CC BY
18
МЕДИЦИНСКАЯ БИОФИЗИКА
Вестник Омского университета, 2005. № 1. С. 32-34.
© Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур, И.А. Пилыцикова, Л^ДК 543 42 062 616 5
H.A. Семиколенова, О.В. Свергунова, P.A. Файзулина, B.C. Медведев, 2005
ВОЗДЕЙСТВИЕ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ГАЗОВЫЙ СОСТАВ ГЕМОГЛОБИНА И ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫЕ КЛЕТКИ КРОВИ
Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур, И.А. Пилыцикова, Н.А. Семиколенова, О.В. Свергунова*, Р.А. Файзулина, B.C. Медведев**
* Омский государственный университет, кафедра микроэлектроники и медицинской физики
644077, Омск, пр. Мира, 55а, ** Муниципальное учреждение здравоохранения <<МСЧ №7» (¡44077, Омск, ул. Тварковского, 8
Получена 9 декабря 2004 г-
Research of processes of photoconversion of basic derivative haemoglobin at influence of impact laser radiation (A = 0,9/u m) has been pursued. It has been shown that appearance of free radicals (0~, CO~) was ensued on primary photochemistry reactions. Thus concentration of MetHb and HbCO was increased. There was derangement of the antioxidant system and damage of cellular structures by products of free-radical oxidization at large doses.
1. Введение
Эффект биостимуляции воздействием лазерного излучения широко применяется в клинике. Однако отсутствие количественных результатов исследования в терминах физически измеримых величин затрудняет проведение сравнительного анализа, ставит под сомнение методическую и физическую обоснованность эксперимента.
Алгоритмы воздействия лазерного излучения видимого и ИК-диапазона на гемопротеины задаются первичными процессами в молекуле железо-порфирина после фотовозбуждения. Для детального описания фотопроцессов необходимо знать электронную структуру и спектры молекул гема при различных степенях окисления и спиновых состояниях центрального иона железа, геометрии и природы связи гем-лиганд. Функциональное назначение основных дериватов гемоглобина: окси- (НЬОв), карбокси- (НЬ(СО)4), мет-(МеШЪ) и редуцированного дезоксигемоглоби-на (НЬ) - определяется лигандом, насыщяюгцим шестую координационную связь атома железа группы гема (0г,С0,Н20) — соответственно. Связывание лиганда вызывает перераспределение электронной плотности в группе гема, изменяет магнитный момент, спиновое состояние, индуцирует оптическую активность. Электронно-конформацпонное взаимодействие формирует ха-
рактерные для каждой производной полосы поглощения в видимой области спектра в интервале длин волн от 390 до 650 нм. Последнее позволяет применить для количественного анализа основных производных гемоглобина спектрофотомет-рический метод.
Разработанный в лаборатории биофизики ОмГУ многоволновый спектрофотометрический метод [1] позволил впервые получить количественную информацию о фотопревращениях основных производных гемоглобина: окси-, дезокси-, карбокси- и метгемоглобина, соотнести ее с результатами общего анализа крови, изменением концентрации высокоспецифических клеток крови.
2. Определение газового состава гемоглобина
Методика количественного спектрофотометри-ческого анализа основана на решении системы уравнений Фирордта [2]:
п
1А (!)
¿=1
гДе 3 = 1, 2,..., ?г; п — число определяемых компонентов; г = 1, 2,..., т; т — число аналитических длин волн; е^ — молярные коэффициенты
Воздействие лазерного излучения.
33
поглощения для ] -го компонента на длине волны Лг; Сз — определяемая концентрация ]-то компонента; Ах' — оптическая плотность образца на длине волны Л^.
Выбор аналитических длин волн осуществляется с помощью методов информационных коэффициентов и линейного программирования. Для обеспечения количественного анализа создан пакет программ, реализующий методы наименьших квадратов, линейного программирования и алгебраической коррекции фона. Использование комбинации двух последних методов позволяет анализировать системы, в которых фоновое поглощение можно аппроксимировать полиномом более высокой степени, чем поглощение основного вещества. Для оценки оптимальности набора аналитических длин волн и величины погрешности анализа строится матрица информационных коэффициентов. Элементы матрицы показывают, какую долю информации несет г-ая линия поглощения при определении j-гo компонента смеси:
Rij =
(2)
Критерием правильности расчетов концентраций производных гемоглобина служит соответствие суммы концентраций производных гемоглобина, рассчитанных по данному методу, значениям общей концентрации гемоглобина в образце крови, определенным стандартным цианметгемоглоби-новым методом [3]. Коэффициент наклона аппроксимирующей прямой зависимости рассчитанной суммы концентраций производных гемоглобина [Hbt] от значения общей концентрации гемоглобина [HbCN] равен 0,997, достоверность аппроксимации - 0,987, что свидетельствует о хорошем соответствии результатов. Расчет концентраций производных гемоглобина осуществляется с использованием оригинальной компьютерной программы «HemoSpectr», разработанной для операционной системы Windows [4].
3. Методика эксперимента
Из 250 больных, обследованных в поликлинике МУЗ «МСЧ №7», выделена группа пациентов, которым в качестве дополнительного или основного лечения показана лазерная фототерапия. Для облучения использовался импульсный лазер (AJ1T), длина волны излучения 0,87-0,89 мкм, частота повторения импульсов 80, 150, 300, 600, 1500, 3000 Гц, мощность на выходе излучателя 3-6 Вт/имп. Забор крови у пациентов проводился из локтевой вены до и после облучения. Для устранения фонового поглощения производился гемолиз крови в течение одного часа при темпе-
ратуре -20 °С. Регистрация спектров поглощения производилась на спектрофотометре СФ-56 в диапазоне длин волн 510-650 им в кварцевой кювете с оптической длиной пути 0,01 см. Количественный спектрофотометрический анализ — одновременное определение концентрации основных производных гемоглобина — проводился представленным выше методом.
Общий анализ крови осуществлялся в лаборатории биофизики ОмГУ по стандартным методикам, используемым в клинических лабораториях.
4. Обсуждение результатов
Изменение спектральной зависимости оптической плотности образцов крови в зависимости от кратности облучения представлено на рис. 1.
Рис. 1. Спектры поглощения крови до и после первого (1) и третьего (2) облучения
170 165 160 155 150 145 140 135 130 125 120
I
\
\
•
\\ ♦
до 01.04. после 2004 до 05.04 после .2004 до 07.04. после .2004 до 14.04. после 2004
Рис. 2. Изменение общей концентрации гемоглобина в процессе лечения
Общая концентрация гемоглобина уменьшается (рис. 2). Этот процесс определяется двумя факторами: во-первых, фотопревращение гемоглобина в метгемоглобин происходит с образованием супероксидного иона кислорода, который, являясь вторичным радикалом, нарушает структуру и функции мембраны эритроцитов и вызывает деструкцию эритроцитов. Во-вторых, среди эритроцитов можно выделить группу клеток с пониженной резистентностью (это либо поврежденные, либо старые эритроциты), их мембраны легко разрушаются от любого внешнего воз-
34 Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур, И.А. Пилыцикова, H.A. Семиколенова, О.В. Свергунова
действия. Однако последний фактор можно рассматривать как благоприятный, так как организм человека избавляется от плохо функционирующих эритроцитов, и, таким образом, происходит обновление клеток.
Фотохимия превращений гемоглобина включает цепь последовательных реакций:
oxyHb —>MetHb, (3)
MetHb ^HHb, (4)
HHb ^>НЬСО, (5)
HbCO -^продукты фотодеструкции. (6)
Первичные фотохимические реакции сопровождаются появлением свободных радикалов в небольшом количестве, которые, в свою очередь, запускают процессы окисления биосубстратов, имеющие цепной характер. Под действием облучения оксигемоглобин окисляется в метгемогло-бин [5].
Рис. 3. Изменение содержания карбоксигемоглобина и метгемоглобина
При деструкции гемоглобина происходит разрушение белкового глобина, образуются продукты распада, содержащие свободные радикалы СО", что приводит к увеличению содержания карбоксигемоглобина в крови пациента. В то же время низкоинтенсивное лазерное излучение вызывает окисление гемоглобина до метгемоглобина, при этом происходит образование супероксидного иона кислорода (рис. 3). Накопление активного кислорода приводит к гемолизу эритроцитов вследствие нарушения резистентности эритроцитов и повреждения их мембран. Фотодеструкция эритроцитов и структуры гемоглобина вызывает уменьшение общей концентрации гемоглобина.
На рис. 4 представлена зависимость СОЭ от продолжительности лечения в течение 14 дней. К концу курса лечения наблюдается увеличение значения СОЭ из-за уменьшения вязкости крови за счет изменения структуры части белков под действием лазерного излучения. Количество
Рис. 4. Скорость оседания эритроцитов
лимфоцитов в процессе облучения остается высоким, что свидетельствует об активности фотоответа организма.
5. Выводы
1. Реакция крови при лазерном облучении патологического очага является одной из важных составляющих клинического эффекта местной био-стимуляционной фототерапии.
2. Первичные фотохимические реакции приводят к появлению свободных радикалов О-и СО -. При этом увеличивается концентрация мет- и карбоксигемоглобина.
3. Большие дозы приводят к срыву функций антиоксидантной системы и к развитию повреждения клеточных структур продуктами свобод-норадикального окисления.
[1] Владимиров Ю.А. Лазерная терапия: настоящее и будущее. Биология // Соросовский Образовательный журнал в текстовом формате, 1999. http : //www.pereplet.ru/obrazovanie/ stsoros/895. html
[2] Адамов С.А., Александрова С.А., Денисов А.Н., Мосур Е.Ю., Семиколенова Н.А. Спектрофото-метрический количественный анализ основных дериватов гемоглобина // Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 10.
[3] International Committee for Standardization in Haemotology. Recommendations for reference method for haemoglobinometry in human blood and specifications for international haemoglobinocyanide reference preparation. 3rd ed. J. Clin. Lab. HaemotoL, 1987; vol. 9, 73-79.
[4] Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ «HemoSpectr» №2001610571, Мосур Е.Ю. (Россия); ОмГУ. Заявка №2001610305 от 19.03.2001. Зарегистрировано в Реестре программ для ЭВМ 17.05.2001.
[5] Семиколенова Н.А., Мосур Е.Ю., Бескровная Е.В., Тютерев А.А. Анализ газового состава крови по спектрам поглощения // Медицинская физика. 2002. №2 (14).
