117112850280-2.
