CC BY
31
УДК 577.112+577.122:612.646
И.В. Бабушкина Т.Е. Курильская Ю.И. Пивоваров Г.Б. Боровский 2,
В.К. Войников 2, С.С. Голубев 1
ВОЗДЕЙСТВИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО КЛЕТОЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА НА ТЕЧЕНИЕ АДРЕНАЛИНОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ МИОКАРДА
1 Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (Иркутск) 2 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск)
В работе рассматривается возможность усиления протекторных свойств ксенотрансплантата при индукции содержания белков теплового шока (БТШ70) в неонатальных клетках сердца в условиях адреналинового повреждения миокарда.
Ключевые слова: белки теплового шока, неонатальные клетки
INFLUENCE OF MODIFIED CELL TRANSPLANT ON THE COURSE OF ADRENAL DAMAGE OF MYOCARDIUM
I.V. Babushkina 1, T.E. Kurilskaya 1, Yu.I. Pivovarov 1, G.B. Borovskiy 2,
V.K. Voinikov 2, S.S. Golubev 1
1 Scientific Center of Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS, Irkutsk
2 Siberian Institute of Physiology and Biochemistry of Plants SB RAS, Irkutsk
The authors consider the possibility of strengthening of protective properties of xenografts at induction of content of heat shock proteins (HSP70) in neonatal heart cells in the consitions of adrenal damage of myocardium.. Key words: heat shock proteins, neonatal cells
В экспериментальных исследованиях показано, что увеличение уровня белков теплового шока (БТШ) в органах может защищать их от повреждений. Защитная роль БТШ была выявлена в исследованиях как на культурах клеток, так и in vivo [4, 6, 8, 9].
Существует вероятность того, что позитивный эффект клеточной трансплантации при патологии определяется в том числе и содержанием в трансплантате белков с шаперонной активностью.
В пользу этой гипотезы свидетельствует ряд исследований, который демонстрирует способность БТШ70 и некоторых других белков проникать через модельные мембраны [5]. Кроме того, в ряде работ выявлен положительный эффект интрамиокардиальной трансплантации модифицированных мезенхимальных стволовых клеток с повышенным пулом БТШ70 и БТШ60 при постинфарктном ремоделировании [1].
Однако не исключается вариант позитивного эффекта клеточной трансплантации при патологии, который может быть связан со специфической активацией собственной системы синтеза стрессовых белков в поврежденном органе другими компонентами клетки.
В связи с этим целью исследования явилось изучение влияния трансплантации неонатальных ксеногенных клеток сердца с индуцированным в них синтезом белков теплового шока на поврежденный миокард в сравнении с трансплантацией аналогичных клеток без индукции синтеза БТШ и с подавленным синтезом этих белков.
МЕТОДИКА
В качестве трансплантата использовали суспензию неонатальных клеток сердца новорож-
денных кроликов, которую получали по методике А.Б. Борисова (1988) в нашей модификации. Жизнеспособность клеток сердца, которую оценивали по окраске трипановым синим в камере Горяева, составляла 80 %.
В последующем изменение содержания белков теплового шока в трансплантате осуществлялось путем воздействия на неонатальные клетки сердца высокой температуры или антибиотика. Суспензии неонатальных клеток сердца инкубировали в двух разных режимах: 1-q режим — инкубация 1,5 ч при 42 °С, затем 1,5 ч при 37 °С; 2-й режим — инкубация 1,5 ч при 37 °С с добавлением ампициллина (Ampi-cillin) в дозе 0,003 мг/мл среды инкубации. Эффект воздействия температуры и антибиотика оценивали по относительному содержанию стресс-белков в суспензиях неонатальных клеток сердца кролика на момент окончания культивирования в сравнении с суспензиями немодифицированных клеток сердца, которые были получены после выделения.
Опыты выполнялись на 80 беспородных белых крысах-самцах массой тела 180 — 250 г в осеннезимний период. Возраст животных был не менее 6 месяцев.
Животные разделялись на следующие группы:
Группа 1 — подкожное введение Solutio Adrenalini hydrohloridi0,1% pro injectionibus (в дозе 5 мг/кг) (Непомнящих Л.М., 1981) и физиологического раствора в объёме 0,5 мл (контрольная группа).
Группа 2 — подкожное введение адреналина и немодифицированных клеток, полученных сразу после выделения клеточных суспензий.
Группа 3 — подкожное введение адреналина и клеток, инкубированных в течение 1,5 ч при|42 °С,
затем в течение 1,5 ч при 37 °С (температурная модификация).
Группа 4 - подкожное введение адреналина и клеток, инкубированных в течение 1,5 ч при 37 °С с ампициллином в дозе 0,003 мг/мл среды инкубации.
Трансплантация неонатальных клеток сердца кролика осуществлялась сразу после инъекции адреналина подкожно в область левого бедра в дозе 500 тыс. клеток в 0,5 мл физиологического раствора (группы 2, 3, 4).
На первые и третьи сутки от начала эксперимента проводили эвтаназию (методом декапита-ции) и осуществляли забор ткани сердца для последующего биохимического и морфологического анализов. В сердцах экспериментальных животных определялась активность ферментов креатинки-назы (КК), лактатдегидрогеназы 1-го типа (ЛДГ-1; мкмоль/мг белка в мин) кинетическими экспресс-методами на спектрофотометре Ultrospec-4050 (LKB, Швеция) с помощью готовых наборов реактивов (P.Z. CORMAY (Польша, Германия) и Biocon Diag-nostik (Германия)) по методикам, рекомендованным Немецким обществом клинической химии.
Для контроля морфологических изменений в сердце рассчитывались: сосудистый индекс (Z S просвета сосуда / ЕА S среза на 10000 мкм2); клеточный индекс (Z количества клеток / ЕА S среза на 10000 мкм2); площадь поперечного сечения мышечных волокон (мкм2 в 30 полях зрения) и площадь некроза (мкм2 в 30 полях зрения). Для морфометрии использовались стандартные серийные срезы миокарда левого желудочка, расположенные перпендикулярно продольной оси сердца.
Морфометрические исследования образцов сердца выполняли с помощью видеосистемы «Quantimet 550IW» фирмы «Leica QWin16» и программного пакета «Leica QWin16».
Кроме того, в сердечной ткани экспериментальных животных изучали содержание цитозольных БТШ70 (включает конститутивную и индуцибель-ную формы) и БТШ72 (индуцируемая при стрессе форма БТШ70).
Для этого выделяли водорастворимый белок и проводили электрофорез по методу Лэммли (Laemmli, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN II («Bio-Rad», США), согласно инструкции производителя. Электрофорез проводили, выравнивая количество нанесенного
белкового препарата по концентрации белка, не допуская в то же время перегрузки по белку, т.е. не более 25 — 30 мкг белка на трек.
Суммарный белок переносили на нитроцел-люлозную мембрану (иммуноблоттинг). Для выявления белков теплового шока как конститутивной, так и индуцибельной изоформ использовали первичные антитела («Sigma» и «StressGen») на консервативную для белков этого семейства последовательность. Для детекции первичных антител применяли вторичные антитела (Sigma), конъюгированные с щелочной фосфотазой с последующей инкубацией мембран в растворе 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфата.
Полуколичественный анализ содержания белка на мембранах проводили с помощью программы Gel Analysis (Россия). Для определения достоверной картины изменения уровня содержания БТШ рассчитывался коэффициент изменения интенсивности окраски, определяющий, во сколько раз интенсивность окраски белкового пятна в опытном варианте больше средней интенсивности окраски пятна контрольного варианта. Коэффициент изменения интенсивности окраски определялся в условных единицах (у.е.). Для определении содержания БТШ70 и БТШ72 в неонатальных клетках сердца использовали среднюю интенсивность пятен белка в немодифицированных клетках сердца, для аналогичного расчета в тканях сердца крыс опытных групп в качестве контроля использовали среднюю интенсивность окраски белковых пятен у интактных животных.
Полученные данные в сравниваемых группах анализировали непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р < 0,05. Данные представляли в виде медианы с верхним и нижним квартилями (25-й и 75-й процентили).
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе исследования изучалось содержание белков теплового шока в трансплантате при воздействии на неонатальные клетки сердца высокой температуры или антибиотика. Как видно из таблицы 1 инкубация суспензии неонатальных клеток сердца при температурной модификации повышала содержание как конститутивной, так и индуцибельной форм БТШ70 практически в два раза. Инкубация неонатальных клеток сердца с ампициллином (в дозе 0,003 мг/мл суспензии
Таблица 1
Содержание белков теплового шока в суспензиях неонатальных клеток сердца кролика при различных режимах инкубации (медиана, нижний и верхний квартили (25%-75%))
Группы Содержание БТШ70 (у.е.) Содержание БТШ72 (у.е.)
Суспензия немодифицированных клеток (контроль) 0,98 (0,93-1,06) 0,96 (0,93-1,07)
Суспензия клеток, инкубированных 1,5 ч при 42 °С и 1,5 ч при 37 °С 1,98* (1,95-2,05) 1,95* (1,87-2,06)
Суспензия клеток, инкубированных с ампициллином 1,5 ч при 37 °С 0,40* (0,35-0,46) 0,23* (0,15-0,29)
Примечание: * - p < 0,05 - в сравнении с группой «суспензия немодифицированных клеток» (по критерию Манна-Уитни).
клеток) сопровождалась значительным снижением количества БТШ70 в сравнении с базовым уровнем. Таким образом, полученные данные в эксперименте in vitro дали возможность провести сравнительный анализ результатов, полученных на животных с трансплантацией клеток, имеющих высокое и низкое содержания БТШ.
Как показали исследования, наибольшая степень повреждения миокарда наблюдалась в контрольной группе, о чем свидетельствуют отек миокардиальных волокон и площадь некроза (табл. 2), в то время как ксенотрансплантация клеточных суспензий сердца модифицированных высокой температурой на фоне адреналинового повреждения миокарда вызывала меньший отек миокардиальных волокон. Следует отметить, что площадь очагов некроза в миокарде у животных при введении им клеток сердца с повышенным содержанием белков теплового шока при повреждении миокарда была в 1,27 раза ниже, чем в контрольной группе, и в 1,15 раза ниже, чем в группе с трансплантацией немодифицированных клеток. Степень повреждения миокарда в условиях трансплантации клеток, инкубированных с ампициллином, и в группе с трансплантацией немодифицированных клеток не имела существенных различий.
Как видно из таблицы 3, во всех группах с трансплантацией клеточного материала активность креа-тинкиназы и лактатдегидрогеназы в миокарде была
достоверно выше, чем в группе контроля (адреналиновое повреждение миокарда). Самая высокая активность КК и ЛДГ1 наблюдалась в группе с температурной модификацией, что свидетельствовало о большей сохранности активности этих ферментов у экспериментальных животных. В то же время в условиях трансплантации клеток, инкубированных с ампициллином, и в группе с трансплантацией немодифицированных клеток активность данных ферментов не имела существенных различий.
Исследование содержания БТШ70 в миокарде опытных животных показало, что максимальное значение фиксировалось к 1-м суткам наблюдения в группе с трансплантацией клеток, модифицированных высокой температурой, как в сравнении с контролем, так и в сравнении с животными с трансплантацией немодифицированных клеток (рис. 1а). Мы полагаем, что опережающий подъем содержания БТШ70 на 1-е сутки способствовал большей сохранности кардиомиоцитов за счет более эффективного функционирования механизмов ренатурации поврежденных, неправильно свернутых или агрегированных белков, восстанавливая тем самым активность жизненно важных макромолекул [7]. К третьим суткам наблюдалось достоверное снижение БТШ70 во всех группах по сравнению с группой контроля. Однако самый низкий уровень БТШ70 был выявлен у эксперимен-
Таблица 2
Влияние модифицированных суспензий клеток сердца неонатального кролика на характер изменения площади кардиомиоцитов и некроза в миокарде экспериментальных животных
(медиана, нижний и верхний квартили (25%-75%))
Группы животных Площадь кардиомиоцитов (мкм2) Площадь некроза (мкм2)
1-е сутки 3-и сутки 1-е сутки 3-и сутки
Группа 1 381.56 (314.20-410.02) 410.20 (326.35-436.17) 563.24 (493.14-626.35) 2115.59 (2054.34-2205.18)
Группа 2 301.07k (242.55-321.06) 323.60 (277.15-386.81) 510.36 (459.01-529.17) 1852.06k (1808.74-1893.12)
Группа 3 286.25k (225.55-319.09) 303.99k (260.82-314.51) 471.99k (377.51-493.82) 1692.36k; * (1597.53-1745.23)
Группа 4 350.69 (301.07-417.22) 395.92 (323.85-428.39) 547.53 (503.07-632.06) 1892.45k (1835.85-1991.37)
Примечание: группа 1 - введение адреналина; группа 2 - введение адреналина и трансплантация немодифицированных клеток; группа 3 - введение адреналина и трансплантация клеток, инкубированных 1,5 ч при 42 °С, затем 1,5 ч при 37 °С; группа 4 - введение адреналина и трансплантация клеток, инкубированных 1,5 ч при 37 °С с ампициллином. Далее в таблице обозначения групп те же; к - p < 0,05 в сравнении с группой 1; * - p < 0,05 в сравнении с группой 2 (по критерию Манна-Уитни).
Таблица 3
Влияние модифицированного клеточного ксенотрансплантата на активность лактатдегидрогеназы-1 и креатинкиназы (мкмоль/мг белка в мин) в миокарде крыс (медиана, нижний и верхний квартили (25%-75%))
Группы животных Лактатдегидрогеназа-1 Креатинкиназа
1-е сутки 3-и сутки 1-е сутки 3-и сутки
Интактные животные 5,86 (5,82-5,90) 17,16 (17,05-17,25)
Группа 1 4,010 (3,76-4,16) 4,280 (4,21-4,57) 13,590 (13,25-13,78) 12,990 (12,63-13,40)
Группа 2 5,11 k; 0 (5,02-5,40) 4,420 (4,23-4,63) 16,33 k; 0 (16,06-16,59) 14,90 k; 0 (14,66-15,33)
Группа 3 5,56 k; * (5,43-5,84) 5,69 k; * (5,51-5,81) 15,44 k; *; 0 (15,36-16,16) 17,04 k; * (16,62-17,11)
Группа 4 5,06 k; 0 (4,88-5,46) 4,84 k; 0 (4,69-4,97) 16,28 k; 0 (16,11-16,35) 14,78 k; 0 (14,73-15,08)
Примечание: к - p < 0,05 в сравнении с группой 1; * - p < 0,05 - в сравнении с группой 2; 0 - p < 0,05 в сравнении с группой интактных животных (по критерию Манна-Уитни).
Рис. 1. Содержание БТШ70 (а) и БТШ72 (Ь) в миокарде экспериментальных животных в условиях адреналинового повреждения миокарда (адр.), трансплантации немодифицированных клеток (адр. и кл.), клеток с повышенным содержанием БТШ (адр. и кл. (42 °С)) и клеток с пониженным содержанием БТШ (адр. и кл. (амп)) на 1-е и 3-и сутки от начала эксперимента. Данные представлены в виде медианы с верхним и нижним квартилями: к - р < 0,05 в сравнении с животными, которым вводился только адреналин; * - р < 0,05 - в сравнении с группой с трансплантацией немодифицированных клеток (по критерию Манна-Уитни).
тальных животных с трансплантацией клеток, модифицированных нагреванием. По-видимому, необходимость в большой продукции стресс-белков в этой группе утрачивалась в связи с тем, что они выполнили свою защитную функцию.
Содержание БТШ72 в группах с трансплантацией клеток на 1-е сутки ниже по сравнению с контролем. Это не противоречит нашим ранее опубликованным данным, поскольку в работах Б.К. Бадуева с соавт. [2] было показано, что трансплантация неонатальных клеток сердца вызывала опережающий подъем уровня стресс-белков по сравнению с вариантом «повреждение без трансплантации» (16 ч от начала эксперимента), и затем наработка этих белков падала
к 1-м суткам. Тем не менее, сравнительный анализ показал, что в группе с трансплантацией клеток, модифицированных высокой температурой, содержание БТШ72 на 1-е сутки было выше, чем в группах с базовым и пониженным уровнями БТШ (рис. 1Ь). Это может свидетельствовать о том, что к 16-му часу у данных животных содержание белков теплового шока было наибольшим. К 3-м суткам содержание этих белков во всех группах с трансплантацией ниже, чем в контроле.
Хотелось бы обратить внимание на содержание БТШ70 и БТШ72 в миокарде животных с введением клеток, инкубированных с ампициллином (рис. 1). Установлено, что в 1-е сутки эксперимента в данной
группе уровень БТШ70 был значимо ниже, чем в контроле. Можно предположить, что данный эффект связан с регуляторным воздействием трансплантата с пониженным содержанием БТШ на поврежденный миокард, однако механизм данного явления не ясен и требует дальнейшего изучения.
Содержание анализируемых БТШ72 в клетках сердца этих животных и показатели, характеризующие повреждение сердечной мышцы, занимают промежуточное положение между вариантами «повреждение без трансплантации» и «повреждение с трансплантацией немодифицированных клеток». Следовательно, снижение содержания БТШ в клетках трансплантата уменьшает, но не снимает полностью положительный эффект трансплантации клеток.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Трансплантация ксеногенных неонатальных клеток сердца с повышенным содержанием белков теплового шока приводит к существенному увеличению уровня цитозольных БТШ70 в поврежденном миокарде экспериментальных животных по сравнению с введением немодицифированного трансплантата и контрольными опытами.
Сниженное содержание белков теплового шока в трансплантате сопровождается значимым падением уровня БТШ70 в поврежденном миокарде по сравнению с опытами на животных с трансплантацией суспензий клеток сердца с повышенным и базовым содержанием БТШ и контрольными опытами.
Таким образом, под влиянием клеточной трансплантации происходила более ранняя и усиленная индукция внутриклеточных механизмов защиты сердечных клеток от повреждения, особенно ярко это проявлялось в группе с введением клеток, подвергнутых тепловой обработке. Мы предполагаем, что защитный эффект ксенотрансплантата не связан с иммуномодулирующим эффектом, поскольку ранее было показано, что механизм действия сердечных клеток не связан с их ксеногенностью и активацией иммунной системы [3].
Данный эффект может быть связан с влиянием экзогенных белков теплового шока, которые способны проникать через модельные мембраны [5]. Тем не менее, это не исключает специфическую активацию синтеза собственных белков теплового шока в поврежденном органе другими компонентами клетки, не связанными с синтезом стресс-белков, о чем свидетельствуют результаты,
полученные на животных с трансплантацией клеток, инкубированных с ампициллином.
Работа была выполнена при поддержке Программы фундаментальных научных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине».
ЛИТЕРАТУРА
1. Афанасьев С.А., Фалалеева Л.П., Реброва Т.Ю. и др. Влияние стресс-белков на переживае-мость мезенхимальных стволовых клеток костного мозга после интрамиокардиальной трансплантации на фоне постинфарктного ремоделирования сердца // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2008. - № 3. - С. 123-127.
2. Бадуев Б.К., Боровский Г.Б., Войников В.К. и др. Влияние клеточной трансплантации на индукцию белков теплового шока в поврежденном сердце // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2009. - № 3. - С. 149-153.
3. Клинова С.Н., Богородская С.Л., Курильская Т.Е. и др. Динамика адениловых нуклеотидов в раннем периоде инфаркта миокарда и при его коррекции клеточной трансплантацией // Сибирский медицинский журнал. - 2009. - Т. 86, № 3. - С. 38-41.
4. Малышев И.Ю., Малышева Е.В. Белки теплового шока и защита сердца // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. - 1998. - Т. 126, № 12. - С. 604-611.
5. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке // Цитология. - 2000. -Т. 42, № 4. - С. 323-341.
6. Меерсон Ф. З. Защита сердца от ишемических повреждений: роль стресс-лимитирующих систем и стабилизации структур миокарда // Российский кардиологический журнал. - 2001. -№ 5 (31). - С. 49-59.
7. Наградова Н. К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков // Соросовский образовательный журнал. - 1996. - № 7. - С. 10-18.
8. Рунович А.А., Войников В.К., Пивоваров Ю.И. и др. Атеросклероз и клеточная терапия. - Иркутск : Дом печати, 2005. - 304 с.
9. Шевченко Ю.Л., Свистов А.С., Тыренко В.В. и др. Аутоиндуцированная толерантность миокарда к ишемии: роль стресс-белков в механизмах ее возникновения // Физиол. чел. - 1999. - Т. 25, № 1. - С. 134-139.
Сведения об авторах
Бабушкина Инна Викторовна - младший научный сотрудник научного отдела коронарного атеросклероза Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (664033, г Иркутск, а/я 317, ул. Лермонтова, 132; тел.: 8 (924) 639-18-70, 8 (3952) 42-46-59; e-mail: [email protected]).
Курильская Татьяна Ефимовна - д.м.н., заведующая научным отделом коронарного атеросклероза Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН.
Пивоваров Юрий Иванович - д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник научного отдела коронарного атеросклероза Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН.
Боровский Геннадий Борисович - д.б.н., профессор, заместитель директора по науке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.
Войников Виктор Кириллович - д.б.н. профессор, директор Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.
Голубев Сергей Степанович - к.м.н., доцент, старший научный сотрудник лаборатории патоморфологии Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН.
