CC BY
36
В.И. Коненков, Е.В. Зонова, Ю.Б. Леонова, М.А. Королев, В.Ф. Прокофьев,
О.В. Голованова, А.В. Шевченко
НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск
ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ЦИТОКИНОВ С РЕГУЛИРУЮЩЕЙ ВОСПАЛЕНИЕ АКТИВНОСТЬЮ В КАЧЕСТВЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРОГНОЗА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА
Контакты: Владимир Иосифович Коненков [email protected]
Цель. Выявить генетические маркеры, позволяющие прогнозировать эффективность терапии ревматоидного артрита (РА). Материал и методы. В исследование вошли 104 пациента с РА (93 женщины и 11 мужчин, средний возраст 53,38±13,55 года). Длительность РА составила в среднем 9,18±8,97 года. Больные получали терапию базисными противовоспалительными препаратами (БПВП): 69,23% — метотрексатом (МТ) в дозе 10—17,5мг/нед, 30,77% — сульфасалазином (2 г/сут). Эффективность терапии оценивали по критериям EULAR через 24 нед от ее начала. Клинические и лабораторные показатели у принимавших МТ и сульфасалазин не различались. Группы больных с различной эффективностью БПВП были проанализированы по аналогичным точкам полиморфизмов одних и тех же генов цитокинов.
Результаты. Проведенное исследование показало, что у части пациентов с наличием в геноме определенных комбинаций аллельных вариантов промоторных участков генов цитокинов терапия БПВП ни в одном случае не оказывает положительного эффекта. В группе пациентов, «не ответивших» на базисную терапию, преобладают аллели генов, ассоциированных с высокой продукцией ИЛ 1, низкой продукцией ИЛ 6 и низкой продукцией цитокинов с антивоспалительной активностью. У пациентов с выраженным эффектом от проведенного лечения преобладают аллели, ассоциированные с высокой продукцией ИЛ 6 и низкой продукцией ИЛ 1, с тенденцией к повышению частоты аллелей генов ИЛ 4 и ИЛ 10, обеспечивающих высокий уровень продукции противовоспалительных цитокинов. Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эффект базисной противоревматической терапии с использованием метотрексата, сульфасалазина во многом зависит от «цитокинового генотипа» пациента. Вероятно, анализ соответствующих факторов может быть использован в практике ревматолога.
Ключевые слова: ревматоидный артрит, базисные противовоспалительные препараты, генетические маркеры, провоспали-тельные и антивоспалительные цитокины, полиморфизм
POSSIBILITIES OF USING THE GENOTYPING OF CYTOKINES WITH INFLAMMATION-REGULATORY ACTIVITY AS BIOLOGICAL MARKERS FOR PREDICTION OF THE EFFICIENCY OF THERAPY FOR RHEUMATOID ARTHRITIS V.I. Konenkov, E.V. Zonova, Yu.B. Leonova, M.A. Korolev, V.F. Prokofyev, O.V. Golovanova, A.V. Shevchenko
Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Siberian Branch, Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk
Contact: Vladimir Iosifovich Konenkov [email protected]
Objective. To reveal the genetic markers that may predict the efficiency of therapy for rheumatoid arthritis (RA).
Subjects and methods. The study enrolled 104 patients (93 women and 11 men) (mean age 53.38+13.55years). The duration of RA averaged 9.18+8.97 years. The patients were treated with basic anti-inflammatory drugs (BAIDs): 69.23% took methotrexate (MT), 10—17.5 mg/week; 30.77% received sulfasalazine, 2 g/day. Therapeutic effectiveness was evaluated using the European League Against Rheumatism (EULAR) criteria following 24 weeks. Clinical and laboratory parameters were similar in MT- and sulfasalazine-treated patients. The patients groups showing the varying efficacy of BAIDs were analyzed from the similar cutoffs of polymorphisms of the same cytokine genes.
Results. The study indicated that some patients with certain combinations of allelic variants of promoter regions of cytokine genes had no benefits from BAID therapy. There was a preponderance of alleles in the genes associated with the high production of IL-1, the low generation of IL-6, and the low elaboration of cytokines with anti-inflammatory activity in the group of patients unresponsive to the basic therapy. The patients having many benefits from the performed treatment showed a predominance of alleles associated with the high production of IL-6 and the low generation of IL-1, with a tendency towards an increase in the frequency of alleles in the IL-1 and IL-10 genes that ensured a high elaboration of anti-inflammatory cytokines.
Conclusion. The findings suggest that the effect of basic anti-rheumatic therapy with methotrexate or sulfasalazine largely depends on the cytokine genotype of a patient. Analysis of appropriate factors is likely to be used in rheumatological care.
Key words: rheumatoid arthritis, basic anti-inflammatory drugs, genetic markers, proinflammatory and anti-inflammatory cytokines, polymorphism
Современная концепция фармакотерапии ревматоидного артрита (РА) ориентирует врача на достижение полной или частичной ремиссии и предусматривает необходимость назначения максимально активной терапии базисными противовоспалительными препаратами (БПВП) в первые месяцы болезни [1, 2]. Во многих случаях лечение БПВП недостаточно эффективно контролирует клиниче-
ские проявления и рентгенологическую динамику РА. Частота ремиссии не превышает 25% [3]. Столь низкие показатели являются серьезным стимулом для разработки новых подходов в фармакотерапии РА [4, 5]. Для более точного прогнозирования характера течения РА и эффективности терапии необходим анализ комплекса параметров, участвующих в развитии воспаления [6, 7]. Для выявления
таких биологических маркеров мы проанализировали частоту различных полиморфизмов в промоторных участках генов цитокинов с провоспалительной (интерлейкин — ИЛ 1 и 6, фактор некроза опухоли а — ФНО а) и анти-воспалительной активностью (ИЛ 10 и 4) у больных РА.
Целью настоящего исследования было выявление генетических маркеров, позволяющих прогнозировать эффективность терапии РА.
Материал и методы
В исследование включено 104 пациента с РА (93 женщины и 11 мужчин, средний возраст 53,38+13,55 года). Диагноз РА соответствовал критериям Американской коллегии ревматологов 1987 г. (ACR 1987). Продолжительность заболевания составила 9,18+8,97 года. У 14 больных была ранняя стадия РА и у 90 пациентов — развернутая или поздняя стадия болезни. Эти выделенные подгруппы не различались по уровню DAS 28 (5,94+1,32 и 5,33+1,46; р=0,218), HAQ (2,33+1,44 и 1,46+0,79; р=0,054) и скорости оседания эритроцитов (СОЭ — 37,0+16,84 и 29,86+18,46; р=0,261). Не выявлено и значимых различий в распределении анализируемых генетических признаков между этими группами. Распределение больных по рентгенологическим стадиям [8] в общей группе было следующим: II стадия — 36,54%, III — 36,54% и IV — 26,92%. Преобладали пациенты со II и III классами функциональной недостаточности суставов (ACR 1992), наличием экстраартикулярных проявлений болезни (79,81%). Степень активности по DAS 28 в 34,62% случаев определена как умеренная, в 65,38% — как высокая, среднее значение DAS 28 составило 5,53+1,32, HAQ —
1,97+1,12. 87,7% обследованных были позитивны по ревматоидному фактору (РФ), 83,5% — по антителам к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП).
Ранее проводимая терапия аминохинолиновыми производными или метотрексатом (МТ) в дозе 7,5 мг/нед в исследуемой группе пациентов была неэффективна. У части больных с малой длительностью РА иммуносупрессивная терапия назначалась впервые. Использовался МТ в дозе 10—17,5 мг/нед (69,23% пациентов) или сульфасалазин 2 г/сут (30,77%). Эффективность терапии через 24 нед от ее начала оценивалась по критериям EULAR [9, 10]. Основные клинические и лабораторные показатели: уровни DAS 28 (5,51+1,33 и 5,55+1,13; р=0,874), HAQ (1,59+0,83 и
1,93+0,99; р=0,104), СОЭ (27,56+16,25 и 33,47+14,65; р=0,126) и С-реактивного белка (СРБ — 6,42+3,08 и 7,28+3,01; р=0,275) — у пациентов, получавших МТ и суль-фасалазин, не различались. Не выявлено значимых различий и в распределении анализируемых генетических признаков между этими группами. Основанием для объединения пациентов, леченных МТ и сульфасалазином, в одну группу явилось сходство противовоспалительных и иммуносупрессив-ных механизмов действия этих препаратов, реализуемых за счет изменения метаболизма аденозина, подавления синтеза циклооксигеназы 2 (ЦОГ 2), металлопротеиназ, провоспа-лительных цитокинов ФНО а, интерферона у (ИНФ у), ИЛ 1ß, 6 и повышения выработки противовоспалительных ИЛ 4 и 10. В сравнительных исследованиях эффективность суль-фасалазина и МТ была сопоставима [11, 12].
Методы исследования полиморфизма генов цитокинов. Геномную ДНК выделяли из ядросодержащих клеток периферической крови при помощи набора реагентов производства ООО «Лаборатория Медиген» (Новосибирск). Полиморфизмы, локализованные в промоторных регионах генов: ФНО а в позициях С-863А, G-308A, G-238A, ИЛ 1ß
T-31C, ИЛ 4 C-590T, ИЛ 6 G-174C, ИЛ 10 C-592A, — изучались с помощью метода рестрикционного анализа продуктов амплификации (анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов — ПДРФ-анализ). Амплификация специфических участков генома проводилась с использованием праймеров и параметров температурных циклов, описанных в литературе [13—18]. Продукты амплификации подвергались рестрикции соответствующими эндонуклеазами: в случае генотипирования полиморфизма ФНО а С-863А — Bst BAI, ФНО а G-308A — Bsp19 I , ФНО а G-238A — Msp I, ИЛ 1в T-31C — Alu I, ИЛ 4 C-590T — Bme 18 I, ИЛ 6 G-174C — SfaN I, ИЛ 10 C-592A — RsaI («СибЭнзим», Новосибирск). Гидролиз продуктов амплификации проводили в течение 12 ч при оптимальной для фермента температуре. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве маркера длин фрагментов ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («СибЭнзим», Новосибирск).
При статистическом анализе результатов исследований оценивались частота встречаемости генов, генотипов и их комбинаций, отношение шансов (OR), доверительный интервал (CI) для OR и диагностический вес признаков (DK). Частоту аллелей генов цитокинов вычисляли методом прямого подсчета по формуле: f=n/2N, где n — количество раз встречаемости аллеля (у гомозигот он учитывался дважды), 2N — удвоенная численность обследованных. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Хар-ди—Вайнберга согласно рекомендациям Б. Вейр [19].
Частоту встречаемости отдельных генотипов и их комбинаций определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип (комбинацию генотипов), к общему числу обследованных в группе по формуле: f=n/N, где n — количество раз встречаемости генотипа (комбинации генотипов), N — численность обследованных. Статистическую оценку силы ассоциации генов, генотипов и их комбинаций с клинической эффективностью терапии проводили по показателю OR (odds ratio — отношение шансов события в одной группе к шансам этого же события в другой группе) с вычислением 95% доверительного интервала (95% Confidence Interval — 95%CI) [20, 21].
Достоверность (p) ассоциаций и различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию х2 с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц [22].
Отбор генетических комплексов, пригодных для индивидуального прогнозирования эффективности терапии, проводился на основе значений трех статистических критериев: двусторонний вариант точного метода Фишера; информационная мера Кульбака (Jku); диагностический (прогностический) коэффициент по формуле: DK=10lg (P1/P2), где P1 и P2 — частота прогностического признака в сравниваемых группах [22—24]. Если прогностический коэффициент в таком анализе достигает величины 12,8, вероятность реализации прогноза составляет 95%. Если хотя бы одна из частот в таблице сопряженности равнялась нулю, то расчет OR, DK и других показателей проводился по модифицированным формулам — ко всем значениям ячеек таблицы 2x2 прибавлялась константа S, равная 0,5 или 1. В последнем случае все значения ячеек таблицы сопряженности предварительно удваивались. Данная модификация позволяет избежать ошибочных математиче-
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕВМАТОЛОГИЯ, 2010, № 5, 19-26
Таблица 1
Характеристики распределения и показатели прогностической значимости комбинаций генотипов полиморфизмов цитокинов у больных ревматоидным артритом с высокой эффективностью терапии
Комбинации генотипов Высокая Отсутствие OR OR's P(tmF2) Se Sp J DK
эффективность эффекта 95% CI
n N % n N %
IL4-590CT/IL6-174GG/IL1B-31CC 4 31 12,90 0 33 0,00 10,96 0,57-212,64 0,0495 12,90 100,00 0,63 9,8
IL4-590CC/TNF-308GA/TNF-863CC 6 30 20,00 1 34 2,94 8,25 0,93-73,08 0,0444 20,00 97,06 0,71 8,3
IL6-174GC/TNF-308GA/TNF-863CC 6 30 20,00 1 33 3,03 8,00 0,90-70,93 0,0468 20,00 96,97 0,70 8,2
IL6-174GG/TNF-863CC/IL1B-31CC 4 30 13,33 0 33 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
IL10-592CC/TNF-308GA/TNF-863CC 6 30 20,00 1 34 2,94 8,25 0,93-73,08 0,0444 20,00 97,06 0,71 8,3
IL4-590CT/IL6-174GG/TNF-238GG/IL1B-31CC 4 31 12,90 0 33 0,00 10,96 0,57-212,64 0,0495 12,90 100,00 0,63 9,8
IL4-590CT/IL6-174GG/TNF-308GG/IL1B-31CC 4 31 12,90 0 33 0,00 10,96 0,57-212,64 0,0495 12,90 100,00 0,63 9,8
IL4-590CT/IL6-174GG/TNF-863CC/IL1B-31CC 4 30 13,33 0 33 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
IL6-174GC/TNF-238GG/TNF-308GA/TNF-863CC 6 30 20,00 1 33 3,03 8,00 0,90-70,93 0,0468 20,00 96,97 0,70 8,2
IL6-174GG/TNF-238GG/TNF-863CC/IL1B-31CC 4 30 13,33 0 33 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
IL6-174GG/TNF-308GG/TNF-863CC/IL1B-31CC 4 30 13,33 0 33 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
IL6-174GC/TNF-308GA/TNF-863CC/IL1B-31TT 4 30 13,33 0 33 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
IL4-590CT/IL6-174GG/TNF-238GG/TNF-308GG/IL1B-31CC 4 31 12,90 0 33 0,00 10,96 0,57-212,64 0,0495 12,90 100,00 0,63 9,8
IL4-590CT/IL6-174GG/TNF-238GG/TNF-863CC/IL1B-31CC 4 30 13,33 0 33 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
IL4-590CT/IL6-174GG/TNF-308GG/TNF-863CC/IL1B-31CC 4 30 13,33 0 33 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
IL6-174GG/TNF-238GG/TNF-308GG/TNF-863CC/IL1B-31CC 4 30 13,33 0 33 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
IL6-174GC/TNF-238GG/TNF-308GA/TNF-863CC/IL1B-31TT 4 30 13,33 0 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
33
IL4-590CT/IL6-174GG/TNF-238GG/TNF-308GG/TNF-863CC/IL1B-31CC 4 30 13,33 0 33 0,00 11,38 0,59-220,86 0,0460 13,33 100,00 0,66 9,9
Примечание. Здесь и далее в таблицах: п — число носителей комбинаций генотипов; N — общее число обследованных; % — частота встречаемости комбинаций генотипов; OR — отношение шансов; OR's 95%С1 — 95% доверительный интервал для OR; PitmFi) — значения Р разности частот встречаемости комбинаций генотипов в группах сравнения по двустороннему варианту точного метода Фишера; Se — чувствительность, %; Sp — специфичность, %; J — информативность по Кульбаку; DK — диагностический коэффициент (прогностический вес признака); IL — интерлейкин, TNF — фактор некроза опухоли.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕВМАТОЛОГИЯ,2010, № 5, 19-26
м
Характеристики распределения и показатели прогностической значимости комбинаций генотипов полиморфизмов цитокинов у больных ревматоидным артритом с умеренной эффективностью терапии
Комбинации генотипов Высокая Отсутствие ОИ ок\ ІЧіімі’і) 8е 8р 3 ОК
эффективность эффекта 95% СІ
п N % п N %
11Л-590СТ/ШР-863СА
11.6-174СС/ІІЛВ-31ТТ
11.4-590СТ/ШР-238СС/гар-863СА ІР4-590СС/ШР-308СА/гар-863СА ІР4-590СТ/ШР-308СС/гар-863СА ІР6-174СС/ІІЛ0-592СС/ШР-238СС ІР6-174СС/ІІЛ0-592СС/ШР-308СС
11.6-174СС/ШР-238СС/гар-308СС
11.6-174СС/ШР-238СС/гар-863СС
11.6-174СС/ШР-238СС/іиВ-31ТТ
11.6-174СС/ШР-308СС/ШР-863СС
11.6-174СС/ШР-308СС/11ЛВ-31ТТ ТМР-238СС/ШР-308СС/ШР-863СС ІР4-590СТ/ІР6-174СС/ШР-308СС/ІІЛВ-31ТТ
11.4-590СТ/ШР-238СС/гар-308СС/ШР-863СА ІР6-174СС/ІІЛ0-592СС/ШР-238СС/ШР-308СС Ш>-17400/11,10-592СС/ТМР-238СС/ІІЛВ-31ТТ ІР6-174СС/іи0-592СС/ШР-308СС/ШР-863СС Ш>-17400/11,10-592СС/ТМР-308СС/ІІЛВ-31ТТ ІР6-174СС/ШР-238СС/гар-308СС/ШР-863СС
11.6- 174СС/ШР-238СС/гар-308СС/ІІЛ В-31ТТ
11.6- 174СС/ШР-238СС/гар-863СС/ІІЛ В-31ТТ ІЬб-174СС/ШР-308СС/ШР-863СС/ІІЛ В-31ТТ ІІЛ0-592СС/ШР-238СС/гар-308СС/ШР-863СС
9 38 23,68 2
6 39 15,38 13
9 38 23,68 2
0 38 0,00 4
9 38 23,68 2
5 39 12,82 11
4 39 10,26 10
9 39 23,08 16
9 38 23,68 16
5 39 12,82 13
5 38 13,16 15
4 39 10,26 12
13 38 34,21 21
6 39 15,38 0
9 38 23,68 2
3 39 7,69 10
2 39 5,13 9
2 38 5,26 9
2 39 5,13 8
4 38 10,53 15
3 39 7,69 12
4 38 10,53 11
З 38 7,89 11
5 38 13,16 13
34 5,88 4,97 0,99-24,90 0,0499
33 39,39 0,28 0,09-0,85 0,0314
34 5,88 4,97 0,99-24,90 0,0499
34 11,76 0,09 0,00-1,70 0,0451
34 5,88 4,97 0,99-24,90 0,0499
33 33,33 0,29 0,09-0,96 0,0485
33 30,30 0,26 0,07-0,94 0,0402
33 48,48 0,32 0,12-0,88 0,0284
33 48,48 0,33 0,12-0,91 0,0456
33 39,39 0,23 0,07-0,73 0,0137
33 45,45 0,18 0,06-0,58 0,0035
33 36,36 0,20 0,06-0,70 0,0107
34 61,76 0,32 0,12-0,84 0,0327
33 0,00 13,00 0,70-240,10 0,0280
34 5,88 4,97 0,99-24,90 0,0499
33 30,30 0,19 0,05-0,77 0,0161
33 27,27 0,14 0,03-0,73 0,0182
33 27,27 0,15 0,03-0,75 0,0186
33 24,24 0,17 0,03-0,86 0,0364
33 45,45 0,14 0,04-0,49 0,0012
33 36,36 0,15 0,04-0,58 0,0037
33 33,33 0,24 0,07-0,83 0,0229
33 33,33 0,17 0,04-0,68 0,0146
34 38,24 0,24 0,08-0,79 0,0275
23.68 94,12 0,54 6,0
15.38 60,61 0,49 -4,1
23.68 94,12 0,54 6,0
0,00 88,24 0,59 -10,0
23.68 94,12 0,54 6,0 5
12.82 66,67 0,43 -4,1 5
10.26 69,70 0,47 -4,7
>
23,08 51,52 0,41 -3,2
V
23.68 51,52 0,39 -3,1 =
12.82 60,61 0,65 -4,9
т
13.16 54,55 0,87 -5,4
10.26 63,64 0,72 -5,5 «
г>
34,21 38,24 0,35 -2,6 ^
т
15.38 100,00 0,78 10,4 ^
23.68 94,12 0,54 6,0
00
7.69 69,70 0,67 -6,0 >
X
5.13 72,73 0,80 -7,3 5
5.26 72,73 0,79 -7,1
5.13 75,76 0,64 -6,7
10.53 54,55 1,11 -6,4
7.69 63,64 0,97 -6,7
10.53 66,67 0,57 -5,0
7,89 66,67 0,80 -6,3
13.16 61,76 0,58 -4,6
а
о
5“ г
Н Л
о
гл 4© сТ 00 г-, сТ сч, 1,06 00 0, 0,84 гл 0,59 1,30
а
& ■& ■# I
н
н
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
н
о
'Ф
о
о
н
н
о
о
ь
¡г
Н
о
ь
¡г
о
о
'Ф
В
о
о
ь
¡г
н
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
о
о
о
о
'Ф
н
н
о
о
н
н
н
н
ь
¡г
я я
о
о
ь ь
¡г ¡г
о о
о о
-
г
о о о о
о
о
'Ф
о
о
'ф
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
о
о
о
о
'Ф
н
н
я
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
Н
о
о
ь
¡г
о
о
'Ф
н
н
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
Н
о
о
ь
¡г
&
о
о
о
ь
¡г
Н
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
о
о
о
о
'ф
м
ских ситуаций, связанных с делением на ноль, или выражений типа !в(0) [25—27].
С целью дополнительной характеристики генетических комплексов в качестве прогностических критериев использовали также показатели чувствительности и специфичности [21, 23].
Результаты
По результатам проведенного 24-недельного лечения пациенты были разделены на группы с высокой, умеренной эффективностью, с отсутствием клинически значимого эффекта и с развитием неблагоприятных побочных реакций. У 29,81% больных эффективность расценивалась как высокая, у 37,5% — как умеренная, у 32,69% лечение было неэффективным. У 64 (61,54%) пациентов отмечена хорошая переносимость БПВП, у 21 (20,19%) пациента зафиксированы незначительные проявления непереносимости, которые не послужили причиной отмены препарата. У 19 (18,27%) больных развились гепатотоксические реакции, лейкопения или тромбоцитопения, потребовавшие прекращения лечения.
При анализе частоты встречаемости 13 986 сочетаний генотипов трех-, четырех-, пяти- и шестилокусных комбинаций у больных с высокой эффективностью БПВП достоверные различия (р<0,05) по одностороннему критерию Фишера были зафиксированы для 20, а по двустороннему критерию — для 18 комбинаций. Этим пациентам с наличием в геноме генетических комбинаций, представленных в табл. 1, можно рекомендовать продолжение лечения выбранным БПВП, без необходимости перехода к дорогостоящей терапии генноинженерными биологическими препаратами (ГИБП).
Среди генов, ассоциирующихся с высокой эффективностью терапии БПВП, лишь в 1 случае выявлены аллельные варианты гена ИЛ 10 и в одном — ИЛ 4, обладающих выраженной противовоспалительной активностью. В этих комбинациях представлены в основном гены провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ 1, 6 и ФНО а. Из данных табл. 1 следует, что генотип ИЛ 6 в подавляющем большинстве случаев представлен гомозиготным вариантом GG в точке полиморфизма G-174C гена ИЛ 6. Последний, как известно, ассоциирован с высоким уровнем экспрессии мРНК и продукции этого провос-палительного цитокина [28—30]. ИЛ 6 играет заметную роль в развитии патологического процесса при РА [31—33]. Напротив, все гомозиготные генотипы генов провоспалительных цитокинов инициальной фазы воспаления: фактора ФНО а и ИЛ 1 — представлены сочетаниями аллелей, ассоциированными с низкой экспрессией соответствующих цитокинов в точках полиморфизма ИЛ 1|3 Т-31С, ФНО а G-238A, ФНО а G-308A и ФНО а С-863Л.
Ревматологам хорошо известно, что терапия БПВП не всегда бывает высокоэффективной. Для того чтобы оценить, отличаются ли генотипически пациенты с высокой эффективностью терапии от пациентов с умеренной эффективностью БПВП, мы проанализировали и эту группу больных по аналогичным точкам полиморфизмов тех же генов цитокинов. Результаты этого исследования, представленные в табл. 2, показали значительные различия между группами. Изучалась частота встречаемости 14 175 сочетаний генотипов трех-, четырех-, пяти- и шестилокусных комбинаций. Достоверные различия (р<0,05) по одностороннему критерию Фишера зафиксированы для 54, а по двустороннему — для 33 комбинаций.
Среди пациентов группы с умеренной эффективностью терапии практически полностью отсутствовал генотип GG гена ИЛ 6, характерный для группы с высокой эффективностью. Наряду с этим в группе с умеренной эффективностью широко распространен генотип СС в полиморфном участке гена ИЛ 10 С-592Л ассоциированный с высоким уровнем продукции этого противовоспалительного цитокина. Среди пациентов с умеренной эффективностью лечения широкое распространение имеет генотип ТТ гена ИЛ 1|3 в точке полиморфизма ИЛ 1|3 Т-31С, ассоциированный с высоким уровнем его продукции и экспрессии мРНК.
Таким образом, пациенты с разной эффективностью терапии различаются по соотношению генов цитокинов с провоспалительной и ан-
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕВМАТОЛОГИЯ,2010, № 5, 19-26
¡^* Таблица 3
Характеристики распределения и показатели прогностической значимости комбинаций генотипов полиморфизмов цитокинов у больных ревматоидным артритом с отсутствием эффекта терапии
Комбинации генотипов Высокая Отсутствие ОИ ок\ ІЧіімі’і) 8е 8р 3 ОК
эффективность эффекта 95% СТ
п N % п N %
ТМР-308СА/ШР-863СА
1Р4-590СС/ШР-308СА/гар-863СА
ІР6-174СС/ІІЛ0-592СС/ІІЛВ-31ТТ
ІР6-174СС/ІІЛ0-592СА/ІІЛВ-31ТС
11.6- 174СС/ШР-238СС/ШР-308СС
11.6- 174СС/ШР-308СС/ШР-863СС
11.6-174СС/ШР-308СС/11ЛВ-31ТТ 1Р6-174СС/ТМР-863СА/11ЛВ-31ТС ІІЛ0-592СА/ТМР-863СА/ІІЛВ-31ТС ІР4-590СС/ІР6Л74СС/ШР-863СА/ІІЛВ-31ТС
11.4-590СС/ШР-238СС/ШР-308СА/ШР-863СА 1Р4-590СС/ШР-308СА/гар-863СА/11ЛВ-31ТТ 1Р6-174СС/11Л0-592СС/ШР-238СС/ШР-308СС Ш>-17400/11,10-592СС/ТМР-238СС/11Л В-31ТТ ІР6-174СС/ІІЛ0-592СА/ШР-238СС/ІІЛВ-31ТС ІР6-174СС/іи0-592СС/ШР-308СС/ШР-863СС Ш>-17400/11,10-592СС/ТМР-308СС/ІІЛ В-31ТТ ІР6-174СС/іи0-592СА/ШР-863СА/ІІЛВ-31ТС
11.6-174СС/ШР-238СС/ШР-308СС/ШР-863СС
11.6- 174СС/ШР-238СС/ШР-308СС/ІІЛ В-31ТТ ІР6-174СС/ТМР-238СС/ТМР-863СА/ІІЛВ-31ТС ІР6-174СС/ТМР-308СС/ТМР-863СС/ІІЛВ-31ТТ іи0-592СС/ШР-238СС/гар-308СС/ШР-863СС ІІЛ0-592СА/ТМР-238СС/ТМР-863СА/ІІЛВ-31ТС
4 34 11,76 1
4 34 11,76 0
9 33 27,27 7
3 33 9,09 0
16 33 48,48 19
15 33 45,45 13
12 33 36,36 10
4 33 12,12 1
З 34 8,82 0
З 33 9,09 0
З 34 8,82 0
З 34 8,82 0
10 33 30,30 8
9 33 27,27 6
З 33 9,09 0
9 33 27,27 6
8 33 24,24 4
3 33 9,09 0
15 33 45,45 12
12 33 36,36 9
4 33 12,12 1
11 33 33,33 8
13 34 38,24 12
З 34 8,82 0
68 1,47 8,93 0,96-83,35 0,0412
68 0,00 20,21 1,06-387,27 0,0109
70 10,00 3,38 1,13-10,08 0,0389
70 0,00 16,18 0,81-322,90 0,0309
70 27,14 2,53 1,07-5,98 0,0448
68 19,12 3,53 1,41-8,79 0,0087
70 14,29 3,43 1,29-9,09 0,0188
68 1,47 9,24 0,99-86,31 0,0381
68 0,00 15,22 0,76-303,65 0,0349
68 0,00 15,72 0,79-313,82 0,0327
68 0,00 15,22 0,76-303,65 0,0349
68 0,00 15,22 0,76-303,65 0,0349
70 11,43 3,37 1,18-9,59 0,0263
70 8,57 4,00 1,2-12,44 0,0174
70 0,00 16,18 0,81-322,90 0,0309
68 8,82 3,88 1,25-12,06 0,0332
70 5,71 5,28 1,46-19,09 0,0168
68 0,00 15,72 0,79-313,82 0,0327
68 17,65 3,89 1,54-9,82 0,0043
70 12,86 3,87 1,43-10,49 0,0087
68 1,47 9,24 0,99-86,31 0,0381
68 11,76 3,75 1,33-10,54 0,0141
68 17,65 2,89 1,14-7,33 0,0292
68 0,00 15,22 0,76-303,65 0,0349
11.76 98,53 0,46 9,0
11.76 100,00 0,77 12,5
27.27 90,00 0,38 4,4
9.09 100,00 0,57 11,7
48,48 72,86 0,27 2,5 5
45.45 80,88 0,50 3,8 5
36.36 85,71 0,45 4,1
>
12.12 98,53 0,49 9,2
V
8.82 100,00 0,54 11,4 =
9.09 100,00 0,56 11,6
т
8.82 100,00 0,54 11,4
8.82 100,00 0,54 11,4 «
г>
30,30 88,57 0,40 4,2 ^
т
27.27 91,43 0,47 5,0 ^
9.09 100,00 0,57 11,7
00
27.27 91,18 0,45 4,9 >
X
24.24 94,29 0,58 6,3 5
9.09 100,00 0,56 11,6
45.45 82,35 0,57 4,1
36.36 87,14 0,53 4,5
12.12 98,53 0,49 9,2
33,33 88,24 0,49 4,5
38.24 82,35 0,35 3,4
8.82 100,00 0,54 11,4
сТ чо ш сТ сТ г--, сТ гл сТ 0,56 0,78 0,59 5 0, 0,54 4
а
о
5“ г
Н Л
о
я
О ■& ■& ■
СЧ,
Н
н
н
н
РЗ «
н
н
РЗ
и
и
—
г
н
о
о
—
г
&
и
и
н
РЗ
б
ь
¡г
о
о
ь
¡г
о
о
'ф
о
о
о
о
ь
¡г
Н
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
о
о
о
о
'ф
н
н
о
о
н
н
я
о
о
ь ь
¡г ¡г
о о
о о
ь ь
¡г ¡г
о о
о о
о
о
'ф
о
о
'ф
о
н
б
ь
¡г
о
о
ь
¡г
§
о
о
'ф
н
н
я
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
о
о
о
о
'Ф
н
н
я
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
Н
о
о
ь
¡г
&
о
'Ф
н
н
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
Н
о
ь
¡г
&
о
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
Н
о
о
о
о
о
ь
¡г
Н
о
ь
¡г
о
о
ь
¡г
о
о
о
о
'Ф
«
тивоспалительной активностью. Если в группе с высокой эффективностью наиболее распространены генетические конструкции с преобладанием активности провоспалительного ИЛ 6, то в группе с умеренной эффективностью мы имеем дело с преобладанием аллелей генов, связанных с высокой продукцией провоспалительного ИЛ 1, наряду с высокой частотой встречаемости аллелей гена антивоспалительного цитокина ИЛ 10.
Возможность прогнозирования высокой эффективности наиболее применяемой базисной терапии, несомненно, важна для любого практикующего ревматолога, однако не менее значимо предвидеть возможность ее неэффективности. Хорошо известно, что потеря временного «окна терапевтических возможностей» может негативно повлиять на отдаленные результаты лечения РА.
Проведенное исследование показало, что у части пациентов с РА с наличием в геноме определенных комбинаций аллельных вариантов промоторных участков генов цитоки-нов терапия БПВП ни в одном случае не оказывает положительного эффекта (табл. 3). В качестве группы сравнения в данной части исследования использована группа пациентов как с высоким, так и с умеренно выраженным эффектом проводимой терапии. В этих выборках анализировалась частота 14 175 сочетаний генотипов трех-, четырех-, пяти- и ше-стилокусных комбинаций. Достоверные различия (р<0,05) по одностороннему критерию Фишера зафиксированы для 40, а по двустороннему критерию — для 35 комбинаций.
Соответственно, при выявлении у пациента этих генетических комбинаций встает вопрос о необходимости перехода на терапию ГИБП или на использование максимальных дозировок БПВП уже на ранних этапах терапии.
Анализ частоты повторяющихся аллелей в этой группе пациентов с РА показал, что в позиции G-174C промоторно-го региона гена ИЛ 6 наиболее часто выявляется аллель С, ассоциированный с низким уровнем продукции этого основного провоспалительного цитокина.
Дальнейшее исследование полиморфизма гена ФНО среди больных, не ответивших на терапию, показало, что наиболее часто выявляются аллели в полиморфных позициях G-238A, G-308A, С-863А, ассоциированные с низким уровнем его продукции.
В данной группе пациентов наиболее часто выявляется аллель Т гена ИЛ 1|3 в позиции Т-31С, напротив, ассоциированный с высоким уровнем продукции этого цитокина, обладающего выраженной провоспалительной активностью.
Выделенные у этих больных аллельные варианты генов противовоспалительных цитокинов (ИЛ 4 С-590Т и ИЛ 10 С-592А) в основном ассоциировались с низким уровнем их продукции.
Таким образом, пациенты с РА, хорошо «отвечающие» и «не отвечающие» на БПВП, кардинальным образом различаются не только по комбинациям аллелей генов цитокинов с провоспалительной и антивоспалительной активностью, но и по преобладанию аллелей этих генов, ассоциированных с различным уровнем продукции факторов регуляции воспаления.
Так, в группе пациентов с выраженным эффектом от проведенного лечения преобладают аллели, ассоциированные с высокой продукцией ИЛ 6 и низкой продукцией ИЛ 1, с тенденцией к повышению частоты аллелей генов ИЛ 4 и 10, обеспечивающих высокий уровень продукции противовоспалительных цитокинов.
Напротив, в группе пациентов, «не ответивших» на базисную терапию, преобладают аллели генов, ассоциированных с высокой продукцией ИЛ 1, низкой продукцией
ИЛ 6 и низкой продукцией цитокинов с антивоспали-тельной активностью.
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о том, что эффект базисной противоревматической терапии с использованием метотрексата, сульфасалазина во многом зависит от «цитокинового генотипа» пациента. Вероятно, анализ соответствующих факторов может быть использован в практике ревматолога. При этом нет необходимости в проведении
иммуногенетических исследований в каждой ревматологической клинике. Методы выделения и консервации ДНК пациента, пригодной для подобного анализа, достаточно просты, и транспортировка этих образцов в профессиональные лаборатории не представляет технических затруднений. Помимо этого, важно отметить, что проведение подобного генетического анализа требуется лишь один раз на протяжении всей жизни пациента, что значительно облегчает задачу создания национального регистра пациентов с РА.
ЛИТЕРАТУРА
1. Насонов Е.Л. Лечение ревматоидного артрита: современное состояние проблемы. РМЖ 2006;14(8):3—7.
2. Ranganathan P. An update on methotrexate pharmacogenetics in rheumatoid arthritis. Pharmacogenomics 2008;9(4):439—51.
3. Fleischman R.M. Is there a need for new therapies for rheumatoid arthr. J Rheumatol 2005;32(73):3—7.
4. Насонов Е.Л. Применение тоцилизу-маба (Актемры) при ревматоидном артрите. Науч-практич ревматол 2009;3:18—35.
5. Wulk M.C., Furbun A., Metseluur H.J. et al. Are cytokine gene polymorphisms related to in vitro cytokine production profiles?
Liver Transplantation 2003;9(2):170—1.
6. Marinou I., Healy J., Mewar D. et al. Association of interleukin-6 and interleukin-10 genotipes with radiographic damage in rheumatoid arthritis is dependent on on autoantibody status. Ann Rheum 2007;56(8):2549—56.
7. Haukim N., Bidwell J.L., Smith A.J.P. еt al. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases. Genes Immun 2002;3:313—30.
8. Steinbrocker O., Traeger C.N.
Therapeutic criteria in rheumatoid arthritis.
J Am Med Assoc 1949;40(8):659—62.
9. Prevoo M.L., van't Hoff M.A., Kuper H.H. et al. Modified disease activity scores that include twenty-eight-joint counts. Arthr Rheum 1995;38:44—102.
10. Prevoo M.L., van Gestel A.M., van't Hoff M.A. et al. Remission in a prospective study of patients with rheumatoid arthritis. American Rheumatism Association preliminary remission criteria in relation to the diseases activity score. Brit J Rheum 1996;35:1101—5.
11. Haagsma С., van Riel P., de Long A., van de Putte L. Combination of sulphasalazine and methotrexate versus the single components in early RA: a randomized controlled double blind 52 week clinical trial. Br J Rheumatol 1997;36:1082—8.
12. Dougados M., Combe B., Cantagrel A. et al. Combination therapy in early rheuma-
toid arthritis: a randomized controlled double blind 52 week clinical trial of sulphasalazine and methotrexate compared with the single components. Ann Rheum Dis 1999;58:220-5.
13. Patino-Garcia A., Sotillo-Pineiro E., Modesto C., Sierrasesumaga L. Screening of the human tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) gene promoter polymorphisms by PCR-DGGE analysis. Mutat Res1999;406:121—5.
14. Li H.Q., Li Z., Liu Y. et al. Association of polymorphism of tumor necrosis factoralpha gene promoter region with outcome of hepatitis B virus infection. World J Gastroenterol 2005;11(33):5213-7.
15. Cantagrel A., Navaux F., Loubet-Lessonlie P. et al. IL-1beta, IL-1 receptor antagonist, IL-4, and IL-10 gene polymorphisms. Arthr Rheum 1999;42(6):1093—100.
16. Choi E., Lee H. J., Yoo T., Chanock T. A common haplotype of interleukin-4 gene IL4 is associated with severe respiratory syncytial virus disease in Korean children. J Infect Dis 2002;186:1207-11.
17. Fernandez-Real J.-M., Vendrell J., Richart C. et al. Platelet count and interleukin 6 gene polymorphism in healthy subjects. BMC Med Genet 2001;2(6);http://www.biomedcentral.com/1 471-2350/2/6
18. Mock C.C., Lanchbury J.S., Chan D.W., Lau C.S. Interleukin-10 promoter polymorphisms in Southern Chinese patients with systemic lupus erythematosus. Arthr Rheum 1998;41:1090-5.
19. Вейр Б. Анализ генетических данных: дискретные генетические признаки. М., 1995;400 c.
20. Певницкий Л.А. Статистическая оценка ассоциаций HLA-антигенов с заболеваниями. Вестн АМН СССР 1988;7:48-51.
21. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. М.: Медицина,1983;207 c.
22. Фишер Р.А. Статистические методы для исследователей. М.: Госстатиз-дат,1958;268 c.
23. Ластед Л.Б. Введение в проблему
принятия решений в медицине. М.: Мир, 1971;282 c.
24. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л.: Медицина,1983;296 c.
25. Певницкий Л.А. Статистическая оценка ассоциаций HLA-антигенов с заболеваниями. Вестн АМН СССР 1998;7:48-51.
26. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медикобиологических исследованиях с использованием Excel. 2-е изд., перераб. и доп. Киев: Морион, 2001;408 c.
27. Бабич П.Н., Чубенко А.В., Лапач С.Н. Применение современных статистических методов в практике клинических исследований. Сообщение третье. Отношение шансов: понятия, вычисление и интерпретация. Укр мед журн 2005;2(46):113-9.
28. Fishman D., Faulds G., Jeffery R. et al. The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis. J Clin Invest 1998;102(7):1369—76.
29. Kilpinen S., Hulkkonen J., Wang X.Y., Hurme M. The promoter polymorphism of the interleukin-6 gene regulates interleukin-6 production in neonates but not in adults. Eur Cytokine Netw 2001;12(1):62—8.
30. Boiardi L., Casali B., Farnetti E. et al. Relationship between interleukin 6 promoter polymorphism at position-174, IL-6 serum levels, and the risk of relapse/recurrence in polymyalgia rheumatica. J Rheumatol 2006;33(4):703—8.
31. Pascual M., Nieto A., Mataran L. et al. IL-6 promoter polymorphisms in rheumatoid arthritis. Gen Immun 2000;1:338-40.
32. Nishimoto N., Kishimoto T. Interleukin 6: from bench to bedside. Nat Clin Pract Rheumatol 2006;2(11):619—26.
33. Nakahara H., Song J., Sugimoto M. et al. Anti-interleukin-6 receptor antibody therapy reduces vascular endothelial growth factor production in rheumatoid arthritis. Arthr Rheum 2003;48(6):1521—9.
Поступила 27.01.2010
